兩種方法檢測丙型肝炎病毒抗體的一致性比較

趙子賢，李娟紅，蘇宏釗，曾鳳群，何健祥

(南方醫(yī)科大學(xué)附屬新會醫(yī)院輸血科1、檢驗科2、耳鼻喉科3，廣東 江門 529100)

兩種方法檢測丙型肝炎病毒抗體的一致性比較

趙子賢1，李娟紅2，蘇宏釗3，曾鳳群2，何健祥2

(南方醫(yī)科大學(xué)附屬新會醫(yī)院輸血科1、檢驗科2、耳鼻喉科3，廣東 江門 529100)

目的 用Kappa檢驗分析兩種方法檢測丙型肝炎病毒(hepatitis C virus，HCV)抗體的一致性，為安全輸血提供最佳的HCV抗體篩查方法。方法選取2015年2月至2016年6月在我院就治而有可能需輸血患者的丙型肝炎病毒抗體待檢標(biāo)本，用膠體金法HCV抗體檢測試劑盒檢測，將可疑結(jié)果和陽性結(jié)果標(biāo)本再用酶聯(lián)免疫吸附試驗HCV抗體診斷試劑盒(ELISA)和化學(xué)發(fā)學(xué)測定法HCV抗體檢測試劑盒CLIA)分別進(jìn)行復(fù)檢。用SPSS17.0軟件分別對可疑和陽性結(jié)果、可疑結(jié)果、陽性結(jié)果進(jìn)行Kappa分析一致性程度，并用U檢驗對Kappa系數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計分析。結(jié)果膠體金法HCV抗體檢測試劑盒檢測全部標(biāo)本共448例可疑陽性和陽性結(jié)果，其中112例為可疑結(jié)果，336例為陽性結(jié)果；用ELISA方法檢測448例初檢為可疑和陽性結(jié)果，結(jié)果為陰性、可疑和陽性的例數(shù)分別是54例(12%)、18例(4%)、376例(84%)，用CLIA方法檢測結(jié)果分別為42例(9.4%)、11例(2.5%)、395例(88.1%)；用ELISA方法檢測112例初檢為可疑陽性結(jié)果，結(jié)果為陰性、可疑和陽性的例數(shù)分別是11例(9.8%)、30例(26.8%)、71例(63.4%)，用CLIA方法檢測結(jié)果分別為13例(11.6%)、21例(18.7%)、78例(69.7%)；用ELISA方法檢測336例初檢為陽性結(jié)果，結(jié)果為陰性、可疑和陽性的例數(shù)分別是12例(3.6%)、28例(8.3%)、296例(88.1%)，用CLIA方法檢測結(jié)果分別為11例(3.3%)、19例(5.6%)、306例(91.1%)。兩種方法對可疑和陽性標(biāo)本、可疑標(biāo)本、陽性標(biāo)本的Kappa系數(shù)分別為Kappa=0.730(u=16.22，P＜0.01)、Kappa=0.497(u=6.81，P＜0.05)、Kappa=0.705(u=11.56，P＜0.01)。結(jié)論兩種方法對可疑和陽性標(biāo)本、陽性標(biāo)本的檢測結(jié)果有較好的一致性，而對可疑標(biāo)本的檢測結(jié)果一致性為中等，對可疑陽性結(jié)果應(yīng)用更為敏感和特異的試驗驗證。

丙型肝炎病毒抗體；酶聯(lián)免疫吸附試驗；化學(xué)發(fā)光測定法；Kappa檢驗

在臨床上丙型肝炎病毒(HCV)感染是一種常見且傳染范圍比較廣的感染性疾病[1-2]。據(jù)調(diào)查顯示，約一半HCV感染患者可轉(zhuǎn)化為慢性肝炎，甚至可轉(zhuǎn)變?yōu)楦斡不蚋渭?xì)胞性肝癌[3]。我國的HCV感染途徑主要是經(jīng)輸血傳播，特別是反復(fù)輸入多個獻(xiàn)血員的血制品。隨著輸血醫(yī)學(xué)的發(fā)展，輸血所帶來的感染日益?zhèn)涫苤匾暎环矫媸轻槍颊叩脑缙诜乐危硪环矫媸墙档歪t(yī)療糾紛的發(fā)生和防止醫(yī)護(hù)人員職業(yè)暴露[4]。目前HCV感染的檢測方法有膠體金法、ELISA、CLIA和核酸擴增試驗法等[5]，各種檢測方法因方法學(xué)原理不同和商家試劑的靈敏度和特異性不同，使產(chǎn)品說明書中提供的臨界值(cut-off)值存在差別[6]，導(dǎo)致同一份標(biāo)本可能得出不同的檢測結(jié)果。本文用Kappa檢驗分析ELISA和CLIA兩種方法檢測HCV抗體結(jié)果的一致性，現(xiàn)報道如下：

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集本院2015年2月至2016年6月輸血前、手術(shù)前需檢測HCV抗體患者共22 426例，其中男性11 824例(52.7%)，女性10 602例(47.3%)年齡8～92歲，平均(55±18.12)歲。分別用促凝管抽取靜脈血，離心獲取血清待檢。

1.2 儀器與試劑 ①儀器：由瑞士 Tecan Schweiz AG公司生產(chǎn)的全自動酶免分析儀(Freedom EVOLyze)，由北京科美生物有限公司生產(chǎn)的科美東雅化學(xué)發(fā)光分析儀(CHEMCLI600)；②試劑：由英科新創(chuàng)科技有限公司生產(chǎn)的丙型肝炎病毒抗體檢測試劑盒(膠體金法)，由珠海麗珠試劑股份有限公司生產(chǎn)的丙型肝炎病毒抗體診斷試劑盒(ELISA法)，由北京科美生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)丙型肝炎病毒抗體檢測試劑盒(CLIA法)。

1.3 方法 把全部標(biāo)本先用膠體金法進(jìn)行初檢，將初檢結(jié)果中的可疑結(jié)果、陽性結(jié)果平行利用ELISA法和CLIA法進(jìn)行復(fù)檢。結(jié)果的判斷：①ELISA法：臨界值(cut-off)=陰性對照平均A值+0.12，樣品A值cut-off值為HCV抗體陽性，樣品A值＜臨界值為HCV抗體陰性。②CLIA法：臨界值(cut-off)=2.1×陰性對照發(fā)光值(RLU)的平均值，待測樣本的RLU值≥cut-off值為有反應(yīng)性，待測樣本的RLU值＜臨界值為無反應(yīng)性。實驗操作均嚴(yán)格按試劑說明書進(jìn)行。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 用SPSS17.0軟件包對復(fù)檢結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計分析。用Kappa檢驗分析兩種方法檢測丙型肝炎病毒抗體的一致性，用U檢驗對Kappa值進(jìn)行假設(shè)檢驗，以P=0.05為檢驗水平。0.2＜Kappa≤0.4，一致性水平為一般；0.4＜Kappa≤0.6，一致性水平為中等；0.6＜Kappa≤0.8，一致性水平為好。

2 結(jié) 果

2.1 膠體金法初檢 2015年2月至2016年6月輸血前、手術(shù)前需檢測HCV抗體患者共22 426例，用膠體金法HCV抗體檢測試劑盒進(jìn)行初檢，共448例可疑和陽性結(jié)果，其中112例為可疑結(jié)果，336例為陽性結(jié)果，其余為陰性結(jié)果，陽性率為1.50%。

2.2 兩種方法平行測試初檢HCV抗體為可疑陽性和陽性結(jié)果的一致性 膠體金法HCV抗體檢測初檢的可疑結(jié)果和陽性結(jié)果共448例，分別用ELISA和CLIA兩種方法平行測試復(fù)檢，ELISA法結(jié)果為陰性、可疑和陽性的例數(shù)分別為54例(12%)、18例(4%)、376例(84%)，CLIA法結(jié)果分別為42例(9.4%)、11例(2.5%)、395例(88.1%)，兩種方法針對可疑陽性和陽性結(jié)果的Kappa系數(shù)為0.730，經(jīng)U檢驗，P＜0.01，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，認(rèn)為兩者一致性強度為好，見表1。

表1 兩種方法平行測試HCV抗體可疑陽性和陽性結(jié)果的測試結(jié)果(n=448，例)

2.3 兩種方法平行測試初檢HCV抗體為可疑陽性結(jié)果的一致性 膠體金法HCV抗體檢測初檢的可疑陽性結(jié)果共112例，分別用ELISA和CLIA兩種方法平行測試復(fù)檢，ELISA法結(jié)果為陰性、可疑和陽性的例數(shù)分別是11例(9.8%)、30例(26.8%)、71例(63.4%)，用CLIA法檢測結(jié)果分別為13例(11.6%)、21例(18.7%)、78例(69.7%)。兩種方法針對可疑陽性結(jié)果的Kappa系數(shù)為0.497，經(jīng)U檢驗，P＜0.05，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，認(rèn)為兩者一致性強度為中等，見表2。

表2 兩種方法平行測試HCV抗體可疑陽性的測試結(jié)果(n=112，例)

2.4 兩種方法平行測試初檢HCV抗體為陽性結(jié)果的一致性 膠體金法HCV抗體檢測初檢的陽性結(jié)果共336例，分別用ELISA和CLIA兩種方法平行測試復(fù)檢，ELISA法結(jié)果為陰性、可疑和陽性分別為12例(3.6%)、28例(8.3%)、296例(88.1%)，用CLIA法檢測結(jié)果分別為11例(3.3%)、19例(5.6%)、306例(91.1%)。兩種方法針對陽性結(jié)果的Kappa系數(shù)為0.705，經(jīng)U檢驗，P＜0.01，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，認(rèn)為兩者一致性強度為好，見表3。

表3 兩種方法平行測試HCV抗體陽性的測試結(jié)果（n=336，例）

3 討 論

由HCV感染引起的丙型肝炎是我國比較常見的傳染病之一，它主要通過輸血傳播并且對人類健康造成極大危害。目前絕大多數(shù)醫(yī)院開展了HCV檢測，只要用于輸血前、術(shù)前、懷孕前檢查等[7]。調(diào)查研究顯示，我國每年新發(fā)現(xiàn)的丙型肝炎患者大約35 000例，并且北方發(fā)現(xiàn)的病例要比南方高，抗HCV陽性率伴隨著年齡的增大而上升，男女之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義[8]。患者感染HVC后，臨床癥狀不明顯，易發(fā)展為慢性而導(dǎo)致成為肝硬化或肝癌[9]。部分HCV攜帶患者因沒有早期診治，在不知情下獻(xiàn)血或手術(shù)等方式傳播，因此需對HCV感染患者進(jìn)行早期診斷[10]。膠體金法檢測HCV抗體，操作簡便，省時，無需用特殊儀器，費用相對低，而且有較高的靈敏度和特異性，可用于緊急情況下的初篩[11]。對于免疫系統(tǒng)正常的患者用ELISA法檢測HCV抗體，其檢出率可達(dá)99.0%，缺點是任何的污染均容易產(chǎn)生假陽性結(jié)果。用人工合成多肽抗原或用基因工程制造的多肽作為固相的ELISA診斷試劑盒，利用間接法原理檢測，使不同制造商的測定結(jié)果存在較大的差異[12-13]。由于HCV基因序列容易變異而使其所編碼的氨基酸序列有顯著改變，國內(nèi)許多患者感染的HCV有多種基因型而且存在一定比例的混合感染，導(dǎo)致HCV的早期診斷效果并不理想。CLIA法具有無放射污染、標(biāo)記物的來源多樣并且有效期長、檢測靈敏度高、檢測方便等優(yōu)點，目前使用較多。其檢測效果與酶標(biāo)記物的質(zhì)量好壞相關(guān)，也跟純度好、親和力高、活性強的酶和抗原或抗體密切相關(guān)[14-15]。增強劑可以提高發(fā)光信號使發(fā)光時間進(jìn)一步延長，這樣對提高檢測的靈敏度有極大的幫助。有文獻(xiàn)表明，與常規(guī)的ELISA法相比，CLIA法的靈敏度提高了3～5個數(shù)量級[14]。

本文通過研究發(fā)現(xiàn)利用多種方法對HCV抗體待檢標(biāo)本進(jìn)行檢測，有時會出現(xiàn)不同的結(jié)果，特別是處于陽性臨界值的標(biāo)本。用ELISA法和CLIA法對金標(biāo)法初檢448例可疑陽性和陽性結(jié)果、336例陽性結(jié)果進(jìn)行平行檢測，用Kappa檢驗分析其結(jié)果的一致性顯示好；然而兩種方法對金標(biāo)法初檢112例HCV抗體可疑陽性結(jié)果時，Kappa檢驗分析其結(jié)果的一致性顯示中等。原因可能是生產(chǎn)檢測HCV抗體試劑盒的商家使用不同的HCV基因重組抗原或抗原各區(qū)段、比例不相同，使不同商家的試劑靈敏性和特異性存在差異，抗HCV抗體的檢測結(jié)果也不盡相同[16-17]。另外抗HCV抗體存在假陽性的情況，如ELISA和CLIA試劑所用抗原是基因工程制備的蛋白，來自載體大腸桿菌的一些序列或與血清中的大腸桿菌因子發(fā)生反應(yīng)從而產(chǎn)生假陽性；或因受檢者血清中的IgG濃度過高，其吸附在板孔的能力過于強大，降低本底較困難，從而產(chǎn)生假陽性；或因受檢者本身存在結(jié)締組織病，如多發(fā)性骨髓瘤等，血清中的異常IgG濃度過高或系統(tǒng)性紅斑狼瘡血清中的風(fēng)濕小體濃度過高，致使出現(xiàn)假陽性[18]。因此，只用一種試劑判斷HCV陽性需小心，HCV篩查可疑或陽性仍需通過更為特異的試驗確認(rèn)。目前HCV的確證試驗多用HCV-RNA和重組免疫印跡法(RIBA)。HCV-RNA法檢測步驟繁瑣，容易有交叉污染導(dǎo)致假陽性，另外試劑和儀器偏貴；RIBA法有很高的特異性，但試劑價格同樣貴，兩者均難以在臨床上推廣。已有研究對臨床上診斷HCV感染的不同復(fù)檢核審模式進(jìn)行了探討[19-20]。

綜上所述，兩種方法檢測初檢(金標(biāo)法)為可疑陽性和陽性標(biāo)本、陽性標(biāo)本有較好的一致性，但只針對可疑陽性標(biāo)本時，一致性為中等。為了保證用血安全，減小醫(yī)療糾紛和待檢者的心理負(fù)擔(dān)，在工作中遇到HCV檢測可疑結(jié)果時，要選用其他特異性更高的方法進(jìn)行驗證。

[1]王英莉.酶聯(lián)免疫檢測抗-HCV方法的探討與試劑的評價[J].中國現(xiàn)代藥物應(yīng)用,2015,9(3):244-245.

[2]朱兆生.不同檢驗方法應(yīng)用于丙型肝炎檢驗中的臨床對比分析[J].中國實用醫(yī)藥,2015,10(4):58-59.

[3]Korkmaz H,Kesli R,Onder PB,et al.Assessment of evidence for positive association and seroprevalence of hepatitis B and C in diabetic patients in a developing country[J].J Investiq Med,2015,63(2): 251-257.

[4]張德藝.患者輸血前感染性指標(biāo)檢測結(jié)果及意義[J].河北醫(yī)藥, 2014,36(9):1387-1388.

[5]謝秋南.對比分析酶聯(lián)免疫法和膠體金法檢測病毒性丙型肝炎的效果[J].吉林醫(yī)學(xué),2015,36(2):277.

[6]顏永亁.時間分辨熒光免疫分析測定乙型肝炎病毒表面抗原cut-off值的確定[J].國際檢驗醫(yī)學(xué)雜志,2013,34(10):1276-1278.

[7]龍宏洋,葉玉芬,朱學(xué)強,等.丙型肝炎病原學(xué)不同檢測方法的臨床應(yīng)用價值對比分析[J].檢驗醫(yī)學(xué)與臨床,2015,12(5):597-599.

[8]邵芳.HCV抗原、HCV抗體及HCV-RNA聯(lián)合檢測與ALT的相關(guān)性及其臨床意義[J].中國中西醫(yī)結(jié)合消化雜志,2014,22(2):80-82.

[9]王政.ELISA法和化學(xué)發(fā)光法對臍血中HIV-1/HIV-2抗體、梅毒抗體和丙肝抗體的檢測比較[J].中國社區(qū)醫(yī)師,2014,30(36): 144-145.

[10]張利,于冬男.化學(xué)發(fā)光酶免疫分析法及ELISA檢測抗-HCV的結(jié)果比較[J].檢驗醫(yī)學(xué)與臨床,2016,13(1):18-20.

[11]袁杰.膠體金法與ELISA法在檢測血液丙型肝炎病毒抗體中的比較[J].中國老年學(xué)雜志,2012,32(21):4650-4651.

[12]Honge BL,Jespersen S,Medina C,et al.Hepatitis C prevalence among HIV-infected patients in Guinea-Bissau:a descriptive cross-sectional study[J].Int J Infect Dis,2014,28(12):35-40.

[13]巫文勛,程利,梁可,等.化學(xué)發(fā)光免疫測定法檢測HBV、抗HCV、抗HIV和TP-Ab結(jié)果分析[J].重慶醫(yī)學(xué),2014,43(20):2626-2628.

[14]Krawczyk A,Hintze C,Ackermann J,et al.Clinical performance of the novel DiaSorin LIAISON XL murex:HbsAg Quant,HCV-Ab/Ag assays[J].J Clin Virol,2014,59(1):44-49.

[15]周紅星,江應(yīng)安.乙型肝炎病毒表面抗原在慢性乙型肝炎病毒感染后不同臨床階段的定量檢測及臨床意義[J].中國醫(yī)師進(jìn)修雜志, 2014,37(24):15-18.

[16]孟慶玲,魯健,邱豐,等.丙型肝炎IgG抗體ELISA診斷試劑比對分析[J].中華實驗和臨床病毒學(xué)雜志,2013,27(3):221-223

[17]傅立強,桑列勇,蔣國瑾.ELISA試劑檢測抗HCV反應(yīng)性結(jié)果分析[J].檢驗醫(yī)學(xué),2012,27(7):588-591

[18]陳存存,范列英.抗HCV抗體和抗TP抗體篩查試驗的假陽性問題及對策研究進(jìn)展[J].檢驗醫(yī)學(xué),2015,30(12):1167-1174.

[19]鮮玉萍,楊紅英.丙型肝炎核心抗原檢測的臨床意義[J].檢驗醫(yī)學(xué)與臨床,2012,9(18):2320-2321.

[20]金一鳴,方志紅,曹誼.血液篩查中丙型肝炎病毒檢測方法的應(yīng)用評價[J].檢驗醫(yī)學(xué)與臨床,2013,10(5):552-553.

Comparison of the concordance of two methods for the detection of anti-HCV.

ZHAO Zi-xian1,LI Juan-hong2,SU Hong-zhao3,ZENG Feng-qun2,HE Jian-xiang2.Department of Blood Transfusion1,Department of Laboratory2, Department of ENT3,Xinhui Hospital Affiliated to Southern Medical University,Jiangmen 529100,Guangdong,CHINA

Objective To evaluate the concordance of the two methods for detection of antibodies to hepatitis C virus(anti-HCV),and to provide the best HCV antibody screening method for safe blood transfusion.MethodsAll the anti-HCV inspected samples which were collected from the patients,who admitted to our hospital for treatment and underwent blood transfusion from February 2015 to June 2016,were detected by HCV antibody detection kit with colloidal gold method.The suspicious and positive samples were re-inspected by enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA)and chemiluminescent immunoassay(CLIA).Kappa consistency analysis of the re-inspected results of suspicious and positive specimens was carried out with SPSS17.0 software,and the Kappa coefficient was statistically analyzed byUtest.ResultsA total of 448 suspicious and positive samples were detected by HCV antibody detection kit with colloidal gold method among all the samples,which included 112 suspicious and 336 positive specimens.The negative, suspicious,positive specimens re-inspected out by ELISA in 448 samples were 54(12%),18(4%),376(84%),respectively;The negative,suspicious,positive specimens re-inspected out by CLIA in 448 samples were 42(9.4%),11 (2.5%),395(88.1%),respectively.The 112 suspicious samples re-inspected by ELISA showed negative,suspicious, positive specimens were 11(9.8%),30(26.8%),71(63.4%),respectively;The re-inspected results by CLIA showed that negative,suspicious,positive specimens were 13(11.6%),21(18.7%),78(69.7%),respectively.The 336 positive samples re-inspected by ELISA showed negative,suspicious,positive specimens were 12(3.6%),28(8.3%),296 (88.1%),respectively.The re-inspected results by CLIA were 11(3.3%)negative,19(5.6%)suspicious,306(91.1%) positive,respectively.Kappa coefficient of suspicious-positive specimens,suspicious specimens and positive specimens by the two assays of anti-HCV were 0.730(u=16.22,P＜0.01),0.497(u=6.81,P＜0.05),0.705(u=11.56,P＜0.01), respectively.ConclusionThere is a good consistency of suspicious-positive and positive specimens by the two assays of anti-HCV.The consistency of the two assays for suspicious specimens was medium,and other more sensitive and specific methods should be used in the suspicious specimens.

Antibodies to hepatitis C virus(anti-HCV);Enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA);Chemiluminescence immunoassay(CLIA);Kappa test

R512.6+3

A

1003—6350（2017）06—0928—03

10.3969/j.issn.1003-6350.2017.06.023

2016-08-27)

趙子賢。E-mail：224047632@qq.com