兩種方法檢測丙型肝炎病毒抗體的一致性比較

趙子賢，李娟紅，蘇宏釗，曾鳳群，何健祥

(南方醫科大學附屬新會醫院輸血科1、檢驗科2、耳鼻喉科3，廣東 江門 529100)

兩種方法檢測丙型肝炎病毒抗體的一致性比較

趙子賢1，李娟紅2，蘇宏釗3，曾鳳群2，何健祥2

(南方醫科大學附屬新會醫院輸血科1、檢驗科2、耳鼻喉科3，廣東 江門 529100)

目的 用Kappa檢驗分析兩種方法檢測丙型肝炎病毒(hepatitis C virus，HCV)抗體的一致性，為安全輸血提供最佳的HCV抗體篩查方法。方法選取2015年2月至2016年6月在我院就治而有可能需輸血患者的丙型肝炎病毒抗體待檢標本，用膠體金法HCV抗體檢測試劑盒檢測，將可疑結果和陽性結果標本再用酶聯免疫吸附試驗HCV抗體診斷試劑盒(ELISA)和化學發學測定法HCV抗體檢測試劑盒CLIA)分別進行復檢。用SPSS17.0軟件分別對可疑和陽性結果、可疑結果、陽性結果進行Kappa分析一致性程度，并用U檢驗對Kappa系數進行統計分析。結果膠體金法HCV抗體檢測試劑盒檢測全部標本共448例可疑陽性和陽性結果，其中112例為可疑結果，336例為陽性結果；用ELISA方法檢測448例初檢為可疑和陽性結果，結果為陰性、可疑和陽性的例數分別是54例(12%)、18例(4%)、376例(84%)，用CLIA方法檢測結果分別為42例(9.4%)、11例(2.5%)、395例(88.1%)；用ELISA方法檢測112例初檢為可疑陽性結果，結果為陰性、可疑和陽性的例數分別是11例(9.8%)、30例(26.8%)、71例(63.4%)，用CLIA方法檢測結果分別為13例(11.6%)、21例(18.7%)、78例(69.7%)；用ELISA方法檢測336例初檢為陽性結果，結果為陰性、可疑和陽性的例數分別是12例(3.6%)、28例(8.3%)、296例(88.1%)，用CLIA方法檢測結果分別為11例(3.3%)、19例(5.6%)、306例(91.1%)。兩種方法對可疑和陽性標本、可疑標本、陽性標本的Kappa系數分別為Kappa=0.730(u=16.22，P＜0.01)、Kappa=0.497(u=6.81，P＜0.05)、Kappa=0.705(u=11.56，P＜0.01)。結論兩種方法對可疑和陽性標本、陽性標本的檢測結果有較好的一致性，而對可疑標本的檢測結果一致性為中等，對可疑陽性結果應用更為敏感和特異的試驗驗證。

丙型肝炎病毒抗體；酶聯免疫吸附試驗；化學發光測定法；Kappa檢驗

在臨床上丙型肝炎病毒(HCV)感染是一種常見且傳染范圍比較廣的感染性疾病[1-2]。據調查顯示，約一半HCV感染患者可轉化為慢性肝炎，甚至可轉變為肝硬化或肝細胞性肝癌[3]。我國的HCV感染途徑主要是經輸血傳播，特別是反復輸入多個獻血員的血制品。隨著輸血醫學的發展，輸血所帶來的感染日益備受重視，一方面是針對患者的早期防治，另一方面是降低醫療糾紛的發生和防止醫護人員職業暴露[4]。目前HCV感染的檢測方法有膠體金法、ELISA、CLIA和核酸擴增試驗法等[5]，各種檢測方法因方法學原理不同和商家試劑的靈敏度和特異性不同，使產品說明書中提供的臨界值(cut-off)值存在差別[6]，導致同一份標本可能得出不同的檢測結果。本文用Kappa檢驗分析ELISA和CLIA兩種方法檢測HCV抗體結果的一致性，現報道如下：

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集本院2015年2月至2016年6月輸血前、手術前需檢測HCV抗體患者共22 426例，其中男性11 824例(52.7%)，女性10 602例(47.3%)年齡8～92歲，平均(55±18.12)歲。分別用促凝管抽取靜脈血，離心獲取血清待檢。

1.2 儀器與試劑 ①儀器：由瑞士 Tecan Schweiz AG公司生產的全自動酶免分析儀(Freedom EVOLyze)，由北京科美生物有限公司生產的科美東雅化學發光分析儀(CHEMCLI600)；②試劑：由英科新創科技有限公司生產的丙型肝炎病毒抗體檢測試劑盒(膠體金法)，由珠海麗珠試劑股份有限公司生產的丙型肝炎病毒抗體診斷試劑盒(ELISA法)，由北京科美生物技術有限公司生產丙型肝炎病毒抗體檢測試劑盒(CLIA法)。

1.3 方法 把全部標本先用膠體金法進行初檢，將初檢結果中的可疑結果、陽性結果平行利用ELISA法和CLIA法進行復檢。結果的判斷：①ELISA法：臨界值(cut-off)=陰性對照平均A值+0.12，樣品A值cut-off值為HCV抗體陽性，樣品A值＜臨界值為HCV抗體陰性。②CLIA法：臨界值(cut-off)=2.1×陰性對照發光值(RLU)的平均值，待測樣本的RLU值≥cut-off值為有反應性，待測樣本的RLU值＜臨界值為無反應性。實驗操作均嚴格按試劑說明書進行。

1.4 統計學方法 用SPSS17.0軟件包對復檢結果進行統計分析。用Kappa檢驗分析兩種方法檢測丙型肝炎病毒抗體的一致性，用U檢驗對Kappa值進行假設檢驗，以P=0.05為檢驗水平。0.2＜Kappa≤0.4，一致性水平為一般；0.4＜Kappa≤0.6，一致性水平為中等；0.6＜Kappa≤0.8，一致性水平為好。

2 結 果

2.1 膠體金法初檢 2015年2月至2016年6月輸血前、手術前需檢測HCV抗體患者共22 426例，用膠體金法HCV抗體檢測試劑盒進行初檢，共448例可疑和陽性結果，其中112例為可疑結果，336例為陽性結果，其余為陰性結果，陽性率為1.50%。

2.2 兩種方法平行測試初檢HCV抗體為可疑陽性和陽性結果的一致性 膠體金法HCV抗體檢測初檢的可疑結果和陽性結果共448例，分別用ELISA和CLIA兩種方法平行測試復檢，ELISA法結果為陰性、可疑和陽性的例數分別為54例(12%)、18例(4%)、376例(84%)，CLIA法結果分別為42例(9.4%)、11例(2.5%)、395例(88.1%)，兩種方法針對可疑陽性和陽性結果的Kappa系數為0.730，經U檢驗，P＜0.01，差異有統計學意義，認為兩者一致性強度為好，見表1。

表1 兩種方法平行測試HCV抗體可疑陽性和陽性結果的測試結果(n=448，例)

2.3 兩種方法平行測試初檢HCV抗體為可疑陽性結果的一致性 膠體金法HCV抗體檢測初檢的可疑陽性結果共112例，分別用ELISA和CLIA兩種方法平行測試復檢，ELISA法結果為陰性、可疑和陽性的例數分別是11例(9.8%)、30例(26.8%)、71例(63.4%)，用CLIA法檢測結果分別為13例(11.6%)、21例(18.7%)、78例(69.7%)。兩種方法針對可疑陽性結果的Kappa系數為0.497，經U檢驗，P＜0.05，差異有統計學意義，認為兩者一致性強度為中等，見表2。

表2 兩種方法平行測試HCV抗體可疑陽性的測試結果(n=112，例)

2.4 兩種方法平行測試初檢HCV抗體為陽性結果的一致性 膠體金法HCV抗體檢測初檢的陽性結果共336例，分別用ELISA和CLIA兩種方法平行測試復檢，ELISA法結果為陰性、可疑和陽性分別為12例(3.6%)、28例(8.3%)、296例(88.1%)，用CLIA法檢測結果分別為11例(3.3%)、19例(5.6%)、306例(91.1%)。兩種方法針對陽性結果的Kappa系數為0.705，經U檢驗，P＜0.01，差異有統計學意義，認為兩者一致性強度為好，見表3。

表3 兩種方法平行測試HCV抗體陽性的測試結果（n=336，例）

3 討 論

由HCV感染引起的丙型肝炎是我國比較常見的傳染病之一，它主要通過輸血傳播并且對人類健康造成極大危害。目前絕大多數醫院開展了HCV檢測，只要用于輸血前、術前、懷孕前檢查等[7]。調查研究顯示，我國每年新發現的丙型肝炎患者大約35 000例，并且北方發現的病例要比南方高，抗HCV陽性率伴隨著年齡的增大而上升，男女之間差異無統計學意義[8]?；颊吒腥綡VC后，臨床癥狀不明顯，易發展為慢性而導致成為肝硬化或肝癌[9]。部分HCV攜帶患者因沒有早期診治，在不知情下獻血或手術等方式傳播，因此需對HCV感染患者進行早期診斷[10]。膠體金法檢測HCV抗體，操作簡便，省時，無需用特殊儀器，費用相對低，而且有較高的靈敏度和特異性，可用于緊急情況下的初篩[11]。對于免疫系統正常的患者用ELISA法檢測HCV抗體，其檢出率可達99.0%，缺點是任何的污染均容易產生假陽性結果。用人工合成多肽抗原或用基因工程制造的多肽作為固相的ELISA診斷試劑盒，利用間接法原理檢測，使不同制造商的測定結果存在較大的差異[12-13]。由于HCV基因序列容易變異而使其所編碼的氨基酸序列有顯著改變，國內許多患者感染的HCV有多種基因型而且存在一定比例的混合感染，導致HCV的早期診斷效果并不理想。CLIA法具有無放射污染、標記物的來源多樣并且有效期長、檢測靈敏度高、檢測方便等優點，目前使用較多。其檢測效果與酶標記物的質量好壞相關，也跟純度好、親和力高、活性強的酶和抗原或抗體密切相關[14-15]。增強劑可以提高發光信號使發光時間進一步延長，這樣對提高檢測的靈敏度有極大的幫助。有文獻表明，與常規的ELISA法相比，CLIA法的靈敏度提高了3～5個數量級[14]。

本文通過研究發現利用多種方法對HCV抗體待檢標本進行檢測，有時會出現不同的結果，特別是處于陽性臨界值的標本。用ELISA法和CLIA法對金標法初檢448例可疑陽性和陽性結果、336例陽性結果進行平行檢測，用Kappa檢驗分析其結果的一致性顯示好；然而兩種方法對金標法初檢112例HCV抗體可疑陽性結果時，Kappa檢驗分析其結果的一致性顯示中等。原因可能是生產檢測HCV抗體試劑盒的商家使用不同的HCV基因重組抗原或抗原各區段、比例不相同，使不同商家的試劑靈敏性和特異性存在差異，抗HCV抗體的檢測結果也不盡相同[16-17]。另外抗HCV抗體存在假陽性的情況，如ELISA和CLIA試劑所用抗原是基因工程制備的蛋白，來自載體大腸桿菌的一些序列或與血清中的大腸桿菌因子發生反應從而產生假陽性；或因受檢者血清中的IgG濃度過高，其吸附在板孔的能力過于強大，降低本底較困難，從而產生假陽性；或因受檢者本身存在結締組織病，如多發性骨髓瘤等，血清中的異常IgG濃度過高或系統性紅斑狼瘡血清中的風濕小體濃度過高，致使出現假陽性[18]。因此，只用一種試劑判斷HCV陽性需小心，HCV篩查可疑或陽性仍需通過更為特異的試驗確認。目前HCV的確證試驗多用HCV-RNA和重組免疫印跡法(RIBA)。HCV-RNA法檢測步驟繁瑣，容易有交叉污染導致假陽性，另外試劑和儀器偏貴；RIBA法有很高的特異性，但試劑價格同樣貴，兩者均難以在臨床上推廣。已有研究對臨床上診斷HCV感染的不同復檢核審模式進行了探討[19-20]。

綜上所述，兩種方法檢測初檢(金標法)為可疑陽性和陽性標本、陽性標本有較好的一致性，但只針對可疑陽性標本時，一致性為中等。為了保證用血安全，減小醫療糾紛和待檢者的心理負擔，在工作中遇到HCV檢測可疑結果時，要選用其他特異性更高的方法進行驗證。

[1]王英莉.酶聯免疫檢測抗-HCV方法的探討與試劑的評價[J].中國現代藥物應用,2015,9(3):244-245.

[2]朱兆生.不同檢驗方法應用于丙型肝炎檢驗中的臨床對比分析[J].中國實用醫藥,2015,10(4):58-59.

[3]Korkmaz H,Kesli R,Onder PB,et al.Assessment of evidence for positive association and seroprevalence of hepatitis B and C in diabetic patients in a developing country[J].J Investiq Med,2015,63(2): 251-257.

[4]張德藝.患者輸血前感染性指標檢測結果及意義[J].河北醫藥, 2014,36(9):1387-1388.

[5]謝秋南.對比分析酶聯免疫法和膠體金法檢測病毒性丙型肝炎的效果[J].吉林醫學,2015,36(2):277.

[6]顏永亁.時間分辨熒光免疫分析測定乙型肝炎病毒表面抗原cut-off值的確定[J].國際檢驗醫學雜志,2013,34(10):1276-1278.

[7]龍宏洋,葉玉芬,朱學強,等.丙型肝炎病原學不同檢測方法的臨床應用價值對比分析[J].檢驗醫學與臨床,2015,12(5):597-599.

[8]邵芳.HCV抗原、HCV抗體及HCV-RNA聯合檢測與ALT的相關性及其臨床意義[J].中國中西醫結合消化雜志,2014,22(2):80-82.

[9]王政.ELISA法和化學發光法對臍血中HIV-1/HIV-2抗體、梅毒抗體和丙肝抗體的檢測比較[J].中國社區醫師,2014,30(36): 144-145.

[10]張利,于冬男.化學發光酶免疫分析法及ELISA檢測抗-HCV的結果比較[J].檢驗醫學與臨床,2016,13(1):18-20.

[11]袁杰.膠體金法與ELISA法在檢測血液丙型肝炎病毒抗體中的比較[J].中國老年學雜志,2012,32(21):4650-4651.

[12]Honge BL,Jespersen S,Medina C,et al.Hepatitis C prevalence among HIV-infected patients in Guinea-Bissau:a descriptive cross-sectional study[J].Int J Infect Dis,2014,28(12):35-40.

[13]巫文勛,程利,梁可,等.化學發光免疫測定法檢測HBV、抗HCV、抗HIV和TP-Ab結果分析[J].重慶醫學,2014,43(20):2626-2628.

[14]Krawczyk A,Hintze C,Ackermann J,et al.Clinical performance of the novel DiaSorin LIAISON XL murex:HbsAg Quant,HCV-Ab/Ag assays[J].J Clin Virol,2014,59(1):44-49.

[15]周紅星,江應安.乙型肝炎病毒表面抗原在慢性乙型肝炎病毒感染后不同臨床階段的定量檢測及臨床意義[J].中國醫師進修雜志, 2014,37(24):15-18.

[16]孟慶玲,魯健,邱豐,等.丙型肝炎IgG抗體ELISA診斷試劑比對分析[J].中華實驗和臨床病毒學雜志,2013,27(3):221-223

[17]傅立強,桑列勇,蔣國瑾.ELISA試劑檢測抗HCV反應性結果分析[J].檢驗醫學,2012,27(7):588-591

[18]陳存存,范列英.抗HCV抗體和抗TP抗體篩查試驗的假陽性問題及對策研究進展[J].檢驗醫學,2015,30(12):1167-1174.

[19]鮮玉萍,楊紅英.丙型肝炎核心抗原檢測的臨床意義[J].檢驗醫學與臨床,2012,9(18):2320-2321.

[20]金一鳴,方志紅,曹誼.血液篩查中丙型肝炎病毒檢測方法的應用評價[J].檢驗醫學與臨床,2013,10(5):552-553.

Comparison of the concordance of two methods for the detection of anti-HCV.

ZHAO Zi-xian1,LI Juan-hong2,SU Hong-zhao3,ZENG Feng-qun2,HE Jian-xiang2.Department of Blood Transfusion1,Department of Laboratory2, Department of ENT3,Xinhui Hospital Affiliated to Southern Medical University,Jiangmen 529100,Guangdong,CHINA

Objective To evaluate the concordance of the two methods for detection of antibodies to hepatitis C virus(anti-HCV),and to provide the best HCV antibody screening method for safe blood transfusion.MethodsAll the anti-HCV inspected samples which were collected from the patients,who admitted to our hospital for treatment and underwent blood transfusion from February 2015 to June 2016,were detected by HCV antibody detection kit with colloidal gold method.The suspicious and positive samples were re-inspected by enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA)and chemiluminescent immunoassay(CLIA).Kappa consistency analysis of the re-inspected results of suspicious and positive specimens was carried out with SPSS17.0 software,and the Kappa coefficient was statistically analyzed byUtest.ResultsA total of 448 suspicious and positive samples were detected by HCV antibody detection kit with colloidal gold method among all the samples,which included 112 suspicious and 336 positive specimens.The negative, suspicious,positive specimens re-inspected out by ELISA in 448 samples were 54(12%),18(4%),376(84%),respectively;The negative,suspicious,positive specimens re-inspected out by CLIA in 448 samples were 42(9.4%),11 (2.5%),395(88.1%),respectively.The 112 suspicious samples re-inspected by ELISA showed negative,suspicious, positive specimens were 11(9.8%),30(26.8%),71(63.4%),respectively;The re-inspected results by CLIA showed that negative,suspicious,positive specimens were 13(11.6%),21(18.7%),78(69.7%),respectively.The 336 positive samples re-inspected by ELISA showed negative,suspicious,positive specimens were 12(3.6%),28(8.3%),296 (88.1%),respectively.The re-inspected results by CLIA were 11(3.3%)negative,19(5.6%)suspicious,306(91.1%) positive,respectively.Kappa coefficient of suspicious-positive specimens,suspicious specimens and positive specimens by the two assays of anti-HCV were 0.730(u=16.22,P＜0.01),0.497(u=6.81,P＜0.05),0.705(u=11.56,P＜0.01), respectively.ConclusionThere is a good consistency of suspicious-positive and positive specimens by the two assays of anti-HCV.The consistency of the two assays for suspicious specimens was medium,and other more sensitive and specific methods should be used in the suspicious specimens.

Antibodies to hepatitis C virus(anti-HCV);Enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA);Chemiluminescence immunoassay(CLIA);Kappa test

R512.6+3

A

1003—6350（2017）06—0928—03

10.3969/j.issn.1003-6350.2017.06.023

2016-08-27)

趙子賢。E-mail：224047632@qq.com