復合食用菌多糖的免疫活性研究

李志濤，趙娟娟，王敏，郭繼平，朱冰清

（衡水學院生命科學系，河北衡水053000）

復合食用菌多糖的免疫活性研究

李志濤，趙娟娟，王敏，郭繼平，朱冰清

（衡水學院生命科學系，河北衡水053000）

研究了香菇、靈芝、平菇多糖按一定的比例混合得到的復合食用菌多糖對小鼠免疫活性的影響。小鼠脾淋巴細胞增殖試驗結果表明，復合食用菌多糖在低劑量下即對小鼠細胞免疫功能有顯著提高作用；非特異性免疫試驗結果表明，對小鼠的非特異性免疫功能只有在中劑量組和高劑量組才顯示出增強作用；體液免疫試驗結果表明，復合多糖在低劑量下即對小鼠體液免疫功能有顯著提高作用。動物體外試驗和體內試驗結果表明，在適當的劑量范圍內，與單一食用菌多糖相比，食用菌復合多糖具有較好的免疫調節功能。

食用菌；復合多糖；免疫活性

國內一些研究表明香菇多糖、靈芝多糖、平菇多糖均具有提高免疫能力的作用[1-3]。目前對食用菌多糖的免疫活性研究主要集中在研究單一食用菌多糖方面，而對復合多糖的免疫活性的研究很少。本文研究了香菇、靈芝、平菇多糖以一定比例復合后的復合食用菌多糖的免疫活性，為將來進一步將其開發成免疫調節劑提供參考。

1材料與方法

1.1試驗材料

香菇、靈芝、平菇：市售。

1月齡清潔級小鼠[體重（20±2）g]：由天津醫科大學提供。

RPMI1640完全培養液：Gibco公司；刀豆蛋白：Sigma公司；噻唑藍：Sigma公司；臺盼藍：Amresco公司；胎牛血清：中國醫學科學院生物工程研究所。

1.2試驗儀器

FA1104A型電子天平：上海精天電子儀器有限公司；Finnpipette移液器（100μL～1 000μL）：熱電（上海）儀器有限公司；EMS-9B型加熱磁力攪拌器：天津歐諾儀器儀表有限公司；SW-CJ-1FD型單人單面潔凈化工作臺：蘇州凈化設備有限公司；752型分光光度計：上海光譜儀器有限公司。

1.3試驗方法

將香菇、靈芝、平菇分別通過沸水浸提，95%乙醇沉淀后，經冷凍干燥得粗多糖。根據3種粗多糖中的活性多糖含量，將3種多糖分別按質量比1∶0.5∶1的比例混合得到復合食用菌多糖。測定該復合多糖的含量為7.1%。

1.3.1細胞免疫試驗

參照毛學英[4]的方法進行試驗。細胞培養以及OD值（光密度）的測定：將小鼠處死，取脾臟制備細胞懸液。在酶標板的每個孔加100μL細胞懸液，然后加入20μL完全培養液作為陰性對照；加10μL完全培養液，10μLCon A（刀豆蛋白A）作為陽性對照；取香菇多糖、靈芝多糖、平菇多糖、復合食用菌多糖分別配制成低、中、高劑量（分別為0.1、0.5、1mg/mL）組，陽性試驗孔上同時加入10μLConA和10μL樣品，在CO2培養箱（37℃、5%CO2）中進行孵育72h。在培養結束前7小時時每個孔加入10μLMTT（噻唑藍，劑量為5mg/mL），培養結束以后每個孔加100μL 10%的SDS（十二烷基硫酸鈉），然后測OD490nm值。免疫調節活性用刺激指數（Stimulate index，SI）來表示。SI值越大，代表樣品免疫調節活性越強。

1.3.2非特異性免疫試驗

用碳粒廓清試驗[5]檢測4種樣品對小鼠的非特異性免疫的影響。

將78只小鼠隨機分成13組，每組為6只。取香菇多糖、靈芝多糖、平菇多糖、復合食用菌多糖分別配制成低、中、高劑量（分別為0.1、0.5、1mg/mL）組，以生理鹽水作為對照。每天灌胃1次，直至15天后結束。最后一次灌胃一天后，用印度墨汁對尾靜脈進行注射，每只小鼠體重注射0.2mL墨汁，在注入后的第2、10分鐘，分別從內眥靜脈叢中取血20μL，然后加入到2mL 0.1% Na2CO3當中。用0.1%Na2CO3為空白對照，測OD600nm值。試驗結束以后稱量小鼠的體重、肝重、脾臟重。計算吞噬速率（K）、校正吞噬指數（a）：

式中：t1、t2分別表示第2、10分鐘的采血時間；OD1和OD2分別表示t1和t2時對應樣品的OD600nm。

1.3.3體液免疫試驗

用定量溶血分光光度法[6]測小鼠脾臟抗體形成細胞生成含量。

試驗小鼠分組的方法與灌胃劑量與1.3.2試驗相同。每組為8只小鼠，每天灌胃1次，30天后灌胃結束。試驗結束前5天，對小鼠腹腔注射2%的綿羊紅細胞進行免疫。對小鼠進行免疫后，通過檢測溶血過程中血紅蛋白的量來反映其抗體產生的水平，在一定程度上能夠代表機體的體液免疫水平[7]。試驗結束后，取小鼠的脾臟研磨，PBS（磷酸鹽緩沖液）洗滌。離心10min（轉速為2 000 r/min），取沉淀，之后加入1mL紅細胞裂解液，靜置10min后再次離心，加入2mLPBS懸浮。采用臺盼藍染色法使細胞的劑量為5×106CFU/mL。取該懸液0.5mL，分別取1mL 0.2%的SRBC（綿羊紅細胞）和10%的豚鼠血清加入其中，對照組中不加懸液，用PBS補充。在37℃下溫育，1 h后離心10min（轉速為2 500 r/min），取其上清液，測OD430nm值。用OD430nm表示脾臟抗體形成細胞生成含量。

2結果與分析

2.1細胞免疫試驗

4種樣品在不同劑量下對小鼠脾淋巴細胞增殖活性影響如表1所示。

表1 4種樣品在不同劑量下對小鼠脾淋巴細胞免疫調節活性的影響Table1 Effectsof different dosagesof four kindsof sampleson sp lenic lymphocytemultiplication

從表1所示可以看出，低、中、高劑量的香菇多糖、靈芝多糖、平菇多糖、復合食用菌多糖與對照組相比刺激指數差異都顯著（P＜0.05），這表明了4種樣品在不同劑量下對小鼠脾淋巴細胞增殖活性均有一定的促進作用。當復合多糖劑量為0.5mg/mL時，與香菇多糖、靈芝多糖、平菇多糖相比刺激指數差異都顯著（P＜0.05），與其他樣品相比免疫調節活性最高，表明在適當的劑量范圍內，與單一食用菌多糖相比，復合食用菌多糖具有較好的免疫調節功能；但是當劑量在超過0.5mg/mL時，免疫調節活性沒有相應的提高，卻呈下降的趨勢，對小鼠脾淋巴細胞增殖呈現一定的濃度效應，表明復合多糖的劑量過高，并不能夠相應地提高小鼠的細胞免疫調節活性，這說明劑量與提高小鼠的細胞免疫調節活性沒有線性關系，導致這種情況發生的原因還有待于進一步研究。

2.2非特異性免疫試驗

當細菌等外源性物質進入機體以后，可迅速被單核-巨噬細胞吞噬和清除，因此，巨噬細胞校正吞噬指數的多少可以反映吞噬功能的強弱[4]。4種樣品在不同劑量下對小鼠吞噬細胞吞噬能力的影響如表2所示。

表2 4種樣品在不同劑量下對小鼠吞噬細胞吞噬能力的影響Table2 Effectsof different dosagesof four kindsof sampleson phagocytosisability ofmacrophage

由表2可以看出，低劑量的香菇多糖、靈芝多糖、平菇多糖、復合食用菌多糖與對照組相比差異不顯著，中劑量組和高劑量組與對照組相比差異顯著（P＜0.05），表明4種低劑量樣品不能顯著提高小鼠清除碳顆粒的能力，不能對小鼠的免疫力產生良好的效應，而中、高劑量樣品能顯著提高小鼠清除碳顆粒的能力，可能是食用菌多糖可以激活處于抑制狀態的巨噬細胞，又能夠顯著提高已經處于活化狀態的巨噬細胞的功能，從而增強小鼠的非特異性免疫功能。中、高劑量復合食用菌多糖與香菇多糖、靈芝多糖、平菇多糖相比差異顯著（P＜0.05），其校正吞噬指數最高，對小鼠吞噬細胞吞噬碳顆粒的能力顯著提高。由試驗結果可知，當復合食用菌多糖達到一定劑量后，隨著劑量的增加能顯著提高小鼠清除碳顆粒的能力。

2.3體液免疫試驗

在小鼠的腹腔內注射綿羊紅細胞后，其B淋巴細胞會產生抗綿羊紅細胞抗體，通過補體的參與使細胞溶解，然后通過檢測血紅蛋白的含量反映抗體產生水平，以此代表機體的體液免疫水平[7]。4種樣品在不同劑量下小鼠脾臟抗體形成細胞生成含量的影響如表3所示。

表3 4種樣品在不同劑量下對小鼠脾臟抗體形成細胞生成含量的影響Table3 Effectsof different dosagesof four kindsof sam pleson productiveability of splenic antibody form ing cells inm ice

由表3可以看出，低、中、高劑量的香菇多糖、靈芝多糖、平菇多糖、復合食用菌多糖與對照組相比，小鼠抗體細胞生成含量差異顯著（P＜0.05），這表明4種樣品在不同劑量下對小鼠抗體細胞生成含量均有促進作用。高劑量復合食用菌多糖與香菇多糖、靈芝多糖、平菇多糖相比差異顯著（P＜0.05）。由試驗結果可以看出，當樣品達到一定劑量后，隨著灌胃劑量的增加，樣品對小鼠抗體細胞生成含量的影響逐漸提高，尤其是復合食用菌多糖提高最明顯，這表明復合食用菌多糖對機體體液免疫具有正調節作用。

3討論

評價一種樣品對機體免疫功能影響，至少要觀察細胞免疫、非特異性免疫與體液免疫各一種，才能確認其對免疫功能的影響。本文就這3個方面考察了3種單一食用菌多糖和復合食用菌多糖對正常小鼠免疫功能的影響。本試驗研究表明，復合食用菌多糖在低劑量下即對小鼠細胞免疫功能、體液免疫功能有顯著提高作用，但對小鼠的非特異性免疫功能只有在中劑量組和高劑量組才顯示出增強作用，動物體外試驗和體內試驗結果表明，將香菇、靈芝、平菇多糖按一定比例復合后，在適當的劑量下，與單一食用菌多糖相比，復合食用菌多糖能顯著提高小鼠的免疫功能，以上結果說明復合食用菌多糖具有較好的免疫調節功能。復合食用菌多糖比單一食用菌多糖對小鼠免疫功能提高明顯，這可能是3種單一食用菌多糖復合后能相互補充，起到了協同增效的效果，這種情況發生的機理還有待于進一步研究。

[1]王頔,奚香君,王進進,等.寧心紅杞和香菇多糖對小鼠免疫及內分泌功能影響的比較研究[J].中華中醫藥學刊,2013,31(10): 2171-2174

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[6]張儒珍,嚴俊,傅翠梅.定量溶血分光光度法體外檢測B細胞功能[J].臨床檢驗雜志,1987,5(4):182-183

[7]張紹章,田瓊,李予蓉,等.蚯蚓提取物對小鼠脾臟抗體形成細胞的影響[J].第四軍醫大學學報,1993,14(5):350-352

Study on the Immune Effects of Edible Fungus Polysaccharides Compounds

LIZhi-tao，ZHAO Juan-juan，WANGMin，GUO Ji-ping，ZHUBing-qing
（Departmentof Life Science，HengshuiUniversity，Hengshui053000，Hebei，China）

Thisstudywasperformed to determinate immunoregulatory activity of themixture ofpolysaccharides of Lentinus edodes，Ganoderma luncidum and Pleurotus ostreatus.Splenic lymphocyte immunity：in the situation of low doses，polysaccharides compounds significantly promoted the splenic lymphocyte immunity inmice.Non-special immunity：polysaccharides compoundsonly atbothmedium and high doses significantly promoted the non-special immunity in mice.Humoral immunity：in the situation of low doses，polysaccharides compounds significantly promoted the humoral immunity inmice.All of the animal test showed thatedible fungus polysaccharides compounds significantly promoted the immunologic function inmice.atmoderate dose comparingwith single edible funguspolysaccharide.

edible fungus；polysaccharidescompounds；immunoregulatoryactivity

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.05.009

2016-09-10

李志濤（1983—），男（漢），講師，碩士，研究方向：食品科學。