重慶地區部分水稻親本材料的抗稻瘟病基因檢測分析

摘 要 為了確定抗稻瘟病基因Pi2、Pi5、Pi9、Pi-kh在重慶地區部分水稻親本材料中的分布情況和篩選有效性，分別用Pi2、Pi5、Pi9、Pi-kh的功能分子標記對46份不同的水稻材料進行了分子標記檢測分析。結果顯示：Pi2、Pi5、Pi-kh三個抗性基因在所選材料中能擴出抗性基因的特異條帶，其中含Pi2抗性材料5份，占比10.87%；含Pi5抗性材料14份，占比30.43%；含Pi-kh抗性材料12份，占比26.09%；無材料含Pi9基因。檢測結果證實抗稻瘟病基因Pi2、Pi5、Pi-kh的功能標記對重慶地區水稻親本材料的篩選是有效的，為利用這些功能標記篩選含抗性基因的材料提供了充實的依據。

關鍵詞 水稻；親本材料；抗稻瘟病；功能標記；基因檢測

中圖分類號：S511.5 文獻標志碼：A DOI：10.19415/j.cnki.1673-890x.2017.34.005

知網出版網址：http：//kns.cnki.net/kcms/detail/50.1186.S.20171129.1622.001.html 網絡出版時間：2017/11/29 16：22：02

稻瘟病是由子囊真菌引起的一類水稻病害，其病原屬半知菌亞門真菌[1]。稻瘟病可發生在水稻秧苗期至抽穗期，苗期或者分蘗期發病嚴重時可使水稻植株死亡；穗期發病將導致白穗或半飽和穗，嚴重降低產量，甚至可造成水稻絕收，是我國主要水稻災害之一[2]。掌握雜交水稻親本的抗稻瘟病基因型，對雜交稻親本抗性的改良及通過抗病基因的合理布局達到持續有效地控制稻瘟病起至關重要作用[3]。截至2015年3月，已至少報道了69個抗稻瘟病位點共84個主效基因，其中，24個基因已被成功克隆[4]，這些抗性基因的發現與克隆為開展稻瘟病分子輔助育種提供了可能。在已克隆的抗性基因中，Pi-2[5]、Pi-9[6]的抗譜較廣，與Pi-kh[7]同被確定是西南稻區四川地區有效的抗稻瘟病基因[8]。而Pi5[9]被發現在東北稻區遼寧地區也有很寬的抗譜[10]。本文即是用已克隆的部分水稻稻瘟病抗性基因Pi2[5]、Pi5[9]、Pi9[6]、Pi-kh[7]的功能標記對近年來自選的高代水稻親本材料及部分組合進行分子標記檢測，以確定稻瘟病抗性基因在高代親本中的分布情況和篩選的有效性，為重慶地區配制多抗或廣譜抗稻瘟病雜交水稻新組合提供依據。

1材料與方法

1.1供試材料

供試材料一共46份，其中恢復系9份、保持系（不育系）32份、部分親本組合5份，均由重慶市農業科學院水稻研究所提供。

1.2水稻DNA的提取

每份材料取10粒左右種子于28 ℃恒溫氣候培養箱中進行紙床浸種催芽，發芽后1周，剪取幼嫩葉片，用改良的CTAB法[11]提取DNA作為PCR模板。

1.3PCR擴增

PCR反應體系采取TAKANA公司提供的試劑和方法進行添加，每一個反應體系為10 μL。用于檢測的稻瘟病抗性基因功能標記一共4個：Pi2、Pi5、Pi9、Pi-kh；相應引物名稱、序列和多態性片段大小見表1。使用的PCR主要程序擴增步驟依次為：第1步，94 ℃ 5 min；第2步，94 ℃ 30 s；第3步，55 ℃ 30 s；第4步，72 ℃ 1 min；第5步，72 ℃ 10 min；第6步，25 ℃ 5 min，其中第2～4步35個循環。

1.4PCR擴增產物電泳檢測

在PCR擴增產物中加入2 μL溴酚蘭指示劑，充分混勻后，用1.2%瓊脂糖凝膠于0.5×TBE緩沖液中恒壓150 V 電泳 20～30 min，取出后放入加有溴化乙錠的0.5×TBE緩沖液浸泡3～5 min，再用凝膠成像系統掃描記錄電泳結果。

2結果與分析

2.1分子標記檢測結果

抗稻瘟病基因Pi2、Pi5、Pi9、Pi-kh分子標記檢測結果如表2所示，結果初步顯示：Pi2、Pi5、Pi-kh三個抗性基因的分子標記檢測在所選材料中均擴出了抗性基因的特異條帶，材料中可能存在相應的抗性基因，而Pi9的檢測結果顯示全部為無特異條帶，理論上這些材料不存在Pi9抗性基因。對各抗性基因檢測結果具體分析如下。

1）Pi2的分子標記共檢測出含Pi2抗性材料5份，占比10.87%。其中親本恢復系材料R6037和R3925為Pi2基因純合型抗性材料，以R3925為親本的組合材料Q2A/R3925、81A/R3925、83A/R3925為含Pi2基因雜合型抗性材料，保持系材料中無此抗性。

2）Pi5的分子標記共檢測出含Pi5抗性材料14份，占比30.43%。它們是親本恢復系材料R3007、R3011、R3014、R3190，親本保持系材料128B、183B、209B、511B、614B、680B、20031B，組合材料18A/R28、蓉18A/R28、83A/R3925，其中83A/R3925為Pi5基因雜合型抗性材料，余下13份材料均為Pi5基因純合型抗性材料。

3）Pi-kh的分子標記共檢測出含Pi-kh抗性材料12份，占比26.09%。它們是親本恢復系材料R3007、R3135、R3190、R3925，親本保持系材料476B、558B、567B，組合材料18A/R28、蓉18A/R28、Q2A/R3925、81A/R3925、83A/R3925，其中R3007、R3135、R3190、R3925及567B為Pi-kh基因純合型抗性材料，余下7份材料均為Pi-kh基因雜合型抗性材料。

2.2對重慶地區水稻親本材料的篩選分析

表2的結果同時也表明，對所選46份材料，除未能檢測出Pi9抗性基因特異條帶外，其他檢測出抗性基因特異條帶的基因Pi2、Pi5、Pi-kh在親本材料間的分布也是有明顯差異的，親本材料中的抗性基因之間重合也很少。進一步的分析表明，親本恢復系材料R3925的Pi2、Pi-kh的基因型是純合的，而其所配雜交組合Q2A/R3925、81A/R3925、83A/R3925均為雜合型，說明R3925的后代中抗性基因Pi2、Pi-kh發生了等位基因分離，重新進行了遺傳重組，因此在雜交后代育種選擇中仍有必要進行目標基因的分子標記檢測篩選，否則目標抗性基因有可能因重組分離而丟失。而Pi5在83A/R3925表現為雜合型，也說明其跟Pi2、Pi-kh的遺傳特性是一樣的。這些結果表明，抗稻瘟病基因Pi2、Pi5、Pi-kh的功能標記對重慶地區水稻供試親本材料的篩選是有效的，可應用于分子標記輔助選擇育種。

3討論

功能性分子標記完全關聯基因的功能性基序，直接反映目標性狀表現，在應用上比傳統的基因連鎖分子標記更具有優越性[14]。本研究所用的稻瘟病抗性基因Pi2、Pi5、Pi9、Pi-kh的分子標記均為功能性分子標記，表現出共顯性、差異大、特異性較強的特性，檢測結果準確可靠，其中Pi2、Pi5、Pi9在水稻育種上已應用于親本材料稻瘟病抗性基因的聚合[12]，應用前景廣泛。

在本次研究中，抗稻瘟病基因Pi2、Pi5、Pi-kh在重慶地區的親本材料檢測中均表現出了很好的多態性，帶型清晰，辨識度高，充分證實其篩選是有效的，為大規模利用這些功能標記檢測篩選含抗性基因材料提供了充實的依據。同時也發現，含單個抗稻瘟病基因的材料占比均較小，尤其是在供試材料中沒有發現含Pi9材料，故應加強收集或引進抗源材料。而Pi2在親本材料中僅在恢復系R3925與R6037中發現，這兩個親本可作為含Pi2的重點材料進行選擇應用。Pi5和Pi-kh在保持系和恢復系都有分布，可選擇的材料相對較多，在配制組合時可更多地考慮其他優良農藝性狀。但是，單個主效抗稻瘟病基因的抗譜都是有限的，在每個稻區稻瘟病抗性表現難以持久穩定，因此，將多個單個抗瘟基因進行聚合，在親本中形成抗性互補，提高雜交組合的水平抗性乃是抗瘟育種的趨勢所在。

參考文獻：

[1]范懷忠.植物病理學[M].北京：中國農業出版社，2003：71-78.

[2]柏斌，吳俊，周波，等.稻瘟病抗性分子育種研究綜述[J].雜交水稻，2012，27（3）：5-9.

[3]馮慧，楊成明，吳孝波，等.四川省雜交稻親本及32 份抗源抗稻瘟病基因的檢測分析[J].西南農業學報，2013，26（3）：987-993.

[4]國家水稻數據中心.稻瘟病主效抗性基因列表[DB/OL].2012-06-20[2015-3-30].http：// www.ricedata.cn/gene/gene_pi.htm.

[5]Zhou B， Qu S， Liu G， et al. The eight a mino-acid differences within three leucine-rich repeats between Pi2 and Piz-t resistance proteins deter mine the resistance specificity to Magnaporthe grisea[J]. Molecular Plant-microbe Interactions，2006，19 （11）：1216-1228.

[6]Qu S， Liu G， Zhou B， et al. The broad-spectrum blast resistance gene Pi9 encodes a nucleotide-binding site-leucine-rich repeat protein and is a member of a multigene family in rice[J].Genetics，2006，172（3）：1901-1914.

[7]Sharma T R， Madhav M S， Singh B K，et al. High-resolution mapping，cloning and molecular characterization of the Pi-kh gene of rice，which confers resistance to Magnaporthe grisea[J].Molecular Genetics and Genomics，2005，274（6）：569-578.

[8]張雪梅.四川省主栽品種抗瘟性評價和內恢99-14 抗瘟性遺傳分析[D].成都：四川農業大學，2011.

[9]Lee S K， Song M Y， Seo Y S， et al. Rice Pi5-mediated resistance to Magnaporthe oryzae requires the presence of two coiledcoil-nucleotide-binding-leucine-rich repeat genes[J]. Genetics，2009，181（4）：1627-1638.

[10]鄭文靜，叢玲，王妍，等.抗稻瘟病基因Pi5檢測標簽的設計及驗證[J].西南大學學報（自然科學版），2014，36（9）：15-22.

[11]Murray M G， Thompson W F. Rapid isolation of high molecular weight plant DNA[J]. Nucl Acid Res，1980，8（19）：4321-4325.

[12]高利軍，高漢亮，顏群，等.4個抗稻瘟病基因分子標記的建立及在水稻親本中的分布[C]//中國科技部，中國農業部，湖南省人民政府.第1 屆中國雜交水稻大會論文集.長沙：雜交水稻編輯部，2009：294-298.

[13]Ramkumar G， Srinivasarao K， Madhan Mohan K， et al. Development and validation of functional marker targeting an InDel in the major rice blast disease resistance gene Pi54 （Pikh）[J]. Molecular Breeding，2011，27（1）：129-135.

[14]徐未未，王興，黃永相，等.水稻抗稻瘟病基因的分子標記與標記輔助育種研究進展[J].江蘇農業學報，2013，29（4）：898-906.

（責任編輯：丁志祥）