重組水蛭素腸溶膠囊單次和多次給藥在Beagle犬體內的藥動學研究

楊 輝，周遠大，何海霞，范 開（.重慶醫科大學附屬第一醫院藥學部，重慶 40006；.重慶富進生物醫藥有限公司，重慶 400054）

重組水蛭素腸溶膠囊單次和多次給藥在Beagle犬體內的藥動學研究

楊 輝1＊，周遠大1，何海霞1，范 開2（1.重慶醫科大學附屬第一醫院藥學部，重慶 400016；2.重慶富進生物醫藥有限公司，重慶 400054）

目的：研究重組水蛭素腸溶膠囊單次和多次給藥在Beagle犬體內的藥動學特征。方法：取12只Beagle犬按隨機對照法分為單次ig組和單次iv組，每組6只，按0.2 mg/kg ig或iv重組水蛭素，收集血樣；清洗2周后12只犬按0.2 mg/kg ig重組水蛭素，連續給藥7 d，收集血樣，作為多次ig組。采用酶聯免疫吸附法測定血漿中重組水蛭素濃度，以DAS 2.0軟件計算藥動學參數。結果：單次ig和單次iv重組水蛭素在Beagle犬體內藥動學特征均符合二室模型，ig重組水蛭素腸溶膠囊的絕對生物利用度為（14.908±1.868）%；單次ig組和多次ig組犬體內重組水蛭素的tpeak分別為（2.105±0.243）、（3.000±0.000）h，t1/2β分別為（8.660± 2.965）、（14.870±2.710）h，cmax分別為（10.700±0.872）、（12.05±1.587）ng/mL，AUC0-1440min分別為（55.250±4.386）、（58.978±6.002）ng·h/mL，兩組間差異無統計學意義（P＞0.05）。結論：ig重組水蛭素腸溶膠囊可一定程度被吸收入血；連續多天ig重組水蛭素腸溶膠囊在犬體內不產生蓄積，不改變其藥動學特征。

重組水蛭素；腸溶膠囊；注射液；單次給藥；多次給藥；藥動學；Beagle犬

水蛭（Hinudo nipponica whitman）學名為日本醫蛭，是我國傳統的中藥材，始載于《神農本草經》，歷代本草對其均有記錄。藥用水蛭為水蛭的干燥全體，具有破血逐瘀的作用。天然的水蛭素（Hirudin）是由65～66個氨基酸組成的多肽，是迄今為止最強的凝血酶特異性抑制劑[1-2]。由于天然水蛭素的來源匱乏，提取步驟煩瑣，難以得到足夠量的純品以滿足臨床用藥的需求。20世紀80年代末，國外應用基因工程技術，研制出與天然水蛭素結構相似、作用相同的重組水蛭素（Recombinant hirudin，rH），并在臨床上得到廣泛應用。重組水蛭素注射劑和脂質體鼻腔給藥的藥動學已有文獻報道[3-5]，但重組水蛭素口服制劑的藥動學研究尚未見文獻報道。本研究采用酶聯免疫吸附（ELISA）法，測定Beagle犬單次iv重組水蛭素注射液和單次ig、多次ig重組水蛭素腸溶膠囊后的血藥濃度，研究重組水蛭素腸溶膠囊在Beagle犬體內的藥動學特征，以期為水蛭素口服制劑的臨床應用提供實驗依據。

1 材料

1.1 儀器

MR-250型酶標儀（天津科器高新技術公司）；B160A型醫用低速離心機（河北省安新縣白洋離心機廠）；BP61型電子天平（德國Sartorius公司）。

1.2 藥品

重組水蛭素腸溶膠囊[批號：030301，規格：含重組水蛭素0.25 mg/粒（抗凝血酶活力單位為3 000 ATU/粒）]和重組水蛭素注射液（批號：031101，規格：1.0 mg/mL）均由重慶富進生物制藥公司提供。

1.3 動物

健康合格一級Beagle犬24只，體質量（7.0±0.8）kg，6月齡，♀♂各半，由四川養麝研究所提供，質量合格證號和環境設施合格證號分別為“川實動管第63、64號”。

2 方法

2.1 給藥方案與血樣采集

2.1.1 單次給藥方案 參照文獻[6-8]，采用隨機對照設計，取12只Beagle犬，適應性喂養1周后進行實驗。按隨機數字表分為單次ig組和單次iv組，每組6只犬，實驗前禁食12 h后，根據人用劑量換算，于次日早晨8：00分別單次ig或單次iv 0.2 mg/kg重組水蛭素腸溶膠囊或注射液。單次iv組犬分別于給藥前和給藥后2、5、10、20、40、60、120、240、480 min經前肢靜脈取血2 mL；單次ig組犬分別于給藥前和給藥后60、120、180、240、360、480、840、1 440 min經前肢靜脈取血2 mL。血樣用3.8%枸櫞酸鈉抗凝，分離血漿，－20℃保存，待測。

2.1.2 多次給藥方案 參照文獻[9-10]，單次給藥方案結束后，12只Beagle犬清洗2周后開始多次ig重組水蛭素腸溶膠囊，給藥劑量為0.2 mg/kg，于每天早晨8：00時ig 1次，連續給藥7 d，記為多次ig組。于每次給藥前經前肢靜脈取血2 mL用于測定谷濃度，分別于給藥前和給藥7 d后60、120、180、240、360、480、840、1 440 min經前肢靜脈取血2 mL，同“2.1.1”項下方法處理后保存。

2.2 血藥濃度的測定

按照筆者前期研究方法——ELISA法[11]測定各組犬各時間點重組水蛭素的血藥濃度。

2.3 數據處理方法

采用DAS 2.0軟件進行藥動學房室模型擬合，計算藥動學參數。藥動學參數以±s表示，使用SPSS 19.0軟件進行統計分析，兩兩比較采用獨立樣本t檢驗。P＜0.05表示差異有統計學意義。

3 結果

3.1 單次給藥的藥-時曲線

單次iv、單次ig組犬給藥后體內重組水蛭素的藥-時曲線見圖1。結果表明，單次ig組犬體內重組水蛭素的tpeak為

圖1 單次給藥組犬體內重組水蛭素的藥-時曲線Fig 1 Concentration-time curve in vivo of recombinant hirudin in dogs of single administration groups

（2.105±0.243）h；單次ig組和單次iv組犬體內重組水蛭素的t1/2β分別為（8.660±2.965）、（2.642±0.920）h；AUC0-1440min分別為（55.250±4.386）、（372.980±27.872）ng·h/ mL。重組水蛭素腸溶膠囊的絕對生物利用度（F）為

（14.908±1.868）%，表明重組水蛭素腸溶膠囊可在一定程度被吸收入血。

3.2 多次給藥的藥-時曲線

3.2.1 第1～6天谷濃度 犬給藥第1～6天的重組水蛭素谷濃度均低于檢測下限（0.250 ng/mL），個別可測到濃度者也未表現出累積趨勢。

3.2.2 第7天血藥濃度 多次ig組犬體內重組水蛭素的藥-時曲線見圖2。

圖2 多次ig組犬體內重組水蛭素的藥-時曲線Fig 2 Concentration-time curve in vivo of recombinant hirudin in dogs of multiple ig group

3.3 藥動學房室模型

3種給藥方式下，犬體內重組水蛭素的藥動學房室模型擬合結果見表1。

由表1可知，當房室模型為二室模型，權重因子為1/C2時，其AIC最小，R2越接近1，表明Beagle犬體內藥物濃度隨時間的變化符合二室模型，權重系數1/C2擬合較佳。

3.4 藥動學參數

單次和多次ig組犬體內重組水蛭素的藥動學參數見表2。

表1 3種給藥方式下犬體內重組水蛭素的藥動學房室模型擬合結果Tab 1 Pharmacokinetic compartment model fitting results of dogs in vivo by 3 administration ways

表2 單次和多次ig組犬體內重組水蛭素的藥動學參數（±s）Tab 2 Pharmacokinetic parameters in vivo of recombinant hirudin in dogs of single and multiple ig groups（±s）

表2 單次和多次ig組犬體內重組水蛭素的藥動學參數（±s）Tab 2 Pharmacokinetic parameters in vivo of recombinant hirudin in dogs of single and multiple ig groups（±s）

參數t1/2α，h t1/2β，h K21，L/h K10，L/h K12，L/h AUC0-∞，ng·h/mL AUC0-1440min，ng·h/mL cmax，ng/mL tpeak，h CLs，L/（kg·h）單次ig組（n=6）1.399±0.146 8.660±2.965 0.249±0.189 0.217±0.046 0.128±0.070 59.489±5.780 55.250±4.386 10.700±0.872 2.105±0.243 4.042±0.533多次ig組（n=12）1.359±0.346 14.870±2.710 0.121±0.174 0.288±0.179 0.053±0.119 60.269±5.344 58.978±6.002 12.050±1.587 3.000±0.000 3.339±0.290

4 討論

本研究前期建立了ELISA法測定Beagle犬血漿中重組水蛭素的濃度，且經驗證，內源性物質不干擾重組水蛭素的測定。該方法特異性高，回收率、精密度和定量下限以及樣品稀釋后再測定結果均符合新藥藥動學的實驗要求。

本實驗比較了單次iv重組水蛭素注射液和單次ig重組水蛭素腸溶膠囊在犬體內的藥物動學特征。結果發現，重組水蛭素無論ig還是iv，在犬體內均符合二室模型，單次ig的tpeak為（2.105±0.243）h，表明藥物吸收迅速。重組水蛭素腸溶膠囊的F為（14.908±1.868）%，表明重組水蛭素腸溶膠囊可一定程度被吸收入血。本實驗還比較了單次ig和多次ig重組水蛭素腸溶膠囊在犬體內的藥動學特征。結果發現，單次ig和多次ig后犬體內重組水蛭素的cmax差異無統計學意義（P＞0.05）；雖多次ig后的AUC0-1440min和AUC0-∞與單次ig相比略有提高，但差異無統計學意義（P＞0.05），表明重組水蛭素腸溶膠囊每天服藥1次，在體內不產生蓄積，連續服藥也不會改變重組水蛭素腸溶膠囊的藥動學特征。

本研究采用ELISA法測定了Beagle犬血漿中的重組水蛭素，首次報道了單次、多次口服重組水蛭素腸溶膠囊在Beagle犬體內的藥動學情況，并計算獲得重組水蛭素腸溶膠囊的絕對生物利用度，為重組水蛭素的臨床研究提供了參考。

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（編輯：鄒麗娟）

Study on the Pharmacokinetics of Recombinant Hirudin Enteric-coated Capsule by Single and Multiple Administration in Beagle Dogs

YANG Hui1，ZHOU Yuanda1，HE Haixia1，FAN Kai2（1.Dept.of Pharmacy，the First Affiliated Hospital of Chongqing Medical University，Chongqing 400016，China；2.Chongqing Fagen Biological Pharmaceutical Co.，Ltd.，Chong-qing 400054，China）

OBJECTIVE：To study the pharmacokinetic characteristics of Recombinant hirudin enteric-coated capsule by single and multiple administration in Beagle dogs.METHODS：12 Beagle dogs were divided into single ig group and single iv group by random control method，6 in each group.Recombinant hirudin 0.2 mg/kg was intragastrically administrated or intravenously injected，blood sample was collected；after 2 weeks of cleaning，12 dogs were intragastrically administrated recombinant hirudin 0.2 mg/kg，for 7 d.Sample blood was collected，referred to multiple ig group.Recombinant hirudin concentration in plasma was determined by enzyme-linked immunosorbent assay，and pharmacokinetic parameters were calculated by DAS 2.0 software.RESULTS：The results showed that pharmacokinetics by ig and iv recombinant hirudin in Beagle dogs fitted to two-compartment model，absolute bioavailability of ig Recombinant hirudin enteric-coated capsule was（14.908±1.868）%；the pharmacokinetic parameters in single ig group and multiple ig group were tpeakof（2.105±0.243），（3.000±0.000）h，t1/2βof（8.660±2.965），（14.870±2.710）h，cmaxof（10.700±0.872），（12.05±1.587）ng/mL，AUC0-1440minof（55.250±4.386），（58.978±6.002）ng·h/mL，without statistical significances in two groups（P＞0.05）.CONCLUSIONS：The ig Recombinant hirudin enteric-coated capsule can be absorbed into the blood to a certain extent.There is no accumulation for ig Recombinant hirudin enteric-coated capsule for several days，and it dose not change the pharmacokinetic characteristics.

Recombinant hirudin；Enteric-coated capsule；Injection；Single administration；Multiple administration；Pharmacokinetics；Beagle dogs

R965

A

1001-0408（2017）07-0916-03

2016-11-03

2016-12-29）

＊主管藥師，博士。研究方向：新藥研發、醫院藥學。電話：023-89012224。E-mail：yanghui_023@126.com

DOI10.6039/j.issn.1001-0408.2017.07.15