超聲波輔助用乙醇、乙酸乙酯和水的混合溶劑提取竹葉黃酮的工藝研究

朱萬強，馬周建

（遵義師范學院a.化學化工學院；b.黔北特色資源應用研究實驗室，貴州遵義563006）

超聲波輔助用乙醇、乙酸乙酯和水的混合溶劑提取竹葉黃酮的工藝研究

朱萬強，馬周建

（遵義師范學院a.化學化工學院；b.黔北特色資源應用研究實驗室，貴州遵義563006）

以蘆丁為標準品，以赤水河流域的竹葉為研究對象，用超聲波輔助乙醇、乙酸乙酯和水的混合溶液對竹葉黃酮的提取進行了研究。以乙醇、乙酸乙酯和水的混合比例、超聲時間、超聲次數、固液比為主要因素進行L9(34)正交試驗，結果表明黃酮的最佳提取工藝為：80%乙醇+15mL乙酸乙酯的混合溶液，超聲時間25min，超聲次數4次，料液比1:35，并對赤水河流域的7種竹葉進行了黃酮含量的測定。

赤水河流域；超聲提取；竹葉；黃酮

貴州素有“竹子之鄉”的美稱，貴州遵義北部的赤水河流域，有著亞熱帶濕潤季風的地理氣候，盛產竹子，擁有豐富的竹類資源。可農民砍伐了竹子后，竹葉、竹枝任其自然腐爛，造成了自然資源的嚴重浪費。竹葉中的黃酮類物質具有結構穩定、難降解、可以直接進入人體病灶部位、親水性很強等優點[1]，在調節血脂[2]、抗脂質過氧化、消除自由基[3]、抗應激和抗疲勞等方面有著顯著的生物活性。與銀杏黃酮相比，竹葉黃酮有更好的藥理活性和低毒性[4]，資源更為豐富，且竹葉的收購成本更低。

竹葉黃酮是多種黃酮的混合物，它們的極性大小也各不相同。竹葉黃酮的提取研究基本分為：微波浸提法[5]、CO2超臨界流體萃取法[6]、酶法提取[7]，甲醇、乙醇、熱水浸提法[8]等。黃酮類化合物的溶解度因結構及存在狀態不同有很大差異[9]。針對極性不同的黃酮，應選用極性不同的溶劑來提取。近年來，有許多超聲波結合溶劑的提取方法，但在超聲波結合溶劑提取法中，大多是超聲波結合一種溶劑或兩種溶劑來提取[10,11]。作者曾報道在超聲波輔助下用乙醇-水混合溶劑提取竹葉黃酮的工藝研究[12]。混合乙酸乙酯溶劑的極性比水和乙醇小，有利于提取竹葉中極性較小的黃酮。本文對超聲波結合乙醇、乙酸乙酯、水混合溶劑提取竹葉黃酮進行了研究，希望能對進一步開發竹葉資源提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

竹葉（赤水河流域），用自來水清洗干凈，晾干后置于80℃的烘箱中烘30min，烘干后的竹葉經粉碎機粉碎，過90目篩，放置于棕色試劑瓶中密封待用。

蘆丁，上海如吉生物科技公司；乙醇、乙酸乙酯、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉，以上藥品均為分析純。

1.2 實驗器材

202-O型臺式干燥箱，北京市永光明醫療儀器廠；晟喜牌CX-200型高速多功能粉碎機，上海緣沃工貿有限公司；TB-214型電子天平，北京賽多利斯儀器有限公司；SG-5200HD型雙頻超聲波清洗器，上海冠特超聲儀器有限公司；722S型可見分光廣度計，上海菁華科技儀器有限公司。

1.3 提取方法

1.3.1 竹葉提取液的制備

精確稱取制備好的竹葉粉末1.000g，加入一定比例的乙醇、乙酸乙酯和水的混合溶液，在特定的條件下超聲提取，過濾，用70%乙醇+15mL乙酸乙酯的混合溶液定容在50mL的容量瓶中。

1.3.2 黃酮的測定方法

取1.00mL提取液至50mL容量瓶中，加入70%乙醇+15mL乙酸乙酯混合溶液至12.5mL，搖勻，加入0.35mL質量濃度5%的NaNO2溶液，搖勻，靜置5min，加入0.35mL質量濃度10%的Al(NO3)3溶液，搖勻，靜置6min，加入2.5mL1mol/L的NaOH溶液，搖勻，定容，靜置10min后，在吸收波長處測其吸光度，再由蘆丁為標準品的線性回歸方程計算出溶液中黃酮類物質的含量[13]。

1.3.3 繪制蘆丁標準曲線

用電子天平精確稱取蘆丁標準樣品0.0096g，用70%乙醇+15mL乙酸乙酯混合溶液溶解并定容于50mL的容量瓶中，搖勻即得質量濃度為0.192g/L的標準溶液。

有關文獻報道，蘆丁在紫外光區和可見光區都有吸收，在紫外光區的吸收波長是370nm[14]，在可見光區的吸收波長為420nm[15]、510nm[16]，為此，本文對蘆丁標準溶液的吸收波長進行了重新測定。

準確吸取1.0mL上述配制好的蘆丁標準液至25mL容量瓶中，加入70%乙醇+15mL乙酸乙酯混合溶液至12.5mL，搖勻，加入0.35mL質量濃度5%的NaNO2溶液，搖勻，靜置5min，加入0.35mL質量濃度10%的Al(NO3)3溶液，搖勻，靜置6min，加入2.5mL 1mol/L的 NaOH溶液，搖勻，定容，靜置10min。以空白試劑為參比溶液，在340～450nm之間測定樣品溶液的吸光度，結果表明蘆丁標準溶液的最大吸收長為360nm。

準確移取0.5、1.0、1.5、2.0、2.5mL蘆丁標準液于25mL容量瓶中，按上述方法配制溶液，在360nm處測定各樣品的吸光度，最后以濃度C(mg/mL)為橫坐標、吸光度A為縱坐標進行線性回歸，結果見圖1。

圖1 蘆丁標準曲線圖

由圖1可知，該曲線線性關系很好，標準曲線方程y=45.298x+0.0098，相關系數R2=0.9989，蘆丁濃度線性范圍0～0.0192g/L。

2 對黃酮提取工藝的研究

本文采用超聲波輔助乙醇、乙酸乙酯和水的混合溶液來提取竹葉黃酮。為了減少實驗的影響因素和實驗次數，本文將超聲儀器功率和頻率固定為100%、59KHZ。因此，實驗的主要影響因素為：固液比、超聲時間、超聲次數及乙醇、乙酸乙酯、水的比例。

2.1 單因素對竹葉中黃酮提取效率的影響

（1）提取劑的影響

準確稱取4份苦竹葉粉末，每份1.0000g。固定固液比為1:25，在其他條件一致的前提下，分別用50%乙醇+15mL乙酸乙酯、60%乙醇+15mL乙酸乙酯、70%乙醇+15mL乙酸乙酯、80%乙醇+15mL乙酸乙酯混合溶液超聲提取竹葉黃酮，試驗結果見表1。

表1 提取劑對竹葉黃酮提取效率的影響

由表1可知，采用70%乙醇+15mL乙酸乙酯混合溶液提取效果最好。

（2）固液比的影響

準確稱取6份苦竹葉粉末,每份1.0000g。在其他條件一致的前提下，分別按固液比1:15、1:20、1: 25、1:30、1:35、1:40加入70%乙醇+15mL乙酸乙酯混合溶液，超聲提取竹葉黃酮，試驗結果見表2。

表2 固液比對竹葉黃酮提取效率的影響

由表2可知，當固液比為1:35時提取效果最好。

（3）超聲次數的影響

準確稱取苦竹葉粉末6份，每份1.0000g。在其他條件一致的前提下，分別采用不同的超聲次數，每次25min，試驗結果見表3。

表3 超聲次數對竹葉黃酮提取效率的影響

由表3可知，超聲次數增加黃酮含量增大，但超過5次黃酮含量反而降低，因此，最佳超聲次數為5次。

（4）超聲時間的影響

準確稱取苦竹葉粉末6份，每份1.0000g。在其他條件一致的前提下，分別采用不同的超聲時間，共超聲3次，試驗結果見表4。

表4 不同超聲時間對竹葉黃酮提取效率的影響（黃酮含量：mg/g）

由表4可知，超聲時間為20min時，黃酮含量最大，由此選取20min為最佳的超聲時間。

2.2 最佳提取條件的確定

分別準確稱取9份1.000g竹葉粉末，以同樣的方法按四因素三水平的正交表L9(34)進行試驗[17]，優化竹葉黃酮提取工藝，試驗結果見表5、表6。

表5 正交試驗因素及水平表

表6 正交試驗結果

2.3 幾種竹葉中黃酮的提取實驗

精確稱取赤水河流域的苦竹葉、楠竹葉、水竹葉、刺竹葉、慈竹葉、白夾竹葉、粽葉粉末各1.0000g，按正交試驗所得的最佳試驗條件提取竹葉黃酮，過濾，定容至 50mL容量瓶中。用移液管準確吸取1.0mL提取液至25mL容量瓶中，按上述黃酮測定方法配制溶液，用不加樣品的溶液為空白參比，在360nm處測定吸光度，試驗結果見表7。

表7 7種竹葉中黃酮的含量

3 結語

對超聲波輔助乙醇、乙酸乙酯、水混合溶劑提取竹葉黃酮進行了研究，通過正交優化得到最佳工藝條件為：360nm為混合溶液最佳吸收波長；用料液比為1:35的80%乙醇+15mL乙酸乙酯溶液，超聲條件下超聲4次，每次25min，提取竹葉黃酮的效果良好。與之前作者用兩種混合溶劑體系結合超聲波輔助提取工藝比較[17]，由于第三種溶劑乙酸乙酯極性降低，對高極性黃酮溶解能力下降，因此固液比增大，超聲時間延長，符合預期。赤水河流域7種竹葉中黃酮的含量分別為：水竹9.713mg/g、粽葉9.244mg/g、楠竹16.419mg/g、白夾竹16.778mg/g、刺竹17.523mg/ g、苦竹21.552mg/g、慈竹23.042mg/g。

兩種方法提取的竹葉黃酮含量，有4種基本一致，其余3種有較大差異，其原因還待分析。可能的原因是加入極性較小的乙酸乙酯后，一部分原花青素等雜質溶出，帶來了干擾，導致兩種方法的結果不一致；還有一種可能是乙酸乙酯的加入，使原來某些低極性的竹葉黃酮被更多地提取出來。試驗證明在乙醇混合溶劑中加入乙酸乙酯提取竹葉黃酮是可行的。

[1]江帆,張倩如,伍鮮劍,等.幾種竹葉中黃酮提取工藝的研究[J].黑龍江畜牧獸醫(科技版),2015,(19):195-197.

[2]伊長文,張偉.苦竹葉黃酮提取工藝研究[J].安徽工程科技學院學報,2007,22(3):8-11.

[3]馮濤,曹東旭,呂曉玲.竹葉總黃酮含量的測定[J].中國食品添加劑,2002,(6):85-87.

[4]劉彬果,郭文勇,鐘蕾,等.大孔樹脂吸附技術在中藥制劑中的應用[J].解放軍藥學學報,2003,19(6):452-455.

[5]陶清,呂鑒泉.CO2超臨界流體萃取法提取竹葉黃酮的研究[J].湖北師范學院學報(自然科學版),2010,30(1):96-99.

[6]李惠力,陶文亮,吳鈺娟,等.酶法提取竹葉中總黃酮的工藝研究[J].貴州農業科學,2010,38(10):185-187.

[7]鄔建敏,賈之慎,唐云湖.竹類黃酮化合物總量及蘆丁含量的測定[J].浙江農業大學學報,1998,24(4):339-343.

[8]楊萍錢,俊青,胡永萍.苦竹葉竹種總黃酮提取工藝的比較[J].浙江林學院學報,2005,22(1):24-27.

[9]徐懷德.天然產物提取工藝學[M].北京:中國輕工業出版社, 2011.344-345.

[10]李永芳,文瑞芝,李忠海.箬竹葉總黃酮含量的測定[J].中南林學院學報,2006,26(4):128-131.

[11]金鋒.超聲波提取竹葉黃酮優化工藝研究[J].中國調味品, 2008,(4):55-57.

[12]朱萬強,張清榕.超聲波法提取赤水河流域竹葉黃酮工藝研究[J].遵義師范學院學報,2015,17(1):99-102.

[13]魏永生,王永寧,石玉平,等.分光光度法測定總黃酮含量的實驗條件研究[J].青海大學學報,2003,21(6):61-63.

[124]鄧斌,蔣剛彪,陳六平.分光光度法測定食品包裝紙用紫甘薯總黃酮的含量[J].包裝工程,2008,(1):27-29.

[15]鄔建敏,賈之慎,唐云湖.竹類黃酮化合物總量及蘆丁含量的測定[J].浙江農業大學學報,1998,24(4):21-24.

[16]蔣益花.紫外分光光度發測定南天竹葉總黃酮含量[J].浙江樹人大學學報,2011,11(1):21-24.

[17]董如何,肖必華,方永水.正交試驗設計的理論分析方法及應用[J].安徽建筑工業學院學報(自然科學版)，2004,12(6): 103-106.

（責任編輯：朱 彬）

A Study on Technology in Extracting Flavones from Bambooleaf under Auxiliary by Ultrasonic Wave in Mixed Solvent of Alcohol,Acetic Eether and Water

ZHU Wan-qiang,MA Zhou-jian
(a.Chemistry and Chemical Technology Institute;b.Laboratory of Utilization Research on Characteristic Resources in Qianbei,Zunyi Normal College,Zunyi Zunyi 563006,China)

With rutin as specimen and bamboo-leaf grown in Chi-shui river valley as subject,by means of ulitrasonic wave and in mixed solvent of alcohol,acetic ether and water,make a study of approach to extracting flavones from bamboo-leaf.L9(3)4 orthogonal experiment was used to investigate major factors,such as the mixed ratio of alcohol,acetic ether and water,ultrasonic time,frequency,and solid/ liquid ratio,etc.Rusults showed that the optional technology of extracting flavones is when 100 millitre per 80%alcohol solution mixed 15 millitre acetic ether,ultrasonic frequency is 4 times,every time lasts 25 minutes and the ratio of solid/liquid is 1:35.7 kinds flavones contents were determined coming from bamboo-leaf grown in Chi-shui river valley.

Chi-shui River valley;ultrasonic wave extracting;bamboos leaves flavones

TQ461

A

1009-3583（2017）-0110-04

2016-10-14

貴州省科學技術基金資助項目（黔科合J字LKZS[2012]27號）；遵義市特色水果貯藏與加工創新人才團隊資助項目（遵市科合（2016）3號）

朱萬強，男，貴州遵義人，遵義師范學院化學學工學院教授。研究方向：應用化學。