運用PCR—DGGE法鑒定垃圾填埋場土壤細菌

摘 要 2016年4月，從四川省南充市嘉陵區貓兒山垃圾填埋場采集土壤樣品，運用PCR-DGGE法鑒定垃圾填埋場的土壤細菌。結果表明：DGGE指紋圖譜中條帶數較少，比較之后選擇鑒定Band 1。將Band 1的測序結果與GenBank數據庫中已有的土壤細菌進行BLAST比對，序列相似性為84%，鑒定出Band 1所代表的不可培養細菌屬于酸桿菌門，并根據鑒定結果做出進化樹。

關鍵詞 PCR-DGGE；垃圾填埋場；鑒定；土壤細菌；酸桿菌

中圖分類號：Q939.96 文獻標志碼：A DOI：10.19415/j.cnki.1673-890x.2017.28.011

知網出版網址：http：//kns.cnki.net/kcms/detail/50.1186.S.20171011.1343.002.html 網絡出版時間：2017/10/11 13：43：26

隨著環境污染的日益加重，生活中所產生的垃圾降解問題也越來越引起人們的重視。近年來，無污染、耗能小且效率高的生物修復逐漸成為研究熱點。通過試驗來摸索微生物降解垃圾最優的條件和關鍵影響因素，從而制備出高效微生物降解菌劑，使得環境垃圾的降解效果達到更好[1]。

1材料與方法

1.1材料與試劑

本研究所用土壤樣品于2016年4月采自四川省南充市嘉陵區貓兒山垃圾填埋場。選擇具有代表性的土壤采樣區，在采樣區內按照上、中、下坡的地勢設置6個采樣點，采用五點取樣法采集土壤表層（0～10 cm）樣品，用無菌手套采完土樣后立即裝入已滅菌的封口聚乙烯袋，按1～6號順序編號后放入冰盒中保存。其中1， 2號為上坡土樣，3， 4號為中坡土樣，5， 6號為下坡土樣。采樣完成后立即運回實驗室，放入-80℃冰箱保存，用于后續土壤細菌的測定。土壤基因組DNA提取試劑盒購于天根生化科技（北京）有限公司；PCR擴增引物、PCR擴增酶和Molecular Probes SYBR? Green I 核酸凝膠染料均購于Thermo Scientific。

1.2試驗方法

1.2.1 土壤細菌總DNA提取

采用從北京天根生化科技有限公司購買的土壤基因組DNA提取試劑盒進行垃圾填埋場土壤細菌DNA的提取。

1.2.2 16S rDNA（V6～V8區）PCR擴增

本研究采用如下的細菌通用引物。

954f-GC：

5′-GCACAAGCGGTGGAGCATGTGG-3′；

1369r：

5′-GCCCGGGAACGTATTCACCG-3′。

下游試驗為DGGE電泳時，需要在上游引物954f的5′端加一段長度為40 bp的GC夾（CGCCCGCCGCGCCCCGCGCCCGGCCCGCCGCCCCCGCCCC）。反應體系為50 μL： Mix 25 μL，前引物 1 μL，后引物 1 μL，模板DNA 2 μL，純水21 μL。反應條件為：94℃ 5 min；94℃ 30 s，61～56℃ 30 s，72℃ 1 min，10個循環，每個循環降低0.5℃；94℃ 30 s，56℃ 30 s，72℃ 1 min，25個循環；72℃ 10 min；4℃ forever[2]。PCR擴增結束后，采用0.8%瓊脂糖凝膠對所得的PCR產物進行電泳檢測，電泳條件為120 V、30 min。

1.2.3 變性梯度凝膠電泳（DGGE）及圖像分析

采用DcodeTM Universal Mutation Detection System對PCR產物進行分離。DGGE所采用的聚丙烯酰胺凝膠濃度為8%，變性范圍為40%～60%，上樣量為每孔20 μL，60℃、85 V電泳11 h。電泳結束后，用經超純水稀釋后的SYBR? Green I核酸凝膠染料（質量比

10 000∶1）染色45 min。使用Chemi Doc XRS+化學發光凝膠成像系統進行拍照。

1.2.4 DGGE優勢條帶測序分析

選取優勢條帶并用無菌手術刀片切割下來，浸泡于50 μL超純水中，置于4℃冰箱充分浸泡凝膠直至DNA產物浸出。以1 μL浸提液作為模板再次進行PCR擴增，上游引物954f不含發夾結構，下游引物1369r、PCR 反應體系和反應條件不變，擴增產物做DGGE電泳確認回收片段的正確性。得到的PCR產物經DNA純化回收試劑盒純化后與克隆載體相連接，送北京金諾銳杰基因科技有限公司進行雙向測序。將拼接后的測序結果在NCBI- Nucleotid BLAST中進行比對分析，找出與之同源性較高的序列。將16S rDNA序列上傳到 NCBI數據庫中，申請后得到登錄號為KY436035。

2結果與分析

2.1土壤樣品16S rDNA（V6～V8區）PCR擴增分析

土壤細菌的16S rDNA（V6～V8區）的擴增片段長度在500 bp左右（如圖1）。所得到的目的片段特異性好，無雜帶產生，能夠滿足下一步DGGE電泳的要求。

2.2DGGE圖譜及優勢條帶測序分析

2.2.1 DGGE圖譜分析

DGGE圖譜中，泳道中的條帶即代表土壤中的細菌種類，亮暗差異則代表細菌數量的多少[2]。從圖2可以看出，DGGE指紋圖譜中條帶數較少，比較之后選擇鑒定Band 1。

2.2.2 DGGE優勢條帶測序結果分析

將Band 1的測序結果與GenBank數據庫中已有的土壤細菌進行BLAST比對，序列相似性為84%，鑒定出Band 1所代表的不可培養細菌屬于酸桿菌門，并根據鑒定結果做出進化樹（見表1、圖3）。

3討論

吳昊等研究了活性污泥中微生物對生活垃圾的降解，結果表明：活性污泥中的微生物是降解生活垃圾的主體，它可以將生活垃圾中的復雜有機物降解為簡單的有機物，然后在一定的條件下，將簡單的有機物轉變成無機物，從而達到降解的目的[3]。酸桿菌廣泛存在于自然界，在許多生態系統中發揮重要作用[4]。此次檢測到貓兒山垃圾填埋場酸桿菌的存在，帶給我們一些信息。酸桿菌大多是嗜酸菌，所以其生存環境應該是呈酸性的，說明該區域土壤呈酸性。目前國內外基于酸桿菌門的研究很少，鮮有酸桿菌的專屬研究報告。建議進一步研究該垃圾填埋場的土壤中，除了酸桿菌以外還有何種微生物能夠起到降解生活垃圾的作用。

參考文獻：

[1]朱欣潔.落地原油污染土壤修復微生物菌劑開發研究[D].陜西西安：西安工程大學，2016.

[2]唐杰，徐青銳，王立明，等.若爾蓋高原濕地不同退化階段的土壤細菌群落多樣性[J].微生物學通報，2011，38（5）：677-686.

[3]吳昊，喬德陽，徐惠彬，等.活性污泥中微生物降解生活垃圾的探討[J].中國資源綜合利用，2007，25（10）：36-37.

[4]王春香，田寶玉，呂睿瑞，等.西雙版納地區熱帶雨林土壤酸桿菌群體結構和多樣性分析[J].微生物學通報，2010，37（1）：24-29.

（責任編輯：丁志祥）