沈撫灌渠底泥石油降解菌株“ODF—3”的篩選和鑒定

摘 要 從沈撫污灌渠三寶屯附近采集長期被石油嚴重污染的底泥樣品，以原油為唯一碳源，采用富集培養、平板涂布、平板劃線等方法，篩選得到9株石油降解菌，其中4株為細菌、5株為真菌；通過形態學觀察和18S rDNA序列比對分析，對其中1株真菌菌株（ODF-3）進行鑒定，確定其為煙曲霉（Aspergillus sp.），與模式種Aspergillus fumigatus的相似度為99%。將菌株在偏酸環境中培養2 d后投放使用，其穩定性與降解速率最好。

關鍵詞 污灌渠底泥；石油降解菌；篩選；鑒定；煙曲霉

中圖分類號：X53 文獻標志碼：A DOI：10.19415/j.cnki.1673-890x.2017.13.018

知網出版網址：http：//kns.cnki.net/kcms/detail/50.1186.s.20170508.2146.017.html 網絡出版時間：2017-5-8 21：46：00

沈撫灌區位于遼寧省沈陽和撫順兩市的近郊區，該污水灌渠作為國內最早建設的污水灌渠至今已運行幾十年，雖然灌渠曾經為農業灌溉發揮過作用，但所造成的地下水污染和農作物的污染，給人居環境造成的影響和危害是極大的[1]。其上游和中游地區從 20 世紀 40 年代末就已經開始接受主要來自撫順石油二廠的污水灌溉。隨著工業的迅猛發展和人口的增加，大量超標污水未經處理長年直接排入灌渠中，導致灌渠內水質日趨惡化，灌區土壤中芳烴、揮發酚、重金屬等污染物嚴重超標，土壤通透性下降，肥力減低，土壤（尤其是底泥）微生物種群發生了很大改變（有較多的嗜油菌），灌區土壤生態系統的結構與功能被嚴重破壞[2]。由于生物降解法具有獨特的優越性，利用微生物降解烴類物質的能力來消除石油污染已經越來越受到人們的重視[3]。探明沈撫灌區這樣一個特殊環境下微生物種群的組成結構，開展與土壤生物修復有關的基礎性研究以及提出具有經濟效益的污染防治措施，具有重要的理論和實踐研究價值[4]。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1 污灌底泥

2014年10月底2015年3月初，于遼寧省撫順市沈撫灌渠三寶屯附近用采泥器取污灌渠底泥，規定距離處分東西南北4個方位分別用采樣工具采集0～20 cm的地面土，采集后混合均勻，將樣品立即帶回實驗室，置于4℃保存備用[4]。

1.1.2 原油

由撫順石油二廠提供。

1.1.3 儀器與試劑

1.1.3.1儀器

實驗中所用的主要儀器列于表1。

1.1.3.2試劑

真菌基因組DNA快速抽提試劑盒：生工生物（上海）股份有限公司。

PCR擴增試劑盒：生工生物（上海）股份有限公司。

18S rDNA序列擴增引物：生工生物（上海）股份有限公司合成。

1.1.4 培養基

1.1.4.1富集培養基

將污灌底泥樣品1 g分別加入100 mL牛肉膏蛋白胨培養基、100 mL馬鈴薯培養基中制備成富集培養基。

1.1.4.2石油平板培養基

無機鹽培養基：MgSO4·7H2O 0.5 g、CaCl2 0.02 g、KH2PO4 1.0 g、NH4NO3 1.0 g、FeCl3 0.05 g、瓊脂20 g，原油適量，pH值調至7.0。

1.1.4.3馬鈴薯液體培養基（PDA培養基）

馬鈴薯 200 g，葡萄糖20 g，水1 000 mL，pH值自然。

1.1.4.4牛肉膏蛋白胨液體培養基

牛肉膏 3 g、蛋白胨10 g、NaCl 5 g、水1 000 mL，pH值7.0～8.0。

1.2方法

1.2.1 石油降解菌的富集、分離、純化

分別在含有污灌底泥的富集牛肉膏蛋白胨液體培養基、馬鈴薯液體培養基中，接入底泥懸浮液，于37℃、24℃，120 rpm搖床培養1周；然后，取一定量的上述富集培養液接入100 mL新鮮富集培養液中，再次于37℃、24℃，120 rpm搖床培養1周。采用稀釋平板法分離石油降解菌[5]。將富集培養液按10倍稀釋法稀釋，取10-4～10-6倍培養液各0.1 mL涂布于含油固體培養基上，置于37℃、24℃恒溫培養箱內培養，每個濃度設3個重復。恒溫培養24 h后，觀察菌株生長情況。待平板上長出菌落時，選取具有優勢、不同顏色及形態的單菌落，在油平板上多次劃線分離純化，以得到形態一致的單菌落。將純化菌株接種于試管斜面培養基后保存于4℃冰箱。

1.2.2 石油降解真菌ODF-3菌株的形態學觀察

菌落形態觀察：將石油降解真菌ODF-3接種于PDA平板上，25℃條件下，倒置培養數天，觀察記錄菌株的生長速度，菌落形態，有無同心螺紋，是否有色素產生等。用平皿插片法觀察菌株的顯微形態特征[6]。

菌絲形態觀察：將石油降解真菌ODF-3接種于PDA平板上，插片，置25℃恒溫箱中培養數天，取出用光學顯微鏡觀察菌絲大小、形狀、表面特征以及是否有隔，是否有孢子以及孢子大小、形狀、類型、顏色等。參照戴芳滿的《中國真菌總匯》和魏景超的《真菌鑒定手冊》對石油降解真菌ODF-3進行形態學的分類鑒定[6]。

1.2.3 分子生物學鑒定

采用真菌基因組DNA提取試劑盒提取基因組DNA作為PCR模版[4]。以18S-ITS1：5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′和18S-ITS4：5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′為引物進行擴增[7]。PCR產物的純化和測定由生工生物（上海）股份有限公司完成。PCR反應體系見表2，反應條件見表3。將測得的18S rDNA序列在GenBank中進行BLAST分析，根據序列同源性確定菌種[8-10]，構建系統進化樹。

1.2.4 石油降解真菌ODF-3的系統發育分析

用Mega 6.0對測得的序列和相關參考序列進行系統發育樹的構建，以及系統進化分析[8-9]。

1.2.5 石油降解真菌ODF-3菌株的生物學物性研究

1.2.5.1菌株的活化

將保藏狀態的石油降解真菌ODF-3菌株放入適宜的培養基中培養。用移液管移取0.3～0.4 mL冷藏菌液滴入無菌水中輕輕震蕩，溶解成懸浮狀液體。再取出0.2 mL菌懸液轉接于PDA培養基斜面，將剩余的菌液注入PDB培養基中，在25℃、135 rpm的恒溫培養箱中震蕩3 d后，備用[10]。

1.2.5.2菌株的生長曲線測定

將已經活化的石油降解真菌ODF-3菌液接種到已滅菌的PDB培養基中，置25℃、135 rpm的培養箱中培養，在0， 6， 12， 18， 24， 30， 42， 54， 66， 78， 80， 92 h分別取3瓶菌液進行過濾，105℃或100℃烘干至恒重，測定其干重并記錄數據[11]。

1.2.5.3菌株的初始pH值測定

配制pH值分別為3， 4， 5， 6， 7， 8， 9的7組PDB培養基，將已活化好的石油降解真菌ODF-3菌液分別接種其中，每組3瓶；于25℃、135 rpm的恒溫培養箱中震蕩60 h，取出后進行過濾，105℃或100℃烘干至恒重，測定其干重并記錄數據[11-12]。

2結果與分析

2.1石油降解菌的篩選結果

經過富集、純化，共篩選到4株細菌，5株真菌，分別命名為ODB-1、ODB-2、ODB-3、ODB-4和ODF-1、ODF-2、OD-F3、ODF-4、ODF-5。

2.2石油降解真菌ODF-3菌株的形態學觀察

石油降解真菌ODF-3菌株的顯微形態見圖1。ODF-3菌株菌落初呈白色，后菌落正面產生孢子后呈褐色。在光學顯微鏡下菌絲無色，分枝，有橫隔。

2.3石油降解真菌ODF-3菌株的分子鑒定結果

2.4石油降解真菌ODF-3菌株的生物學特性

2.4.1 石油降解真菌ODF-3菌株生長曲線

石油降解真菌ODF-3菌株的生長曲線見圖3。由圖3可見，0～24 h為菌株生長的適應期（又稱停滯期、調整期），在這個時間內菌絲細胞干重（生物量）基本不增加或增加非常緩慢；24～84 h為為菌株生長的指數增長期，在該時期菌株的生長繁殖速度很快，活菌的數目呈對數增長，當培養時間達84 h左右時，菌絲細胞干重（生物量）達最大值；84～154 h為菌株生長的穩定期（又稱恒定期或最高生長期），即菌絲細胞干重（生物量）不再繼續增加，保持平衡，這是由于此階段營養物尤其是生長限制因子耗盡、營養物的比例失調，酸、醇、毒素或H2O2等有害代謝產物累積，pH值、氧化還原等物化條件越來越不適宜，使得在此階段的細胞分裂間隔時間延長，曲線上升開始緩慢，隨后部分細胞停止分裂，少數細胞開始死亡，致使新生細胞與死亡細胞處于動態平衡狀態；154 h后，菌株生長進入衰亡期，在此時期菌絲細胞干重（生物量）減少，呈現出負生長趨勢，這主要是由于外界環境對繼續生長越來越不利，從而引起細胞內的分解代謝大大超過合成代謝，繼而導致菌體死亡。

2.4.2 初始 pH值對石油降解真菌ODF-3菌株生長的影響

培養基的初始pH值對石油降解真菌ODF-3菌株生長的影響見圖4。由圖4可見，ODF-3菌株生長的初始最佳pH值為6左右，中性偏酸比偏堿的生長環境更適合石油降解真菌ODF-3菌株的生長。

3結論與討論

本試驗選用石油烴為培養基的唯一碳源，采用連續富集篩選的方法，共得到9株可降解石油的菌株，經過形態學觀察和18S rDNA序列分析，鑒定其中石油降解真菌ODF-3菌株為煙曲霉，可考慮選擇該菌株作為油廢水生物處理的石油降解菌。

通過對ODF-3菌株生長曲線的測定得知，ODF-3菌株在培養24 h后進入對數生長期，在84 h后進入穩定生長期，在154 h后進入生長衰亡期；ODF-3菌株的初始最佳pH值為6左右，且偏酸的生長環境比偏堿的生長環境更適合菌株生長。由此顯示，將菌株在偏酸環境中培養2 d后投放使用，其穩定性與降解速率最好。

通過本試驗發現，被石油污染的污灌渠底泥中潛藏著較為豐富的“土著”石油降解菌，分離篩選這些微生物并對其進行深入研究，可為進一步開發石油降解菌資源和開展石油污染的生物修復工作提供一定的實驗依據。

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（責任編輯：丁志祥）