基于Arrhenius方程外推預測降酚菌劑有效期

馬 杰，張學雷

（黃河三角洲京博化工研究院有限公司，山東濱州 256600）

基于Arrhenius方程外推預測降酚菌劑有效期

馬 杰，張學雷

（黃河三角洲京博化工研究院有限公司，山東濱州 256600）

基于Arrhenius方程設計實驗對自制降酚菌劑進行了有效期測定，以菌劑降酚速率為指標，設定最低降酚速率為300mg/（L?d）以下時菌劑失效，將菌劑在極端保存條件下測定了菌劑的保存時間。通過Arrhenius方程建立lnk與1/t的線性關系，從而外推室溫（25℃）下k的數值，代入一級動力學公式，從而得到菌劑在室溫下的有效期為13個月。該結果與長期穩定實驗結論一致。

Arrhenius方程；降酚速率；一級動力學公式

Arrhenius方程是由瑞典物理化學家ArrheniusS.A.提出的，體現了化學反應速率與溫度之間的關系[1-3]，常用于藥品等保存期限的測定。林進等采用揮發性鹽基氮變化速率常數（k）與貯藏溫度（T）之間的 Arrhenius 方程，得到真空包裝的即食南美白對蝦在20℃和25℃條件下保藏的理論貨架壽命分別為151.8d和96.5d[4]。高煒斌等以Arrhenius方程為理論基礎，對聚碳酸酯的貯存壽命進行了研究，并得到聚碳酸酯在成都地區大氣自然環境中的貯存壽命理論貯存壽命值，該值與其真實大氣自然環境貯存壽命值相近[5]。

本文基于Arrhenius方程和一級動力學公式，通過對自制降酚菌劑不同溫度下降酚速率的測定，從而外推出菌劑保存有效期。

1 實驗原理[6-9]

降酚菌劑的保存有效期與菌種、保存條件、苯酚降解速率有關，當菌種、保存條件一定的情況下，菌劑保存有效期僅與苯酚降解速率有關。而苯酚的降解速率與菌劑比生長速率呈現一致性。故當苯酚作為唯一碳源時，苯酚的降解速率可以根據Monod方程進行判斷。

根據Monod方程，細胞的比生長速率與限制性基質濃度的關系可用下式表示，其中為比生長速率（h-1）；為最大比生長速率（h-1）；S為限制性基質濃度（g/L）；Ks為飽和常數（g/L）。

而當底物濃度較小時，微生物生長受到營養物質限制，處于靜止生長期，微生物增長速率和底物濃度成正比例。

故比生長速率與限制性基質濃度成一級反應，即苯酚降解速率與苯酚濃度呈一級反應，即符合。

分離變量，積分得：

其中C0為每批的初始降酚速率，Ct為樣品保存t天后該批的降酚速率，t為保存時間，k為苯酚降解速率。

（1）式可改寫為

參照反應方程，保存溫度對降酚菌劑降酚速率的影響應遵循阿倫尼烏斯為程：

其中k為苯酚降解速率，T為絕對溫度，A、B為兩個經驗常數。

從（3）式可以看出，苯酚降解速率的對數lnk與絕對溫度的倒數1/T呈線性關系。根據（2）式測定出不同溫度對應的k值，在根據（3）式作lnk～1/T，即可求出（3）式中A、B值，然后反過來根據（3）式計算出室溫（25℃）下的k值，由該k值代入（1）式則得出室溫下菌劑保存的有效時間。

2 實驗部分

2.1 實驗材料

實驗菌劑：自制降酚菌劑。

實驗儀器：KBF115 恒溫恒濕箱、搖床、分析天平、250mL三角瓶、100mL量筒。

降酚速率評價培養基：NH4NO31.0 g/L，K2HPO40.5 g/L，KH2PO40.5 g/L，CaCl20.1 g/L，NaCl 0.2 g/L，MgSO40.1 g/L，MnSO40.01 g/L，FeSO40.01 g/L，苯酚800mg/L。

2.2 實驗方法

2.2.1 一級反應驗證實驗

取存放于25℃室溫下的降酚菌劑，配制200～600mg/L不同初始苯酚濃度降酚速率評價培養基，并按照1∶100接入活化好的降酚菌劑，每1h測定一次揮發酚濃度，直至降解至初始揮發酚濃度的一半，得到t1/2。同時做三組平行，取平均值計算。

2.2.2 初始降酚量C0的檢測

實驗初期需檢測菌劑的最大初始降酚量C0，設定揮發酚濃度為1 300mg/L，1 200mg/L，1 100mg/L，900mg/L，700mg/ L的五個梯度降酚速率評價培養基，分別編號1、2、3、4、5，每個濃度下做三個平行實驗。將活化好的菌劑按照1∶100的量接入，每24h測定溶液剩余揮發酚濃度。

2.2.3 保存期限的測定

設定菌劑降解苯酚在保存第t天后其降酚速率為300mg/（L?d），當降酚速率小于300mg/（L?d）時菌劑失效。

由于絕大多數微生物對高溫耐受程度低，高于60℃時大多數死亡。而保存溫度過低導致實驗時間過長，不利于評價。故設定實驗溫度為60℃、55℃、50℃。

取保存固定好的降酚菌粉10g，存放于溫度為（60±1）℃的恒溫恒濕箱內24h。取恒溫恒濕箱內菌劑按照1∶100的量接入含酚量為600mg/L的降酚速率評價培養基，并做三組平行實驗，搖床28℃，170r/min下培養1d，測定培養后剩余揮發酚濃度；按照上述方法分別檢測恒溫箱內保存48～144h的菌劑在24h內的降酚速率，并記錄。

按照上述方法分別測定（50±1）℃、（55±1）℃下的保存天數。

2.2.4 菌劑保存穩定性實驗

取存放于室溫（25℃）條件下不同批次的降酚菌劑10g，每1個月將活化好的菌劑按照1∶100的量接入含酚量為600mg/L的降酚速率評價培養基，搖床28℃，170r/min下培養1d，測定培養后剩余揮發酚濃度。后期每半個月測定一次。

3 實驗結論

3.1 一級反應驗證實驗

表1 25℃下初始揮發酚濃度與t1/2關系表

由表1知，t1/2與初始的揮發酚濃度無關系，符合一級反應半衰期與反應物濃度無關的特征，故該反應為一級反應。

3.2 初始降酚量C0的檢測

由圖1可知菌劑在常溫下初始降酚速率在1 200mg/L，高于1 200mg/L菌劑在24h內不能有效的降解苯酚，而低于1 200mg/L菌劑在24h內均能降解完全，故C0為1 200mg/L；

圖1 初始降酚量C0的測定圖

3.3 保存天數t的測定

由表2可以明顯的得出菌劑在分別在60℃下保存有效期t為8d，55℃下保存有效期t為15d，50℃下保存有效期t為22d。

表2 不同溫度下降酚速率與時間關系表

根據以上結論，將以測得的Ct以及t代入公式K=（1/t）× ln（C0/Ct）計算出不同溫度下的k值，如表3：

表3 lnK與1/T的計算

根據以上數據表中的lnk對1/T作圖可知lnk=-10 876/T+ 30.85（R2=0.9782），符合Arrhenius方程lnk=A+B/T，代入T= 298K，從而得出k25℃的值為0.003 529。將該值代入式（2），得出t為393d，約為13個月。

3.4 菌劑保存穩定性實驗

根據長期穩定實驗結論可知該降酚菌劑有效期為13個月（見圖2），與加速實驗法結論一致。

圖2 長期穩定實驗降酚速率曲線

4 討論

傳統的室溫留樣觀察法雖然客觀反應實際情況但需要時間太長，該方法基于Arrhenius方程，在極端保存條件下快速、相對準確的測定了菌劑的室溫保存時間，可作為該菌劑有效期的測定使用。

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[2] Klemen Naver?nik，Rok Jurei，等.Humidity-corrected Arrhenius equation：The reference condition approach[J].International Journal of Pharmaceutics，2016，01.047.

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Arrhenius Equation Extrapolation of Phenol is Valid based on Agent

Ma Jie，Zhang Xue-lei

The phenol degrading bacteria on the determination of the validity of self-made experimental design based on Arrhenius equation，the microbial degradation rate as the index，set the minimum degradation rate was 300mg/（L-D）agent failure when the agents in the extreme conditions will be determined inoculum preservation time.The linear relationship between the establishment of lnK and 1/T by Arrhenius equation，push from outside the room temperature（25 DEG C）value of K，then a first-order formula，so as to obtain the effective agent at room temperature for 13 months.The results are consistent with the results of long-term stability experiments.

Arrhenius equation；phenol reduction rate；first order kinetic equation

X172

B

1003-6490（2017）01-0135-02

2017-01-21

馬杰（1983—），女，山東濱州人，工程師，主要研究方向為環境工程。