寒地冬小麥 TaEXPA7同源基因的遺傳轉化及其功能分析

趙梓頤，徐永清，董佳敏，武佳文，彭麗娜，馮 旭，馮珊珊，胡寶忠，2，李鳳蘭

(1.東北農業大學生命科學學院，黑龍江哈爾濱 150030；2.哈爾濱學院，黑龍江哈爾濱 150086)

膨脹素蛋白(expansin)于1992年在黃瓜(Cucumissativus)的下胚軸中首次被發現，其以非酶活性作用機制并在酸性環境條件下可以松弛植物的細胞壁[1]。在植物中，Expansin超家族被分成四個亞家族，分別為α-expansin(EXPA)、β-expansin(EXPB)、expansin-like A(EXLA)和expansin-like B(EXLB)，家族成員之間相對保守，氨基酸序列同源性介于20%～25%之間[2]。研究表明，膨脹素在植物生長發育中發揮著重要的作用，包括營養生長、根的伸長、花的發育、果實成熟及軟化、種子結實量等[3]。

非生物脅迫引起的細胞壁修飾是植物適應環境的重要組成表現，而細胞壁形態和結構的改變是由膨脹素等細胞壁修飾蛋白所調節，因此膨脹素也廣泛地參與了植物對外界非生物脅迫的響應[4]。在玉米(Zeamays)和水稻(Oryzasativa)中，膨脹素基因的表達受水分脅迫所誘導[5]；在脫水的玫瑰(Rosahybrida)花瓣中，膨脹素基因RhEXPA4的表達顯著上調[6]；大麥(Hordeumvulgare)中的膨脹素基因HvEXPB7通過促進根毛的生長來提高植物干旱脅迫的耐受性[7]。

低溫脅迫使農作物減產造成嚴重的經濟損失，東農冬麥2號(D2)作為高抗寒的冬小麥品種，具有寶貴的抗寒基因資源[8]。本課題組前期研究結果顯示，D2中膨脹素基因TaEXPB7-B的表達在D2中受低溫脅迫下的ABA信號傳導途徑所調控，且過表達TaEXPB7-B、TaEXPA8-B/D基因顯著促進了擬南芥的生長和低溫脅迫耐受性[9-10]。Zhang等[11]對小麥進行全基因組分析后鑒定出128個膨脹素基因，其中TaEXPA7-A/B/D基因作為其中的成員已被證實參與冬小麥對外界低溫脅迫的響應。董佳敏等[12]在D2中克隆了TaEXPA7-A/B/D三個基因，并證明了這三個基因的表達可能與D2的根系建成及低溫脅迫耐受性相關。

為進一步揭示TaEXPA7-A/B/D基因的功能，本研究利用農桿菌介導的方法，將TaEXPA7-A/B/D三個基因分別轉入模式植株擬南芥中，同時探討了TaEXPA7-A/B/D基因對植物生長和低溫耐受性的影響，以期為冬小麥膨脹素的研究提供新的理論基礎，也同時為作物分子育種提供優質的基因資源。

1 材料與方法

1.1 植物材料

試驗所用擬南芥品種為哥倫比亞(Colombia)野生型擬南芥，由東北農業大學生命學院植物資源與分子生物學實驗室提供。

1.2 載體及菌株

1.3 試驗方法

1.3.1 pBI121-TaEXPA7-A/B/D表達載體的構建

通過PCR在TaEXPA7-A/B/D三個基因的上下游分別添加XbaI和BamHI酶切位點，所用引物見表1所示。利用限制性內切酶XbaI和BamHI對上述PCR產物和pBI121質粒進行雙酶切，酶切產物經連接后轉化大腸桿菌，進行菌落PCR檢測并送交測序。

1.3.2 載體轉化農桿菌

分別將pBI121-TaEXPA7-A/B/D三個表達載體轉化至根癌農桿菌LBA4404中，對陽性菌落進行PCR鑒定，所用引物見表1。

1.3.3 擬南芥的遺傳轉化

通過農桿菌介導的方法轉化擬南芥，步驟參考Feng等[9]的方法。陽性轉基因植株的鑒定參考Peng等[10]的方法，通過RT-PCR對T1代植株進行鑒定，所用引物見表1。

表1 TaEXPA7-A/B/D基因添加XbaI和BamHI酶切位點所用引物信息

1.3.4 轉基因擬南芥的形態學觀察

分別將野生型(WT)和轉基因擬南芥的種子播種于1/2 MS固體培養基上，7 d后觀察植株根部的生長狀態并測定根長，待植株生長至4葉期后播種于營養缽(營養土∶蛭石=1∶1)中并放置在光照培養箱中培養(16/8 h光周期，25/20 ℃晝夜溫度)，15 d后觀察葉片生長情況，30 d后觀察并測定株高，花序出現后分別統計花后1～3周單個植株的花序和角果數目。對于側根的觀察，擬南芥種子播種于1/2 MS垂直板上，10 d后觀察并統計植株的側根數目。

1.3.5 低溫脅迫下轉基因擬南芥生理指標的 影響

擬南芥的種植方法同1.3.4，取生長40 d且長勢一致的植株置于4 ℃培養箱中，分別于處理后0、3、6 d剪取擬南芥葉片。超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化物酶(POD)和過氧化氫酶(CAT)的活性，以及丙二醛(MDA)、脯氨酸(Pro)和可溶性糖含量的測定均按照試劑盒(蘇州科銘生物技術有限公司)的方法。

1.4 數據分析

所有試驗均至少重復3次(n=9)，數據顯示為平均值±SD，GraphPad Prism 5用于差異顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 pBI121- TaEXPA7-A/B/D表達載體的構建

在TaEXPA7-A/B/D三個基因的上下游分別添加XbaI和BamHI酶切位點，PCR結果如圖1所示。對pBI121及上述PCR產物進行雙酶切并連接，連接產物轉化大腸桿菌后，提取菌落進行PCR并測序，陽性菌落的PCR檢測結果如圖2所示。將測序結果正確的pBI121-TaEXPA7-A/B/D質粒分別轉化至農桿菌中，陽性菌落的PCR鑒定結果如圖3所示。條帶大小與圖1和圖2一致，說明TaEXPA7-A/B/D三個基因成功整合進植物表達載體中。

M：DNA分子量標準2000；1： TaEXPA7-A； TaEXPA7-B； TaEXPA7-D。

M：DNA分子量標準2000；1：pBI121-TaEXPA7-A；2：pBI121-TaEXPA7-B；3：pBI121-TaEXPA7-D。圖3同。

2.2 轉基因擬南芥的鑒定

對轉基因擬南芥T1代植株的RT-PCR鑒定結果如圖4所示，結果表明TaEXPA7-A/B/D三個基因已成功轉化至擬南芥中并表達。

M：DNA分子量標準2000；1：野生型(WT)植株；2和3： TaEXPA7-A轉基因植株；4和5： TaEXPA7-B轉基因植株；6和7： TaEXPA7-D轉基因植株。

2.3 過表達 TaEXPA7-A/B/D基因擬南芥的形態學分析

對在培養基上生長7 d的擬南芥植株進行根部觀察，并測定根長，結果(圖5，表2)顯示，TaEXPA7-A/B/D三個基因的過表達顯著促進了植株根的伸長和根毛的生長。對在垂直板上生長10 d的擬南芥植株進行側根觀察，并統計側根數目，結果(圖6，表2)顯示，過表達TaEXPA7-A/B/D三個基因植株的平均側根數目分別為 40.00、46.00和35.67，均顯著高于野生型。TaEXPA7-A/B/D三個基因對擬南芥葉片生長及株高的影響。結果(圖7，表2)表明，轉基因植株的葉片數目顯著多于野生型，且TaEXPA7-A/B/D三個基因轉基因植株的株高相比于野生型分別顯著增加了10.18%、20.25%和8.89%。TaEXPA7-A/B/D三個基因的過表達對轉基因擬南芥花序和角果數目的影響。結果(表3)顯示，轉基因擬南芥植株在花后1～2周的花序數和角果數均顯著低于野生型；而花后3周，轉基因擬南芥的花序和角果生長迅速，過表達TaEXPA7-A/B兩個基因擬南芥的花序數目和過表達TaEXPA7-A/D兩個基因擬南芥的角果數均顯著高于野生型。

表3 野生型和過表達 TaEXPA7-A/B/D基因擬南芥植株花序和角果數目的比較

表2 野生型和過表達 TaEXPA7-A/B/D基因擬南芥植株主要特征性狀的比較

A為葉片形態；B為株高表型。

圖6 TaEXPA7-A/B/D基因對轉基因擬南芥側根生長的影響

A：根長形態；B和C：根毛的生長狀態。

2.4 TaEXPA7-A/B/D基因對擬南芥在低溫脅迫下生理指標的影響

對野生型和過表達TaEXPA7-A/B/D三個基因擬南芥植株在4 ℃處理下的生理指標進行了測定，結果(表4)顯示，轉基因植株中抗氧化酶SOD、POD及CAT的活性相比于野生型在正常生長條件和4 ℃處理下均維持在較高的水平，且MDA的積累量較低。在低溫處理6 d后，過表達TaEXPA7-A/B/D三個基因擬南芥中SOD的活性分別為590.18、691.44和610.94 U·g-1，均顯著高于野生型。低溫處理3 d后，野生型植株中POD的活性提高了115.91%，為950 U·g-1，分別為轉TaEXPA7-A/B/D基因植株的 25.13%、27.86%和21.49%。過表達TaEXPA7-A/B/D三個基因擬南芥中MDA的含量在處理后6 d分別為11.61、12.56和11.95 nmol·g-1，均顯著低于野生型。正常生長條件下野生型及轉基因植株中脯氨酸的含量并無顯著差異，但在低溫處理3 d后過表達TaEXPA7-A植株中脯氨酸的含量顯著增加，為野生型的1.42倍。植株中可溶性糖含量的測定結果顯示，正常生長條件下轉基因植株中的含量均維持在較低的水平，顯著低于野生型；但隨低溫處理時間的延長，野生型植株中的含量逐漸下降，而轉基因植株中則呈現上升的趨勢，在處理后6 d轉TaEXPA7-A/B/D三個基因擬南芥中可溶性糖的含量均顯著高于野生型，分別為5.63、6.64和5.35 mg·g-1。

表4 低溫脅迫下野生型和過表達 TaEXPA7-A/B/D基因擬南芥植株中生理指標的測定結果

3 討 論

膨脹素基因的過表達能夠促進植物的生長，這一觀點已經被很多研究所證實，如在擬南芥中過表達玫瑰的膨脹素基因RhEXPA4能夠增加植株的側根數[13]；水稻中OsEXPB2基因可以通過調控細胞的生長以影響植株根系的發育。本研究的結果顯示，TaEXPA7-A/B/D基因的過表達顯著促進了擬南芥的生長，轉基因植株的根長、側根數目、葉片數目和株高均顯著高于野生型。在植物中，根系負責吸收養分和水分，為植株的生長發育提供能量并起固定和支撐地上部分的作用[14]。茂密的側根可以使植物更好地吸收營養，從而在一定程度上提高其對高溫、干旱等非生物脅迫的耐受性[15]，因此TaEXPA7-A/B/D基因可以作為農業分子育種的候選基因資源。也有研究表明，膨脹素基因能夠影響植物花的發育及種子的產量，如在紫茉莉(Mirabilisjalapa)中，不同的α-膨脹素基因分別參與了花的生長、盛開和衰敗的過程[16]；在煙草(Nicotianatabacum)中，過表達小麥膨脹素基因TaEXPA2不僅顯著增加了煙草種子結實量而且增加了種子的體積[17]。本研究證明了TaEXPA7-A/B/D三個基因對擬南芥花序和角果的發育均起顯著的促進作用，表明該基因對提高農作物產量具有潛在的應用價值。

研究表明，膨脹素基因還可以提高植物對外界非生物脅迫的耐受性，如過表達小麥膨脹素基因TaEXPB23顯著降低了轉基因煙草在干旱脅迫下的失水速度[18]；在擬南芥中過表達AtEXPA2基因增加了植株對鹽脅迫的耐受性，而敲除該基因的突變體植株則呈現相反的表型[19]；從冬小麥D2中分離的膨脹素基因TaEXPB7-B顯著提高了轉基因擬南芥對低溫脅迫的耐受性和存活率，且轉基因植株中抗氧化酶的活性及滲透調節物質的含量與野生型相比均維持在較高水平[9]。本研究結果顯示，過表達TaEXPA7-A/B/D三個基因擬南芥植株在低溫脅迫下抗氧化酶SOD、POD和CAT的活性和可溶性糖的含量均顯著高于野生型，MDA的積累量也較低，與前人研究結果一致。抗氧化酶能夠及時清除低溫脅迫下植物細胞中所產生的大量自由基和活性氧，對維持膜系統穩定性起到關鍵的作用[20]。可溶性糖作為滲透調節物質之一，對于維持低溫脅迫下植物細胞中滲透壓的穩定具有重要作用[21]。因此，TaEXPA7-A/B/D三個基因可以增加轉基因擬南芥對低溫脅迫的耐受能力，但該基因影響抗氧化酶活性和相關滲透調節物質含量的分子機制還需進一步研究。