雷公藤甲素在正常大鼠和佐劑性關節炎模型大鼠體內的藥動學研究

陳凱麗，易劍峰，翟文靜，孫 蘭，孫 文（宜春學院化學與生物工程學院，江西 宜春 336000）

雷公藤甲素在正常大鼠和佐劑性關節炎模型大鼠體內的藥動學研究

陳凱麗＊，易劍峰#，翟文靜，孫 蘭，孫 文（宜春學院化學與生物工程學院，江西 宜春 336000）

目的：研究雷公藤多苷片中活性成分雷公藤甲素在正常大鼠和佐劑性關節炎模型大鼠體內的藥動學特征，為其臨床合理用藥提供參考。方法：將12只SD大鼠隨機分為正常組和模型組，每組6只。模型組大鼠sc完全弗氏佐劑0.1 mL復制佐劑性關節炎模型，正常組大鼠sc等體積生理鹽水。造模14 d后，兩組大鼠均ig雷公藤多苷片混懸液96 mg/kg，分別于給藥前及給藥后10、30、45、60、90、120、150、180、240、300、420 min眼眶取血0.4 mL，采用高效液相色譜法測定雷公藤甲素的血藥濃度；采用DAS 2.0藥動學軟件計算藥動學參數，并進行比較。結果：雷公藤甲素在正常組、模型組大鼠體內的cmax分別為（1.139±0.114）、（0.916± 0.103）μg/mL，tmax分別為（2.167±0.606）、（3.083±0.801）h，t1/2α分別為（5.500±3.610）、（5.593±1.795）h，AUC0-7h分別為（5.052± 0.371）、（4.707±0.347）μg·h/mL，MRT0-7h分別為（3.224±0.119）、（3.429±0.139）h，CL分別為（11.616±2.986）、（11.246±2.638）mL/h。與正常組比較，模型組大鼠cmax顯著減小，tmax和MRT0-7h顯著延長（P＜0.05）。結論：佐劑性關節炎會影響大鼠體內雷公藤甲素的藥動學特征，其可促進大鼠體內雷公藤甲素的吸收與消除。

雷公藤多苷片；佐劑性關節炎；雷公藤甲素；藥動學；大鼠

類風濕關節炎（Rheumatoid arthritis，RA）屬于慢性全身性自身免疫性疾病，主要臨床表現為關節周圍組織和滑膜非感染性炎癥病變，臨床治療多采用口服給藥。雷公藤多苷片（Tripterygium glycosides tablets，TGPT）為傳統中成藥，是從衛矛科植物雷公藤的根芯部分提取并精制而成的混合物，雷公藤甲素（Triptolide）為其最主要的活性成分，其抗炎作用顯著，治療RA和其他自身免疫性疾病療效較好，是常用的免疫抑制劑。臨床研究表明，雷公藤甲素能明顯緩解關節疼痛，但同時具有多器官毒性、安全范圍較小的特點，使其臨床使用受到一定限制[1-2]。因此，在本研究中筆者擬探討雷公藤甲素在正常大鼠和佐劑性關節炎大鼠體內的藥動學特征，以為其治療RA提供實驗依據。

1 材料

1.1 儀器

1200高效液相色譜（HPLC）儀，包括G1315D二極管陣列檢測器（美國Angilent公司）；5415R高速低溫離心機（德國EPPENDORF公司）；FC204電子天平（上海精科天平儀器廠）。

1.2 藥材、藥品與試劑

雷公藤多苷片（湖南千金協力藥業有限公司，批號：20150301，規格：0.1 mg/片）；雷公藤甲素對照品（上海源葉生物科技有限公司，批號：38748-32-2，純度：98%）；完全弗氏佐劑（美國Sigma公司）；乙腈、甲醇為色譜純，乙酸乙酯為分析純。

1.3 動物

SPF級SD大鼠，12只、♂，體質量（280±15）g，由湖南斯萊克景達實驗動物有限公司提供，合格證號：43004700021623，許可證號：SCXK（湘）2013-0004。實驗遵循動物實驗倫理委員會指導原則，實驗前12 h禁食不禁水。

2 方法

2.1 色譜條件

[3-5]改進色譜條件。色譜柱：Agilent Eclipse XDB-C18（150 mm×4.6 mm，5 μm）；柱溫：30℃；流動相：乙腈-水（30∶70，V/V）；流速：0.8 mL/min；檢測波長：218 nm；進樣量：20 μL。

2.2 標準溶液的制備

精密稱取雷公藤甲素對照品5 mg，置于5 mL量瓶中，甲醇溶解并定容，即得質量濃度為1 mg/mL的雷公藤甲素對照品溶液。依次稀釋為質量濃度為800、100、50、10、1 μg/mL的系列標準溶液，4℃冰箱保存，備用。

2.3 分組、造模、給藥與取血

12只SD大鼠隨機分為正常組和模型組，每組6只。模型組大鼠于右后足趾部sc完全弗氏佐劑0.1 mL以復制佐劑性關節炎模型；正常組大鼠sc等體積生理鹽水。14 d后，兩組大鼠分別ig雷公藤多苷片混懸液96 mg/kg（溶劑為0.5%羧甲基纖維素鈉，給藥劑量根據前期預實驗確定）。分別于給藥前及給藥后10、30、45、60、90、120、150、180、240、300、420 min從眼眶取血0.4 mL，置于含肝素鈉的EP管中，離心（離心半徑為8 cm、3 500 r/min）15 min，－80℃冰箱冷凍保存，備用。

2.4 血漿樣品處理

吸取“2.3”項下血漿100 μL，置于EP管1中，加入乙酸乙酯300 μL，渦旋2 min，靜止1 min分層后離心（離心半徑為8 cm、8 000 r/min）10 min，取上清液于EP管2中；向EP管1中再加入乙酸乙酯300 μL，同上法取上清液，與EP管2中的上清液混勻；以55～60℃水浴蒸干，加入100 μL甲醇復溶，旋渦混勻，離心（離心半徑為8 cm、12 000 r/min）10 min后，吸取20 μL進樣測定[6-7]。

2.5 雷公藤甲素血藥濃度測定的方法學考察

按照相關規定考察雷公藤甲素血藥濃度測定方法的專屬性、回歸方程與線性范圍、日內和日間精密度、準確度、提取回收率和穩定性。

2.6 藥動學研究

取“2.4”項下處理血漿后，按“2.1”項下色譜條件進樣分析，繪制藥-時曲線，并采用DAS 2.0藥動學軟件計算藥動學參數。

2.7 數據處理

采用DAS 2.0藥動學軟件對大鼠體內的藥-時曲線進行非房室模型擬合，采用SPSS 17.0統計軟件對兩組藥動學參數進行計算。數據以±s表示，采用獨立樣本t檢驗。P＜0.05表示差異有統計學意義。

3 結果

3.1 方法學考察結果

3.1.1 專屬性考察 按相關要求進行操作，結果雷公藤甲素在該色譜條件下分離度好、峰形良好、樣品峰附近無內源雜峰干擾，表明本方法專屬性良好。

3.1.2 回歸方程、精密度、準確度、提取回收率與穩定性考察 按相關要求進行操作，以雷公藤甲素質量濃度（x，μg/mL）為橫坐標，峰面積（y）為縱坐標進行線性回歸，結果雷公藤甲素的回歸方程為y＝77.723x－33.224（r＝0.998 2），檢測質量濃度線性范圍為0.29～36.48 μg/mL；日內、日間精密度試驗的RSD均不大于4.53%（n＝5），準確度在81.23%～93.46%之間（RSD均不大于5.0%，n＝5）；提取回收率在77.20%～88.16%之間（RSD均不大于2.04%，n＝3）；室溫放置4 h、－80℃凍存20 d、反復凍融3次后穩定性的RSD≤4.95%（n＝5）。考察結果表明，精密度、準確度、提取回收率與穩定性符合相關要求。

3.2 藥動學研究結果

兩組大鼠ig雷公藤多苷片混懸液后藥-時曲線見圖1。采用DAS 2.0軟件，按照非房室模型進行處理，計算藥動學參數，結果見表1。

圖1 雷公藤甲素在正常大鼠和佐劑性關節炎模型大鼠體內的藥-時曲線Fig 1 Plasma concentration-time curves of triptolide in normal rats and adjuvant arthritis rats

由表1可知，與正常組比較，模型組大鼠體內雷公藤甲素的cmax顯著減小，tmax、MRT0-7h顯著延長（P＜0.05）。

4 討論

參考預實驗和文獻報道[8]，TGPT主要成分雷公藤甲素在甲醇、乙腈等溶劑中較穩定，前期預實驗對樣品提取方法進行了考察，經比較后發現采用乙酸乙酯萃取結果較好。本研究建立的HPLC法專屬性較好、靈敏度較高，且方法簡單可靠，可滿足雷公藤甲素血漿藥物濃度分析的需要。

大鼠右后足趾部sc完全弗氏佐劑0.1 mL可成功復制佐劑性關節炎模型，與RA的臨床表現、病理生理以及免疫學變化等方面有相似特征[9-10]。此外，由于TGPT成分復雜，雷公藤甲素含量較低，在預實驗時發現TGPT中所含雷公藤甲素吸收入血后含量較低，按照臨床常用劑量折算后給藥，其血藥濃度不在線性范圍內，無法估計正常和病理狀態下的藥動學參數。參考相關毒性研究文獻對給藥劑量進行優化后發現，選用稍高于臨床劑量連續給藥1個月后可進行正常狀態和病理狀態下的藥動學研究[11-12]，因此本實驗選用稍高于臨床劑量（約9倍）換算后進行研究。

采用DAS 2.0軟件擬合藥動學參數的結果顯示，模型組大鼠體內雷公藤甲素cmax顯著低于正常組，tmax、MRT0-7h顯著高于正常組，這表明雷公藤甲素在佐劑性關節炎大鼠體內的吸收速度減慢、血藥濃度顯著降低，與正常組大鼠藥動學行為相比存在顯著差異。這可能是受到模型大鼠體內的炎癥介質、滑膜成纖維細胞的表達及T細胞和細胞因子分泌等的影響[13-15]，從而使藥物的藥動學行為發生改變，但具體的作用機制還有待進一步研究。

綜上所述，佐劑性關節炎會影響大鼠體內雷公藤甲素的藥動學特征，其可促進大鼠體內雷公藤甲素的吸收與消除。但不同病理狀態對雷公藤甲素藥動學的影響程度尚需進一步研究確定。本研究結果可為TGPT在臨床上對不同機體狀態的患者制訂合理給藥方案提供參考，以進一步提高其臨床用藥的療效和安全性。

表1 雷公藤甲素在正常和佐劑性關節炎大鼠體內的主要藥動學參數（±s，n＝6）Tab 1 Main pharmacokinetic parameters of triptolide in normal and adjuvant arthritis rats in vivo（±s，n＝6）

表1 雷公藤甲素在正常和佐劑性關節炎大鼠體內的主要藥動學參數（±s，n＝6）Tab 1 Main pharmacokinetic parameters of triptolide in normal and adjuvant arthritis rats in vivo（±s，n＝6）

注：與正常組比較，＊P＜0.05Note：vs.normal group，＊P＜0.05

藥動學參數tmax，h cmax，μg/mL AUC0-7h，μg·h/mL AUC0-∞，μg·h/mL AUMC0-7hAUMC0-∞MRT0-7h，h MRT0-∞，h t1/2α，h CL，mL/h V，mL模型組3.083±0.801＊0.916±0.103＊4.707±0.347 8.954±2.174 16.169±1.733 84.059±42.437 3.429±0.139＊8.927±2.402 5.593±1.795 11.246±2.638 85.719±13.111正常組2.167±0.606 1.139±0.114 5.052±0.371 8.934±3.209 16.294±1.455 87.971±91.381 3.224±0.119 8.446±4.774 5.500±3.610 11.616±2.986 80.137±21.690

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（編輯：劉明偉）

Pharmacokinetic Study on the Triptolide in Normal Rats and Adjuvant Arthritis Model Rats in vivo

CHEN Kaili，YI Jianfeng，ZHAI Wenjing，SUN Lan，SUN Wen（School of Chemistry and Bioengineering，the College of Yichun，Jiangxi Yichun，336000 China）

OBJECTIVE：To study the pharmacokinetics of triptolide in Tripterygium glycosides tablet in normal rats and adjuvant arthritis model rats in vivo，and provide reference for clinical rational drug use.METHODS：12 SD rats were randomly divided into normal group and model group，6 in each group.Model group was subcutaneously injected complete Freund’s adjuvant 0.1 mL to induce adjuvant arthritis model，normal group was subcutaneously injected the same volume of saline.After 14 d modeling，2 groups were given Tripterygium glycosides tablet suspension 96 mg/kg intragastrically，the blood sample of eyes 0.4 mL were respectively taken before and 10，30，45，60，90，120，150，180，240，300，420 min after administration.The plasma concentration of triptolide was determined by HPLC，the pharmacokinetic parameters were calculated by DAS 2.0 software，and the parameters were compared.RESULTS：The pharmacokinetic parameters of triptolide in normal group were cmaxof（1.139±0.114）μg/mL，tmaxof（2.167±0.606）h，t1/2αof（5.500±3.610）h，AUC0-7hof（5.052±0.371）μg·h/mL，MRT0-7hof（3.224±0.119）h，and CL of（11.616±2.986）mL/h；and those in model group were cmaxof（0.916±0.103）μg/mL，tmaxof（3.083±0.801）h，t1/2αof（5.593±1.795）h，AUC0-7hof（4.707±0.347）μg·h/mL，MRT0-7hof（3.429±0.139）h，and CL of（11.246±2.638） mL/h. Compared with normal group，cmaxin model group was significantly decreased，tmaxand MRT0-7hwere significantly prolonged（P＜0.05）.CONCLUSIONS：Adjuvant arthritis can affect the pharmacokinetics of triptolide in rats in vivo，and promote its absorption and removal.

Tripterygium glycosides tablet；Adjuvant arthritis；Triptolide；Pharmacokinetics；Rats

R969.1；R284.1

A

1001-0408（2017）07-0923-03

2016-08-07

2016-12-31）

＊碩士研究生。研究方向：臨床藥學。E-mail：1043160721@qq. com

#通信作者：教授，博士。研究方向：臨床藥學。電話：0795-3200633。E-mail：rainbowyjf@126.com

DOI10.6039/j.issn.1001-0408.2017.07.17