星點(diǎn)設(shè)計-響應(yīng)面法優(yōu)化壯骨方煮散的煎煮工藝Δ

田元春，李雙蕾，楊 婧，吳麗如，鄧紫娉（.廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥學(xué)部，南寧 530023；2.廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院內(nèi)分泌科，南寧 530023）

星點(diǎn)設(shè)計-響應(yīng)面法優(yōu)化壯骨方煮散的煎煮工藝Δ

田元春1＊，李雙蕾2#，楊 婧1，吳麗如1，鄧紫娉1（1.廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥學(xué)部，南寧 530023；2.廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院內(nèi)分泌科，南寧 530023）

目的：優(yōu)化壯骨方煮散的煎煮工藝。方法：采用2因素5水平星點(diǎn)設(shè)計試驗(yàn)，以加水（倍）量和煎煮時間為自變量，以淫羊藿苷提取量和浸膏得率的總評“歸一值”為因變量，進(jìn)行回歸方程擬合，采用響應(yīng)面法優(yōu)化壯骨方煮散煎煮工藝并進(jìn)行驗(yàn)證；將采用優(yōu)化后煎煮工藝的煮散與傳統(tǒng)飲片的煎煮效果進(jìn)行比較。結(jié)果：最優(yōu)工藝為加16倍量水，煎煮2次，每次20 min；驗(yàn)證試驗(yàn)中“歸一值”預(yù)測值與理論值的相對誤差為2.97%；煮散與飲片經(jīng)相同條件煎煮后淫羊藿苷提取量分別為1.234 3、1.132 4 μg/g，浸膏得率分別為23.73%、17.84%。結(jié)論：星點(diǎn)設(shè)計-響應(yīng)面法優(yōu)化煎煮工藝方法簡便、可靠，優(yōu)化的煎煮工藝穩(wěn)定、可行；壯骨方煮散煎出效果優(yōu)于傳統(tǒng)飲片。

壯骨方；煮散；飲片；星點(diǎn)設(shè)計-響應(yīng)面法；煎煮；工藝優(yōu)化；淫羊藿苷；浸膏得率

中藥煮散是指將中藥材粉碎成一定粒度與水共煎，去渣取汁制成的中藥液體制劑[1]。其與湯劑一樣是中藥的傳統(tǒng)用藥形式，既保持了湯劑的特點(diǎn)，又具有煎出率高、節(jié)省藥材、煎煮時間短等優(yōu)勢。壯骨方為廣西名中醫(yī)李雙蕾多年臨床積累的驗(yàn)方，由淫羊藿、黃芪、丹參、杜仲、山藥等藥材組成，具有益腎填精、活血化瘀、通絡(luò)止痛之功，對糖尿病性骨質(zhì)疏松癥有較好療效[2]；可使2型糖尿病模型大鼠血清胰島素樣生長因子1（IGF-1）水平升高、腫瘤壞死因子α（TNF-α）水平降低，促進(jìn)骨形成、抑制骨吸收，改善糖尿病骨代謝進(jìn)程[3]。本課題組擬將壯骨方制成煮散劑，以節(jié)約中藥資源、提高煎出效率、保證臨床療效、降低患者費(fèi)用。淫羊藿為方中君藥，研究表明淫羊藿苷為抗骨質(zhì)疏松作用的有效成分[4]。本研究以淫羊藿苷提取量和浸膏得率的總評“歸一值”為綜合評價指標(biāo)，采用星點(diǎn)設(shè)計-響應(yīng)面法優(yōu)化壯骨方煮散的煎煮工藝，為壯骨方煮散的研制提供參考。

1 材料

1.1 儀器

XFB-400B小型中藥粉碎機(jī)（吉首市中誠制藥機(jī)械廠）；GH-252分析天平（廣州市艾安得儀器有限公司）；LC-20AT型高效液相色譜儀、SPD-20A紫外檢測器、LC Solution色譜工作站（日本島津公司）。

1.2 藥材、對照品與試劑

淫羊藿（批號：20151226）、黃芪（批號：20151223）、丹參（批號：20151211）、杜仲（批號：20151205）、山藥（批號：20151217）、三七（批號：20151226）均購自柳州神農(nóng)中藥飲片廠，經(jīng)廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院黃權(quán)芳副主任中藥師鑒定均為2015年版《中國藥典》收載相應(yīng)品種的真品；淫羊藿苷對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：MUST-15052801，純度：99.97%）；乙腈、甲醇均為色譜純，水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 煮散的制備方法

壯骨方全方飲片總質(zhì)量為105 g，依據(jù)宋代龐安時《傷寒總病論》提出的煮散“一方取半劑”的理論，稱取壯骨方全方處方的半劑飲片（飲片總質(zhì)量52.5 g）。其中山藥粗碎，其余藥材分別于粉碎機(jī)中切割粉碎至過10目篩，并檢測能通過80目篩的細(xì)粉量＜10%，混合均勻，即得煮散。

2.2 淫羊藿苷含量的測定

2.2.1 色譜條件 采用《中國藥典》條件[5]。色譜柱：Plastisil C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；保護(hù)柱：Easy-Guard C18（10 mm×4 mm，5 μm）；流動相：乙腈-水（27∶73）；柱溫：30℃；檢測波長：270 nm；流速：1.0 mL/min。理論板數(shù)按淫羊藿苷峰計應(yīng)不低于1 500。取“2.2.2”“2.2.3”項(xiàng)下溶液（供試品為正交試驗(yàn)7號）及除淫羊藿外的其余藥材制備的陰性樣品溶液進(jìn)樣分析，色譜圖見圖1。

圖1 高效液相色譜圖Fig 1 HPLC chromatograms

2.2.2 對照品溶液的制備 取淫羊藿苷對照品適量，精密稱定，加甲醇制成284 μg/mL的溶液，備用。

2.2.3 供試品溶液的制備 取壯骨方煮散提取液經(jīng)過濾后的續(xù)濾液濃縮定容至100 mL，得煮散液。精密吸取煮散液5 mL至10 mL量瓶中，加甲醇約4 mL，超聲提取30 min，取出，放至室溫，加甲醇定容至刻度，離心（3 500 r/min，離心半徑為6.5 cm）5 min，取出。精密吸取上清液2 mL至5 mL量瓶中，加甲醇定容至刻度，用0.45 μm的微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制及方法學(xué)考察 分別精密吸取對照品溶液0.5、1、3、5、10、15、20、25 μL注入色譜儀，記錄色譜圖。以峰面積（A）對進(jìn)樣量（X，μg）進(jìn)行回歸，得淫羊藿苷線性回歸方程為A＝2 572 064X+27 344（r＝0.999 9），表明淫羊藿苷進(jìn)樣量線性范圍為0.142～7.10 μg。按相關(guān)要求進(jìn)行方法學(xué)考察，結(jié)果均符合規(guī)定。

2.3 浸膏得率的測定

精密吸取煮散提取液10 mL，置于已干燥至恒質(zhì)量的蒸發(fā)皿中，水浴蒸干后移至烘箱中105℃干燥3 h。蒸發(fā)皿移至干燥器中冷卻30 min，迅速精密稱定質(zhì)量，計算浸膏得率（%）：（w×V）/（W×v）×100%，w為浸膏質(zhì)量（g），W為藥材質(zhì)量（g），V為樣品溶液的總體積，v為量取樣品溶液的體積。

2.4 星點(diǎn)設(shè)計-響應(yīng)面法優(yōu)化提取工藝

2.4.1 因素、水平及指標(biāo)的確定 本課題組前期采用單因素法考察了影響壯骨方煮散煎煮效率的因素，結(jié)果提示加水量及煎煮時間是影響煎煮效率的主要因素，故本研究以加水量（X1）及煎煮時間（X2）為因素進(jìn)行考察。根據(jù)預(yù)試驗(yàn)分別設(shè)定其范圍為X1：10～20倍；X2：10～30 min。因煎煮次數(shù)為非連續(xù)變量，結(jié)合臨床補(bǔ)益類中藥方劑煎煮2次的實(shí)際情況，煎煮次數(shù)定為2次。以淫羊藿苷提取量（Y1）、浸膏得率（Y2）為考察指標(biāo)，每個指標(biāo)用Hassan法轉(zhuǎn)化為0～1的總評“歸一值”（OD）[6]：OD＝（d1×d2）1/2，d＝（Yi－Ymin）/（Ymax－Ymin）（其中，i為第i個樣品，Yi為選定的第i個樣品某個評價指標(biāo)的實(shí)測值，Ymin為該評價指標(biāo)實(shí)測值中的最小值，Ymax為該評價指標(biāo)實(shí)測值中的最大值），OD越大表明提取效果越好。

2.4.2 試驗(yàn)設(shè)計與結(jié)果 采用2因素5水平星點(diǎn)設(shè)計-響應(yīng)面法優(yōu)化煎煮工藝。因素與水平見表1，試驗(yàn)安排與結(jié)果見表2。

表1 因素與水平Tab 1 Factors and levels

表2 試驗(yàn)設(shè)計與結(jié)果Tab 2 Test design and results

2.4.3 模型擬合與方差分析 采用Matlab 7.0.1軟件對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合。首先對各因素進(jìn)行多元線性模型擬合后發(fā)現(xiàn)擬合度不好，故又采用二次多項(xiàng)式模型擬合，得回歸方程為OD＝0.344 6X1－4.374 4+0.191 8X2－0.001 3X1X2－0.008 8X12－0.003 9X22（r＝0.903 2，P＝0.016 6＜0.05），提示該煎煮工藝各項(xiàng)指標(biāo)采用二次多項(xiàng)式模型較合適。在此基礎(chǔ)上再對模型進(jìn)行進(jìn)一步的優(yōu)化，得到簡化的二次多項(xiàng)式方程為OD＝0.318 5X1－3.982 4+0.172 2X2－0.008 8X12－0.003 9X22（r＝0.900 4，P＝0.005 4＜0.01），此方程可信度較高，故以此二次多項(xiàng)式模型作為預(yù)測模型。對此模型采用F檢驗(yàn)進(jìn)行方差分析，結(jié)果顯示各因素對淫羊藿苷及浸膏得率的影響大小順序?yàn)閄2＞X1，模型達(dá)到極顯著水平，詳見表3。

表3 方差分析結(jié)果Tab 3 Variance analysis results

2.4.4 工藝優(yōu)化結(jié)果 根據(jù)上述二次多項(xiàng)式模型，繪制因變量隨自變量變化的三維響應(yīng)面圖，詳見圖2。

圖2 響應(yīng)面圖Fig 2 Response surface map

由圖2可知，隨著加水（倍）量和煎煮時間的增加，OD增加。最優(yōu)區(qū)域OD＞0.7，選取較優(yōu)范圍X1為14.7～21.5倍、X2為17.0～27.2 min。結(jié)合生產(chǎn)實(shí)際考慮，選定最優(yōu)工藝為加水量為16倍，煎煮時間為20 min，煎煮2次。2.4.5 驗(yàn)證試驗(yàn) 稱取壯骨方煮散（飲片總質(zhì)量52.5 g），按優(yōu)化的煎煮工藝進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，重復(fù)3次。結(jié)果淫羊藿苷提取量分別為1.226 1、1.161 2、1.315 7 μg/g，平均值為1.234 3 μg/g；浸膏得率分別為23.91%、23.79%、23.47%，平均值為23.73%；計算OD分別為0.770 1、0.717 7、0.812 9，平均值為0.766 9，與預(yù)測值0.744 8的相對誤差為2.97%。以上表明建立的數(shù)學(xué)模型預(yù)測性較好，優(yōu)化的工藝條件穩(wěn)定、可行。

2.5 壯骨方煮散與傳統(tǒng)飲片煎煮效果比較

取半量壯骨方傳統(tǒng)飲片（飲片總質(zhì)量52.5 g），加16倍水，煎煮2次，每次20 min，濾過，續(xù)濾液定容至100 mL，參照“2.2”“2.3”項(xiàng)下方法測定淫羊藿苷提取量和浸膏得率。重復(fù)3次，對比壯骨方煮散和傳統(tǒng)飲片煎出效率。結(jié)果壯骨方煮散煎液淫羊藿苷提取量（1.234 3 μg/g）是傳統(tǒng)飲片中淫羊藿苷提取量（1.132 4 μg/g）的1.09倍，煮散煎液浸膏得率（23.73%）是傳統(tǒng)飲片浸膏得率（17.84%）的1.33倍。因此，基于淫羊藿苷提取量和浸膏得率這2個指標(biāo)，可認(rèn)為壯骨方煮散煎出效率優(yōu)于傳統(tǒng)飲片。

3 討論

據(jù)文獻(xiàn)報道，大多數(shù)淫羊藿藥材中朝藿定C含量較淫羊藿苷含量高[7-9]。本試驗(yàn)采用的淫羊藿藥材在稀乙醇提取液中朝藿定C含量也較淫羊藿苷含量高。但筆者另外在預(yù)試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，在加水量相同的情況下，隨著煎煮時間的延長和煎煮次數(shù)的增加，煎煮液中朝藿定C提取量呈逐漸下降的趨勢、淫羊藿苷提取量呈小幅上升的趨勢；煮散煎煮40 min后，淫羊藿苷提取量大于朝藿定C提取量，這可能與朝藿定C結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定有關(guān)。故本試驗(yàn)最終選擇淫羊藿苷提取量為工藝考察指標(biāo)。

由于工藝優(yōu)化需考慮多個指標(biāo)，而單個指標(biāo)受因素的影響，不一定呈現(xiàn)相同的線性關(guān)系，指標(biāo)之間也存在相互影響，最終選擇條件需要依據(jù)各項(xiàng)指標(biāo)的綜合效應(yīng)[6]。因此，本文采用OD表達(dá)最終效應(yīng)，并建立數(shù)學(xué)模型進(jìn)行優(yōu)化與預(yù)測分析。

在同時考察多個因素對結(jié)果的影響的工藝篩選研究中，采用較多的方法有均勻設(shè)計和正交試驗(yàn)設(shè)計，但這2類設(shè)計存在各因素間的交互作用考察不靈敏、試驗(yàn)精度不夠、不能精確找到最佳點(diǎn)等問題[10]。因此，本文選用星點(diǎn)設(shè)計-響應(yīng)面法，以二項(xiàng)式建立模型，此法精確度更高，試驗(yàn)預(yù)測值更接近真實(shí)值。

煮散藥材的粉碎粒度并不是越小越好。壯骨方煮散中含有山藥，山藥富含淀粉，粒度過小易產(chǎn)生糊化作用，包裹在其他藥材的外層而不利于其他藥材有效成分的煎出。故本試驗(yàn)采用山藥粗碎、其他藥材細(xì)碎的粉碎方法，結(jié)果較好。本課題組后續(xù)將側(cè)重研究壯骨方中每味藥材的最優(yōu)粉碎粒度。

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Optimization of Decoction Technology for Zhuanggufang Decoction Powder by Central Composite Designresponse Surface Method

TIAN Yuanchun1，LI Shuanglei2，YANG Jing1，WU Liru1，DENG Zipin1（1.Dept.of Pharmacy，the First Affiliated Hospital of Guangxi University of Chinese Medicine，Nanning 530023，China；2.Dept.of Endocrinology，the First Affiliated Hospital of Guangxi University of Chinese Medicine，Nanning 530023，China）

OBJECTIVE：To optimize the decoction technology of Zhuanggufang decoction powder.METHODS：Central composite design with 2 factors and 5 levels was conducted to design the test，taking water（fold）and decoction time as independent variables，the extraction amount of icariin and extraction yield overall desirability value of as dependent variables，regression equation were fitted；response surface method was used to optimize the decoction technology of Zhuanggufang decoction powder，and was verified.It was compared with the traditional decoction piece effect.RESULTS：The optimized technology was decocted twice with 16-fold water，20 min each time；relative error of predicted and theoretical value by overall desirability value was 2.97%；after decoction powder and piece decocted in the same conditions，the extraction amounts of icariin were 1.234 3 μg/g and 1.132 4 μg/g，extraction yields were 23.73%and 17.84%，respectively.CONCLUSIONS：Central composite design-response surface method optimizing decoction technology is simple and reliable，the optimized decoction technology is stable and feasible，and the decoction capability of Zhuanggufang decoction powder is better than the traditional pieces.

Zhuanggufang；Decoction powder；Decoction pieces；Central composite design-response surface method；Decoction process；Technology optimization；Icariin；Extraction yield

R284.2

A

1001-0408（2017）07-0954-04

2016-06-10

2016-08-12）

（編輯：劉 萍）

廣西科學(xué)研究與技術(shù)開發(fā)計劃項(xiàng)目（No.桂科攻14124004-1-26）；廣西名老中醫(yī)民族醫(yī)傳承工作室建設(shè)項(xiàng)目[No.桂衛(wèi)中〔2014〕9號]

＊主任藥師。研究方向：臨床藥學(xué)、醫(yī)院藥學(xué)。電話：0771-5840015。E-mail：tianyc1989@163.com

#通信作者：主任醫(yī)師，教授。研究方向：內(nèi)分泌及代謝性疾病。電話：0771-5848628。E-mail：lslei66@126.com

DOI10.6039/j.issn.1001-0408.2017.07.26