MCP-1在乳腺惡性腫瘤細胞增殖與轉移中的作用

呂明麗，周赟，周雷平，牛建梅

(上海交通大學醫學院附屬國際和平婦幼保健院超聲科，上海 200030)

MCP-1在乳腺惡性腫瘤細胞增殖與轉移中的作用

呂明麗，周赟，周雷平，牛建梅

(上海交通大學醫學院附屬國際和平婦幼保健院超聲科，上海 200030)

目的 探討人單核細胞趨化因子-1(MCP-1)在乳腺惡性腫瘤細胞增殖轉移中的作用。方法構建MCP-1過表達的穩轉人乳腺癌細胞MCF-7細胞和空載MCF-7細胞，分別標記為MCP-1過表達MCF-7細胞(MCP-MCF-7)、空載MCF-7細胞(EV-MCF-7)。通過CCK8細胞增殖實驗、單克隆形成實驗、劃痕實驗和細胞凋亡檢測，觀察MCP-1過表達對細胞增殖轉移及凋亡的影響。通過real-time PCR法檢測MCP-1可能的下游基因。結果成功構建了MCP-1過表達MCF-7乳腺癌細胞株及對照細胞株。CCK8實驗顯示培養第5天起MCP-MCF-7細胞株在450 nm處的吸光度明顯高于EV-MCF-7組，且差異有統計學意義(P＜0.05)。細胞集落形成實驗提示MCP-MCF-7細胞株所形成的集落數量明顯多于EV-MCF-7細胞，差異有統計學意義(P＜0.05)，且前者單個集落的體積亦大于后者。劃痕實驗中12 h后MCP-MCF-7細胞的遷移能力開始增強，到48 h時劃痕更加愈合明顯。雖然轉染MCP-1后細胞有效凋亡百分比(0.57%)低于空載細胞(1.10%)，但差異無統計學意義(P＞0.05)，即MCP-1對MCF-7乳腺癌細胞凋亡無影響。在對MCP-1下游可能基因的分析結果提示MCP-1可以上調p65、MMP2、STAT2基因表達，下調RASSF1基因表達。結論MCP-1具有直接促進乳腺惡性腫瘤細胞的增殖和轉移能力，且此種作用可能與p65、MMP2、STAT2、RASSF1有關。

人單核細胞趨化蛋白-1；乳腺腫瘤細胞；增殖；轉移

單核細胞趨化蛋白-1(monocyte chemoattratant protein-1，MCP-1)屬于C-C亞族(β亞族)成員，也稱為單核細胞趨化和激活因子，因此也縮寫為 CCL2。它主要作用是趨化血液中的巨噬細胞進入局部組織中，并與腫瘤細胞相互作用形成一個獨特的富含各種生長因子和趨化因子的微環境。越來越多研究發現，腫瘤局部組織中MCP-1表達水平的高低與腫瘤的惡性程度呈正相關，可作為患者預后評價指標之一[1-4]。腫瘤局部微環境中的MCP-1與腫瘤局部血管生成密切相關[5]。此外研究還發現在腫瘤微環境細胞間隙的液體，胸腹水及血清中均檢測到MCP-1的存在[6-11]。

由此可見MCP-1在乳腺癌增殖浸潤及轉移中有著至關重要的作用，那么MCP-1作用機制有哪些呢？目前研究證明CCL2主要通過介導腫瘤細胞同宿主細胞間對話，如趨化巨噬細胞進入腫瘤局部，造成腫瘤局部微環境中單個核細胞免疫失衡，直接或間接釋放促血管生成因子，趨化和激活破骨細胞來促進腫瘤的增殖和轉移。這些觀點得到了大多數學者的認可，但是關于CCL2是否本身即具有直接促進腫瘤細胞惡性特征的研究結果卻存在很大爭議。目前有學者認為MCP-1不具有直接促進惡性腫瘤生長和存活的作用[12-13]，但可增加腫瘤細胞運動性和遷移能力[14]。

因此本研究將采用慢病毒載體將MCP-1基因導入MCP-1低表達且低度惡性的MCF-7乳腺癌細胞，從細胞功能學實驗觀察MCP-1對乳腺惡性腫瘤細胞是否具有直接促進作用，并對MCP-1可能的下游基因做初步的研究。

1 材料與方法

1.1 材料 人乳腺癌細胞系MCF-7購自中國科學院上海生命科學研究院細胞庫，慢病毒質粒pCDH及相應的輔助質粒由上海復旦大學醫學院分子重點實驗室饋贈。人胚腎T細胞(HEK-293T)由本實驗室凍存。

1.2 方法

1.2.1 含MCP-1慢病毒質粒的構建與鑒定 于正常人基因組中克隆MCP-1基因片段，將其與慢病毒載體pCDH連接轉化。將構建好的慢病毒載體在PUBMED網站經BLAST比對，選用顯示完全正確、無突變堿基的構建治療進行后續實驗。將含有MCP-1片段的慢病毒質粒pCDH、包裝質粒和衣殼質粒共同轉染HEK-293T細胞，并收集病毒血清，之后感染MCF-7細胞。一般未經濃縮的病毒顆粒感染Hela細胞兩次后病毒的感染效率可達60%左右。在無菌條件下經流式細胞儀篩選后可獲得95%陽性細胞。可通過觀察細胞自帶的綠色熒光(pCDH中含有GFP綠色熒光蛋白)來評估感染效率和陽性細胞百分比。

1.2.2 細胞培養和增殖實驗 細胞培養液為含10%FBS的高糖DMEM培養液。將原始乳腺癌細胞(MCF-7)、EV-含空載質粒乳腺癌細胞(MCF)、含有MCP-1過表達質粒的乳腺癌細胞(MCP-MCF-7)置入37℃、含體積分數為0.05的CO2恒溫培養箱中培養。0.25%胰蛋白酶消化上述三種細胞，細胞懸液為含10%FBS的高糖DMEM培養液。將細胞接種于96孔板中，每孔體積為100 μL，含細胞數位每孔1×103個，之后置入CO2恒溫培養箱中培養。于接種后第0天、1天、3天、5天、7天于每孔中加入20 μL CCK8，37℃恒溫培養箱中孵育2 h，置于波長為490 nm處讀取光密度(D)值，并軸繪制細胞生長曲線。

1.2.3 單克隆形成實驗 0.25%胰蛋白酶消化MCF-7、EV-MCF、MCP-MCF-7細胞后將細胞接種在12孔板中，每孔含1 500個細胞，各3個復孔，之后放入恒溫培養箱中培養。第7天時取出細胞，吸棄培養液，并用1×PBS洗滌3次。以0.1%的結晶紫和10%甲醇于室溫染色20 min，流水緩慢洗去染色液，空氣中干燥后拍照。之后，33%醋酸500 μL/孔洗脫結晶紫，酶標儀洗脫液于檢測波長為560 nm處的D值，來評估細胞克隆數。

1.2.4 細胞凋亡檢測 0.25%胰蛋白酶消化MCF-7、EV-MCF、MCP-MC-7細胞，細胞接種于6孔板中，每孔細胞數位2×105個，CO2恒溫培養箱中培養。2 d后，采用細胞凋亡檢測試劑盒AnnexinⅤ-磷脂酰絲氨酸(PE)/7-AAD(7-amino-actinomycin D)試劑盒檢測細胞凋亡。收集細胞培養液至離心管中，以胰酶消化細胞之后加入前面收集的細胞培養液，吹打下所有的貼壁細胞，并將其輕輕吹散后再次收集至離心管內。1 000×g離心3～5 min，吸除上清液，加入1 mL 4℃預冷的PBS，重懸后再次離心沉淀細胞，吸除上清液。去離子水按1︰4的比例稀釋鏈接緩沖液，以250 μL鏈接緩沖液重新懸浮細胞，調節濃度為1×106/mL。取100 μL細胞懸液置于5 mL流式管中，加入5 μL AnnexinⅤ-PE和10 μL 7-AAD溶液，混勻后于室溫避光孵育15 min，加入PBS 400 μL，應用流式細胞儀計數細胞凋亡數量。

1.2.5 細胞劃痕實驗 胰蛋白酶消化MDA-MB -231-NC、MDA-MB-231-2396細胞，以每孔2×105個細胞接種于12孔板中，CO2恒溫培養箱中培養1 d形成單層細胞。在單層培養細胞上，用移液器槍頭沿著培養板底部做“一”字形劃痕，光學顯微鏡下記錄劃痕區的相對位置，再以無血清培養液培養，分別于培養0 h、16 h、24 h、40 h時觀察并拍照，計算劃痕修復百分比，劃痕修復百分比=(細胞遷移距離/劃痕距離)×100%。

1.2.6 real-timePCR分析MCP-1下游基因mRNA水平的改變 轉錄好的MCP-MCF-7和EV-MCF-7細胞的cDNA作為模板，進行 Real-time PCR，檢測MCP-1、p65、p52、FOXO3、FOXO1、STAT2、STAT3、STAT4、RASSF1、MMP2的表達情況。上述基因熒光定量PCR引物見表1，每個樣本做4個副孔，實驗重復3次。GAPDH為內參。

1.3 統計學方法 應用SPSS17.0統計學軟件，組間比較采用獨立樣本t檢驗，計量資料以均數±標準差(±s)表示，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 穩轉細胞MCP-1表達情況鑒定 在紫外藍色熒光視野下觀察MCP-1或EV穩轉細胞株，可看到兩種構建細胞中有綠色熒光表達正常，說明細胞構建成功(圖1A、1B)。通過RT-PCR及west-blot半定量檢測MCP-1過表達情況。RT-PCR及west-blot結果均顯示MCP-1在MCP-MCF-7細胞中的表達明顯高于EV-MCF-7細胞和未作任何處理的MCF-7細胞(圖1C、1D)。

表1 Real-time RCR引物序列、Tm值及擴增長度

2.2 MCP-1過表達乳腺癌細胞增殖能力明顯增強 實驗證實從第5天起MCP-1過表達的MCF-7細胞株在450 nm處的吸光度(0.62±0.02)明顯高于EV-MCF-7(0.57±0.02)組，且差異有統計學意義(P= 0.049)；第7天時MCP-MCF-7細胞株在450 nm處的吸光度(0.71±0.02)明顯高于EV-MCF-7(0.62±0.01)組，且差異有統計學意義(P=0.03)，說明MCP-1過表達乳腺癌細胞增殖能力明顯增強(圖2A)。同時細胞計數法所得到的實驗結果與CCK-8法一致，差異有統計學意義[第5天(286.67±6.51)vs(449.67±18.61)，P=0.00；第7天(797.33±11.15)vs(911.00±10.02)，P=0.00)](圖2B)。

2.3 MCP-1可增強MCF-7細胞集落形成能力 細胞接種后第14天時觀察細胞單克隆集落形成情況。用顯微鏡對集落進行計數，結果顯示MCP-MCF-7細胞所形成的集落數量(24.17±1.41)明顯多余EV-MCF-7細胞(8.96±0.24)，差異有統計學意義(P=0.00)，且前者單個集落的體積亦大于后者。該結果表明MCP-1可增強MCF-7細胞的集落形成能力(圖3)。

圖1 成功構建MCP-1過表達MCF-7細胞及空載對照細胞。

圖2 MCP-1對MCF-7乳腺癌細胞增殖能力的影響

圖3 MCP-1對MCF-7乳腺癌細胞集落形成能力的影響

2.4 MCP-1可以增加MCF-7乳腺癌細胞的遷移能力 本研究采用劃痕實驗來觀察MCP-1對MCF-7乳腺癌細胞遷移能力的影響。在劃痕實驗中12 h后MCP-MCF-7細胞的遷移能力開始增強，到48 h時劃痕更加明顯(圖4)。

2.5 MCP-1對MCF-7乳腺癌細胞凋亡無影響雖然轉染MCP-1后細胞有效凋亡百分比(0.57%)低于空載細胞(1.10%)，但是二者之間差異無統計學意義(P＞0.05)(圖5)。

2.6 MCP-1下游基因篩選 MCP-1促進乳腺腫瘤細胞增殖轉移機制的研究中，筆者采用了RT-PCR及real-timePCR檢測p65、p52、FOX1、FOX3、MMP2、STAT2、STAT3、STAT4、RASSF1 mRNA水平的改變。將未作任何處理的MCF-7細胞作為內參，比較EV-MCF-7細胞和MCP-MCF-7細胞中上述基因的改變。實驗結果顯示p65、MMP2、STAT2基因在MCP-MCF-7細胞中的mRNA水平較EV-MCF-7細胞增高，而RASSF1基因則出現降低(圖6)。提示p65、MMP2、STAT2和RASSF1基因有可能是MCP-1的下游基因。

圖4 劃痕實驗法觀察MCP-1對MCF-7乳腺癌細胞遷移能力的影響(10×)

圖5 AnnexinⅤ-PE/7-AAD凋亡檢測結果

圖6 real-time PCR檢測MCP-1下游基因

3 討 論

炎癥可以促進腫瘤的發生發展[1-3]，腫瘤細胞同炎癥細胞共同構成了一個特殊的環境——腫瘤微環境(tumor microenviroment)。在這個環境中原本充當人體衛士的炎性細胞失去了其抗腫瘤的作用而成為了腫瘤細胞的營養供給者和轉移通道。腫瘤相關巨噬細胞作為腫瘤微環境中最主要的炎性細胞，可以分泌大量細胞及血管生長因子促進腫瘤的生長及轉移，同時它本身也可作為載體將腫瘤細胞運送到遠處組織，促進腫瘤轉移的發生[4-6]。在腫瘤轉移灶中它亦可進一步促進轉移灶的生長和浸潤。

單核細胞趨化因子(monocyte chemoattratant protein-1，MCP-1或CCL2)是趨化血液中巨噬細胞進入局部組織的主要細胞因子[7]。研究證實腫瘤組織及患者血清中MCP-1的水平與乳腺癌患者的預后密切相關[8,15]。但是目前有研究認為MCP-1的促腫瘤增殖轉移作用是通過其誘導TAM等炎性細胞進入腫瘤部位后釋放各種因子所造成的，而MCP-1本身并不具有促腫瘤增殖和轉移的作用[8，13，15]。但是也有很多研究認為MCP-1本身可以促進腫瘤細胞的增殖和轉移。Melanie等[16]進行的體外實驗中發現侵襲性較高的細胞系MAD-MB-231、BT549、HS578T表達高水平的MCP-1，而低侵襲性的MCF-7和T470則基本不表達MCP-1給予外源性雌激素后，腫瘤細胞內MCP-1的水平明顯升高，同時細胞的惡性度增高[17]。用shRNA干擾MDA-MB-231乳腺癌細胞系中MCP-1的表達，發現荷瘤小鼠肺轉移灶數量明顯減少，約為對照組的1/3[18]。給予荷瘤裸鼠CCL2的中和性抗體后，肺轉移灶數量亦明顯減少，小鼠生存期延長[19]。

在本研究中筆者發現MCP-1過表達的乳腺癌細胞在接種后第5天時增殖能力出現具有統計學意義的升高(P＜0.05)。在單克隆形成實驗中可以觀察到接種后14 d MCP-1過表達的乳腺癌細胞所形成的細胞集落數量明顯多于EV-MCF-7細胞(P＜0.05)，且在集落形態上亦大于后者。劃痕實驗則表明MCP-1可以促進乳腺癌細胞的遷移(P＜0.05)。這些結果均提示MCP-1本身即具有促進乳腺惡相腫瘤細胞增殖轉移的能力，但它對細胞的凋亡無明顯作用。

在對MCP-1下游基因的初步研究中，我們采用了比較MCP-MCF-7細胞和EV-MCF-7細胞real-time PCR結果。研究結果顯示MCP-1過表達的乳腺癌細胞中p65、MMP2、STAT2基因的轉錄水平上調，同時RASSF1基因的轉錄水平下調，提示MCP-1有可能通過調節這些下游基因而發揮促進腫瘤細胞增殖浸潤及轉移。在這些下游基因中p65為核因子-核因子過調節這些下二聚體中的一種，研究發現該蛋白可以與多種基因啟動子或增強子上NF-中的結合位點特異性結合進而促進該基因的轉錄。在多種腫瘤細胞的研究均表明NF-點特通過促進細胞周期蛋白D1(CyclinD1)，pRB高磷酸化和G1/S其轉換來加速細胞周期的進行，抑制細胞分化，進而導致細胞周期的調節失控使細胞表現為無限增殖和自主分裂狀態，導致腫瘤的發生[20-21]。此外NF-2還參與了細胞粘附、血管生成相關細胞因子的轉錄調節，如細胞間粘連分子(ICAM)、基質金屬蛋白-9(MMP-9)環氧化酶-2(COX-2)等。基質金屬蛋白作為蛋白水解酶，可以降解細胞外基質及基底膜，是腫瘤侵襲轉移過程中最為關鍵的一步。此外MMP-2也具有促進腫瘤新生血管生成的作用[22-23]。由此可見，MCP-1可以通過對P65、MMP2、下游基因的調節來直接促進腫瘤細胞的增殖轉移。STATs為信號轉導及轉錄活化因子，是一類重要的核轉錄因子，其中STAT1和STAT2細胞凋亡調控有關，而STAT3作為癌基因的一種參與細胞增殖調控[24-25]。RASSF1也是一種可以直接參與細胞周期調控，在體內和體外能抑制細胞生長，并參與誘導細胞凋亡的蛋白。RASSF1基因的下調則可減少對細胞增殖的抑制，減少細胞凋亡。但在本研究的凋亡實驗中，未發現MCP-1有抑制乳腺腫瘤細胞凋亡的作用，提示可能存在其他信號途徑來對抗MCP-1對STAT2和 RASSF1的調節作用。

綜上所述，在本研究中我們利用慢病毒載體介導成功構建出可以過表達MCP-1基因的MCF-乳腺癌細胞。通過比較MCP-MCF-7細胞和EV-MCF-7細胞在細胞增殖能力，單克隆集落形成能力、劃痕愈合和transwell小室遷移能力，得出MCP-1本身即具有促進乳腺腫瘤細胞增殖轉移的能力，而非僅僅依靠其趨化功能吸引TAM等細胞進入腫瘤部位釋放各種細胞因子來促進腫瘤的增殖和轉移。通過real-time PCR實驗，發現MCP-1促腫瘤增殖能力可能是通過調節P65和MMP2基因的轉錄來完成的。

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Function of MCP-1 in malignant breast carcinoma cells proliferation and metastasis.

LV Ming-li,ZHOU Yun, ZHOU Lei-ping,NIU Jian-mei.Department of Ultrasonography,International Peace Maternity&Child Health Hospital, School of Medicine,Shanghai Jiaotong University,Shanghai 200030,CHINA

Objective To analyze the function of monocyte chemotactic protein-1(MCP-1)in promoting proliferation and metastasis of malignant breast cancer cells.MethodsMCF-7 cells with MCP-1 over-expression and no-load MCF-7 cells(control)were constructed,which were labeled as MCP-MCF-7 and EV-MCF-7 respectively.The CCK8 cells proliferation assay,colony formation assay,scratch assay and cell apoptosis assay were employed to measure the effect of MCP-1 over-expression on MCF-7 cells proliferation,metastasis and apoptosis.Real-time PCR was used to identify candidate downstream genes.ResultsThe MCP-1 over-expressed MC-7 cells and control cell line were successfully constructed.CCK8 assay showed that the absorbance of MCP-MCF-7 at 450 nm was higher than that of EV-MCF-7 from day 5,and the statistical significance was significant(P＜0.05).Colony formation assay illustrated that colony number was significantly higher in MCP-MCF-7 cells than the EV-MCF-7 cells(P＜0.05),and colony volume was larger in MCP-MCF-7 cells.Scratch assay demonstrated that the migratory ability of MCP-MCF-7 cell increased at 12 hours,and wound healing became more evident at 48 hours.The percentage of early apoptotic MCP-MCF-7 cells(0.57%)was lower than that in EV-MCF-7 cells(1.10%),with no statistically significant difference (P＞0.05),which suggested no effect on MCP-1 induced apoptosis in MCF-7 cells.Real-time PCR analysis of the MCP-1 downstream-regulated gene indicated that p65,MMP2 and STAT2 gene were up-regulated,while RASSF1 gene was down-regulated.ConclusionMCP-1 directly promotes breast carcinoma cell proliferation and metastasis.This effect may relate to candidate genes p65,MMP2,STAT2 and RASSF1.

MCP-1;Breast carcinoma cells;Proliferation;Metastasis

R737.9

A

1003—6350(2017)06—0861—06

10.3969/j.issn.1003-6350.2017.06.001

2016-12-16)

國家自然科學基金(編號：81402386)；中國福利會國際和平婦幼保健院優秀青年培育計劃

呂明麗。E-mail：great8181@sina.com