應用HPLC—ICP—MS聯用法分析飼料中As的四種形態

陳國++吳銀良

摘 要：應用HPLC-ICP-MS聯用技術對飼料中四種形態砷：亞砷酸（AsⅢ）、砷酸（AsⅤ）、一甲基砷酸（MMA）、二甲基砷酸（DMA）進行分析。試驗結果表明：方法檢出限低，線性相關系數良好，相對標準偏差均小于10%。對飼料做了三個水平的添加回收（10μg/kg、50μg/kg和100μg/kg），加標回收率均在78.8%～117%。實際樣品的分析結果表明，該方法檢出限低，準確度高，可用于飼料中砷的形態分析。

關鍵詞：HPLC-ICP-Ms；飼料；砷形態

中圖分類號 S132 文獻標識碼 A 文章編號 1007-7731（2017）06-0159-04

Determination of Arsenic Species Compounds in Feed by High Performance Liquid Chromatography-inductively Coupled Plasma Mass Spectrometry

Chen Guo et al.

（Ningbo Academy of Agricultural Sciences，Ningbo 315101，China）

Abstract：A High Performance Liquid Chromatography-inductively Coupled Plasma Mass Spectrometry（HPLC-ICP-MS） method was applied for determination of arsenite（AsⅢ），arsenate （AsⅤ），monomethy larsonic acid（MMA）and dimethylarsinic acid（DMA） in feed.The results showed that the limits of detection was low，the Correlation coefficients of the curves were good，and the relative standard derivations were less than 10%.The recoveries of the four arsenic species spiked in feed at three levels（10μg/kg、50μg/kg和100μg/kg） ranged from 78.8%～117%.The results showed that the method is much more precise，accurate and durable for the determination of arsenic species in feed.

Key words：High performance liquid chromatography-inductively coupled plasma mass spectrometry；Feed；Arsenic species

無機及有機砷化合物在工農業中的廣泛應用，使得相當數量的砷進入環境，并通過化學或生物過程在各砷化合物之間循環，常見的砷化合物包括：亞砷酸（AsⅢ）、砷酸（AsⅤ）、一甲基砷酸（MMA）、二甲基砷酸（DMA）、砷甜菜堿（AB）和砷膽堿（AC）等，不同形態的砷具有不同毒性，因此，對砷的形態分析研究越來越多，也備受關注[1-2]。亞砷酸主要成分As2O3，俗稱砒霜，砷酸毒性次之，一甲基砷酸（MMA）、二甲基砷酸（DMA）已被證明是潛在的致癌物質，而砷甜菜堿（AB）和砷膽堿（AC）則被認為無毒的。目前，有機砷制劑作為一種飼料添加劑廣泛應用于畜禽養殖業，有機砷類制劑具有刺激動物生長的作用，而且具有較廣的抗菌譜，可以改善肉類品質[3-4]。所以，按照飼料衛生標準（GB13078-2001）對畜禽飼料中的總砷測定，很難反應畜禽飼料質量安全狀況，對飼料中亞砷酸（AsⅢ）、砷酸（AsⅤ）、一甲基砷酸（MMA）、二甲基砷酸（DMA）進行形態分析就顯得尤為重要。目前，對于砷的形態的分析，目前應用的最為先進的方法為HPLC-ICP-Ms聯用技術。它將HPLC高效分離的特點和ICP-Ms對于重金屬元素的檢出限低、線性范圍寬以及同時測定多種元素相結合，對于不同形態的重金屬測定取得了良好的效果。目前HPLC-ICP-Ms聯用技術已經被廣泛的應用于蔬果[5]、稻米[6]、中藥[7]、肉類[8-9]、煙草[10]、土壤[11]、水[12]、水產品[13-14]中不同形態的砷以及食鹽中不同形態的碘[15]、肉類中不同形態的硒[16]含量的測定。但是對于飼料中不同形態砷的測定卻鮮有報道。本文采取1%硝酸溶液浸提，應用HPLC-ICP-Ms法聯用技術對砷的形態進行分離、測定，取得了良好的效果。

1 試驗部分

1.1 主要儀器與裝置 350D型電感耦合等離子質譜儀（ICP-MS）：美國PE公司，配有碰撞模式和反應模式兩種干擾消除模式；2695型高效液相色譜儀：美國WATERS公司；Milli-Q超純水儀：美國Millipore公司；3K15型離心機：德國SIGMA公司；Quiuti X124型電子天平：賽多利斯。

1.2 主要材料與試劑 硝酸（優級純蘇州晶瑞化學股份有限公司），磷酸（優級純國藥集團化學試劑有限公司），氫氧化銨（優級純 國藥集團化學試劑有限公司），實驗用水為Mili-Q高純水。

As形態標準溶液：亞砷酸、砷酸、一甲基砷酸、二甲基砷酸均購于中國計量科學研究院。4種砷形態混合標準儲備液：用純水將砷形態標準物質稀釋為質量濃度均為2mg/L（以As計）的混合標準儲備液，置于4℃冰箱中避光保存。As形態混合工作液現用現配。

實驗室飼料樣品隨機采購于當地農貿市場。

1.3 試驗條件

1.3.1 HPLC條件 色譜柱：HAMILTON 79433 PRP-100X，10μm*4.1×250mm。等度洗脫流動相：15mmol/L磷酸二氫銨溶液（pH6.0）（配制方式：1L超純水中加1.67g磷酸，用氫氧化銨調節pH值6.0），流速：2.0mL/min，進樣體積：100μL。

1.3.2 ICP-MS條件 RF入射功率1600W，等離子體氣體流速18L/min，輔助氣流速1.2L/min，霧化氣流量1.0L/min，檢測質量數m/z=75（As），分兩種模式采集數據，（standard模式：RPa=0，RPq=0.25；KED模式：He：3.2mL/min，RPa=0，RPq=0.25）。

1.4 樣品預處理 稱取0.50g仔豬飼料樣品，于50mL塑料離心管中，加入20mL 1%硝酸溶液浸提，放置過夜。于90℃恒溫箱中熱浸提2.5h，期間0.5h振蕩1min。取出冷卻至室溫，8 000r/min離心15min，吸取上清液，用0.45μm有機膜過濾后待測。樣液經HPLC分離后，ICP-MS法測定。

2 結果與討論

2.1 色譜分離條件選擇 亞砷酸（AsⅢ）、砷酸（AsⅤ）、一甲基砷酸（MMA）、二甲基砷酸（DMA）呈弱酸或中強酸，在適宜的pH值條件下以陰離子的形式存在，適用陰離子交換機理來分離陰離子。HAMILTON 79433 PRP-100X陰離子交換柱對砷化物具有較好的分離效果，應用Standard（圖1）和KED（圖2）模式對標準品（AsⅢ、DMA、MMA、As）測定了4種As形態標準溶液的色譜圖，均取得了良好的效果。

2.2 質譜條件的選擇 試驗采用standard模式和KED模式進行數據采集，從圖譜比對結果看，在standard模式下，ArCl（分子量74.9112）并未對樣品中As（分子量74.9216）分析形成干擾，采用standard模式，靈敏度更高，線性相關系數r2>0.999，達到分析要求。

2.3 線性和檢出限 分別配置不同形態砷的標準系列溶液：標準溶液1：AsⅢ、AsⅤ、MMA、DMA，ρ=1.0μg/L，標準溶液2：AsⅢ、AsⅤ、MMA、DMA，ρ=2.0μg/L，標準溶液3：AsⅢ、AsⅤ、MMA、DMA，ρ=5.0μg/L，標準溶液4：AsⅢ、AsⅤ、MMA、DMA，ρ=10.0μg/L，標準溶液5：AsⅢ、AsⅤ、MMA、DMA，ρ=20.0μg/L，得到不同形態砷標準圖譜（圖3）和回歸方程（表1）。由表可見，線性關系良好，相關系數r2>0.999。

取混合標準溶液，用1% HNO3稀硝酸逐級稀釋，直至色譜圖中四種形態色譜峰的信噪比（S/N）約為3的濃度為該種形態砷的儀器檢出限。取樣量為0.5g，定容體積為20mL時，方法檢出限見table.1。

圖3 系列標準溶液分離圖譜疊加效果圖

表1 不同形態砷標準溶液回歸方程和方法檢出限

[形態分析＼&線形關系＼&r2＼&LOD /（μg/kg）＼&As（Ⅲ）＼&y=192.352x+446.477＼&0.999782＼&2.0＼&As（Ⅴ）＼&y=836.026x+301.382＼&0.999162＼&2.4＼&MMA＼&y=982.112x+308.179＼&0.999983＼&2.2＼&DMA＼&y=1181.77x+499.274＼&0.999319＼&2.2＼&]

2.4 樣品分析 精密稱取飼料樣品0.5g，按照上述方法進行6次平行測定，得到樣品色譜圖（圖4）樣品中As（Ⅲ）含量為20.2μg/L，As（Ⅴ）含量為96.6μg/L，RSD分別為2.37%和4.89%，均未檢出MMA和DMA，重復性良好。試驗過程進行了三種水平添加回收試驗，得到相關數據見表2，從表中得到高、中、低三個濃度的加標回收率都在78.8%～117%之間，RSD<10%。

圖4 飼料樣品色譜

表2 不同水平添加回收試驗結果

[Speciations＼&Original

（μg/kg）＼&Added

（μg/kg）＼&Found

（μg/kg）＼&Recover（%）＼&RSD（n=3） （%）＼&As（Ⅲ）＼&20.2＼&10＼&28.3＼&81.0＼&5.06＼&50＼&65.7＼&91.0＼&4.55＼&100＼&115＼&94.8＼&3.08＼&DMA＼&ND＼&10＼&10.3＼&103＼&2.78＼&50＼&48.5＼&97.0＼&3.08＼&100＼&98.7＼&98.7＼&3.22＼&MMA＼&ND＼&10＼&9.80＼&98.0＼&1.23＼&50＼&47.3＼&94.6＼&6.35＼&100＼&96.5＼&96.5＼&6.88＼&As（Ⅴ）＼&96.6＼&10＼&110.3＼&117＼&2.34＼&50＼&136＼&78.8＼&5.55＼&100＼&178＼&81.4＼&7.38＼&]

3 小結

本實驗建立了HPLC-ICP-Ms聯用技術同時測定了飼料中4種砷的形態（亞砷酸（AsⅢ）、砷酸（AsⅤ）、一甲基砷酸（MMA）、二甲基砷酸（DMA））的分析方法。以1%硝酸水溶液為提取劑，HAMILTON 79433 PRP-100X陰離子交換柱對4種形態的砷進行分離，ICP-Ms檢測，4種砷形態化合物的檢出限為2.0～2.4μg/kg，方法RSD均小于10%，加標回收率在78.8%～117%。通過對實際樣品的分析，該方法操作簡單、快捷，方法的靈敏度和準確度均較高。由此可見，本方法適合于飼料中4種形態砷的準確定性、定量分析。

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（責編：張長青）