柚皮素通過PI3K/Akt通路拮抗血小板聚集的體外研究*

黃曼婷， 吳煥林， 徐丹蘋△

(1廣州中醫藥大學第二臨床醫學院，2廣東省中醫院，廣東 廣州 510020)

柚皮素通過PI3K/Akt通路拮抗血小板聚集的體外研究*

黃曼婷1， 吳煥林2， 徐丹蘋2△

(1廣州中醫藥大學第二臨床醫學院，2廣東省中醫院，廣東 廣州 510020)

目的： 探討柚皮素拮抗二磷酸腺苷(ADP)誘導的血小板聚集的作用及機制。方法：采用血小板聚集儀觀察不同濃度柚皮素對ADP誘導的大鼠血小板聚集的影響。采用熒光顯微鏡觀察柚皮素對血小板在固化纖維蛋白原上擴展功能的影響。采用Western blot檢測磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)表達及蛋白激酶B(Akt)磷酸化水平。結果：柚皮素能劑量依賴性地抑制ADP誘導的體外血小板聚集，其半數抑制濃度(IC50)值為(132.1 ± 31.7)μmol/L。柚皮素灌胃給藥，對ADP誘導的大鼠體內血小板聚集也有明顯的抑制作用。柚皮素還能顯著抑制血小板在固化纖維蛋白原上的擴展。Western blot結果顯示，柚皮素能明顯抑制ADP刺激的PI3K表達和Akt磷酸化，同時，PI3K廣譜抑制劑LY294002能增強柚皮素對Akt磷酸化的抑制作用。結論：柚皮素可能通過抑制血小板PI3K/Akt信號通路發揮抗血小板聚集的作用。

柚皮素； 血小板聚集； 二磷酸腺苷； PI3K/Akt信號通路

血小板是循環在血液中的一種沒有細胞核的顆粒，主要功能是參與止血與血栓形成。它們以非活化的形式在機體中循環，直到它們接觸到內皮細胞的缺損區或遇到凝血級聯反應才被活化，此時血小板黏附于內皮細胞的缺損部位，發生形變，釋放顆粒內容物，包括二磷酸腺苷(adenosine diphosphate，ADP)、血栓素A2(thromboxane A2，TXA2)、5-羥色胺(5-hydroxy tryptamine，5-HT)等，并相互黏附形成聚集物，進一步促進血小板活化。與此同時能引發多個信號通路的交叉反應，尤其是內源性的信號擴增機制，誘導整合素的“由內-向外”信號轉導，激活整合素αIIbβ3，引起血小板黏附和聚集，最終觸發整合素誘導的 “由外-向內”信號轉導，促進血小板顆粒的進一步釋放及增加血小板聚集的穩定性[1-2]。不恰當的或過度的血小板活化會導致急性血管阻塞，比如急性心肌梗死的發生，在冠狀動脈或者頸動脈的動脈粥樣硬化中，血小板也牽涉其中[3]。血小板聚集和血栓形成是心腦血管病的主要致病因素，因此，抗血小板治療已成為目前心臟病治療中不可或缺的一種手段，開發新型、安全有效的抗血小板聚集藥物，用于防治心腦血管疾病是一項緊迫任務。

柚皮素是柚皮苷的苷元，屬于二氫黃酮類化合物，主要存在于蕓香科植物——葡萄、葡萄柚、西紅柿以及柑橘類水果中，也是中藥化橘紅的主要有效成分。近年來國內外藥理研究表明，柚皮素具有抗氧化、抗炎、抗心律失常、調節脂代謝以及預防動脈粥樣硬化等多種藥理活性，在防治心腦血管疾病方面越來越受到重視，可被開發應用于醫藥、食品等領域。我們前期研究發現柚皮素能抑制ADP誘導的血小板聚集，但是其抗血小板的機制未進行深入探討。本研究通過體外實驗探討柚皮素抗血小板聚集可能的機制，為尋找新的抗血小板負性調節靶點提供實驗依據。

材 料 和 方 法

1 主要材料與儀器

柚皮素購自成都曼思特生物科技有限公司，純度大于98.0%；阿司匹林購自阿拉丁生化科技股份有限公司，純度為99%；硫酸氫氯吡格雷片購自賽諾菲制藥有限公司；ADP、鬼筆環肽、前列腺素E1(prostaglandin E1，PGE1)、纖維蛋白原、apyrase購自Sigma-Aldrich；LY294002購自Abcam；磷脂酰肌醇3-激酶(phosphoinositide 3-kinase, PI3K)p110 β Ⅰ抗、磷酸化Akt (Ser 473) Ⅰ抗、Akt Ⅰ抗、GAPDH Ⅰ抗、辣根過氧化酶標記山羊抗兔IgGⅡ抗購自Cell Signaling Technology；West Pico 化學發光底物購自Pierce Biotechnology；PVDF膜購自Millipore。LBY-NJ4血小板聚集儀為北京普利生儀器有限公司產品。

2 方法

2.1 洗滌血小板的制備[4-5]正常SD大鼠以10%水合氯醛(0.35 g/kg)腹腔注射麻醉，腹主動脈穿刺取血，用3.2%枸櫞酸鈉溶液與血以1∶9的比例抗凝，向混勻的全血中加入PGE1(終濃度0.1 mg/L)，將全血混勻后，300×g離心6 min。吸取上層血漿，加入PGE1(終濃度0.1 mg/L)，900×g離心10 min，棄去上清液，得到濃縮血小板團塊，加入適量Tyrode buffer (12 mmol/L NaHCO3、138 mmol/L NaCl、5.5 mmol/L glucose、2.9 mmol/L KCl、2 mmol/L MgCl2、0.42 mmol/L NaH2PO4、10 mmol/L HEPES，pH 7.4)及PGE1(終濃度0.1 mg/L)，巴氏吸管輕柔吹打，重懸血小板。900×g離心5 min，棄去上清液，得到血小板團塊，重懸血小板沉淀于含2×10-5U/L 腺苷三磷酸雙磷酸酶的Tyrode buffer 中，血小板終濃度調整至4×1011/L。

2.2 富血小板血漿(platelet-rich plasma,PRP)的制備[6]SD大鼠隨機分為5組，每組6只：正常對照組、柚皮素低劑量組、柚皮素中劑量組、柚皮素高劑量組、氯吡格雷組。柚皮素低、中、高劑量組分別灌胃給予200 mg/kg、400 mg/kg、800 mg/kg柚皮素，氯吡格雷組灌胃給予氯吡格雷7.875 mg/kg，正常對照組給予等體積生理鹽水。每天灌胃1次，共7 d。于末次給藥1 h后，腹主動脈取血，用3.2%枸櫞酸鈉溶液與血漿以1∶9的比例抗凝，血樣經1 000 r/min離心10 min，取上層液即為PRP，剩余血液以3 000 r/min離心10 min，得貧血小板血漿(platelet-poor plasma, PPP)。用PPP調整血小板計數為4×1011/L，進行血小板聚集功能測定。

2.3 血小板聚集功能測定[7-8]按Born比濁法進行血小板聚集性測定。用300 μL Tyrode buffer 作為參比，于比濁管中加入洗滌血小板300 μL，不同濃度藥物各5 μL，37 ℃孵育5 min后，加入誘導劑ADP(終濃度10 μmol/L)，并記錄300 s 內最大聚集率(用ADP誘導洗滌血小板聚集，必須加入2 mmol/L CaCl2和0.3 g/L人纖維蛋白原)。

2.4 血小板在纖維蛋白原上的擴展 潔凈的圓形蓋玻片(截面厚200 μm)用50 mg/L纖維蛋白原(200 μL) 4 ℃包被過夜，次日吸出過夜包被的纖維蛋白原溶液，PBS洗滌蓋玻片2次后，加入1% 牛血清白蛋白溶液常溫靜置60 min，吸出封閉液。洗滌血小板(4×1011/L)預先加入不同濃度的柚皮素孵育5 min，然后把血小板滴在纖維蛋白原包被的蓋玻片上，放置于5% CO2培養箱內37 ℃孵育45 min，用PBS輕輕沖洗3次，把未黏附的血小板沖走，然后用4%多聚甲醛固定20 min，再用PBS沖洗3次，避光加入200 μL鬼筆環肽(1 mg/L)，暗室放置60 min后吸除，PBS洗滌3次，用熒光顯微鏡觀察黏附的血小板，記錄并及時保存。

2.5 Western blot 檢測蛋白水平 血小板聚集反應結束后，馬上將洗滌血小板放于冰上終止反應。3 000×g離心3 min，得血小板沉淀，用PBS洗2次，加入適量細胞裂解液，置冰上裂解30 min，12 000×g離心10 min，所得上清即為細胞總蛋白。留取20 μL裂解后的樣本進行BCA蛋白定量，剩下的樣本加入5×loading buffer，100 ℃煮5 min，分裝，-80 ℃保存。取40 μg樣本上樣，將樣本電泳、轉膜，用5% BSA室溫封閉1 h，洗膜3次。分別加入特異性抗體(PI3K p110β、Akt、p-AktSer 473、GAPDH)，室溫輕柔振動孵育1 h后，放入4 ℃冰箱孵育過夜。洗膜3次后，加入Ⅱ抗，室溫孵育1 h，洗膜3次。使用ECL化學發光，用凝膠成像儀成像。

3 統計學處理

采用SPSS 17.0 統計軟件對實驗數據進行統計分析，結果用均數±標準差(mean±SD)表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較用LSD法，以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 柚皮素對血小板聚集的影響

10 μmol/L ADP能誘導洗滌血小板發生較強的聚集，5 min內最大聚集率為(66.8±3.1)%， 分別用100 μmol/L、200 μmol/L、400 μmol/L和800 μmol/L柚皮素預處理洗滌血小板后，血小板聚集率明顯降低，對應的聚集率分別為(38.5±4.4)%、(26.7±8.1)%、(7.7±1.0)%和(4.9±1.6)%,與單純ADP刺激組(對照組)比較，差異均具有統計學意義(P<0.01)。其中，柚皮素抑制ADP誘導的血小板聚集的IC50值為(132.1±31.7)μmol/L。灌胃給予不同劑量的柚皮素(200、400、800 mg/kg)均顯著抑制ADP引起的血小板聚集，且抑制作用呈現劑量依賴性。在高劑量時，柚皮素對ADP引起的血小板聚集的抑制作用與氯吡格雷相當，見圖1。

Figure 1.Naringenin inhibited ADP-induced platelet aggregation in vitro and in vivo. A: the rat washed platelet aggregation performed in the presence or absence of various concentrations of naringenin was recorded after stimulation with 10 μmol/L ADP; B: effect of naringenin on ADP-induced platelet aggregation in rats in vivo. Mean±SD. n=6. **P<0.01 vs control group.

Figure 2.Naringenin inhibited rat platelet spreading on immobilized fibrinogen. The platelet spreading was visualized under fluorescence microscope. Mean±SD. n=3. **P<0.01 vs control.

2 柚皮素對血小板在纖維蛋白原上擴展的影響

如圖2所示，血小板在固定化的纖維蛋白原上作用45 min后，可以完全地鋪展，其鋪展面積百分率為(30.37±3.31)%。當分別用100 μmol/L、200 μmol/L、400 μmol/L、800 μmol/L的柚皮素作用5 min后，血小板在纖維蛋白原上的鋪展受到了明顯的抑制，呈劑量相關性(P<0.01)，鋪展面積百分率與對照組相比分別下降到了(20.96±5.08)%、(15.29±1.87)%、(10.56±0.79)%和(6.98±2.74)%。

3 柚皮素對PI3K表達和Akt磷酸化的影響

ADP刺激血小板活化可使PI3K蛋白水平明顯增高，柚皮素處理能明顯抑制PI3K的表達，見圖3。當ADP刺激血小板后會增加Akt的磷酸化，柚皮素可以顯著抑制Akt的磷酸化，見圖4。

Figure 3.Naringenin inhibited PI3K expression in ADP (10 μmol/L)-stimulated platelets. R: resting platelets. Mean±SD. n=3. *P<0.05, **P<0.01 vs control group.

4 PI3K抑制劑LY294002對Akt磷酸化的影響

我們使用PI3K廣譜抑制劑LY294002進一步明確柚皮素對PI3K/Akt活化的影響。實驗結果顯示，單獨使用較低濃度的LY294002或柚皮素不能完全抑制Akt磷酸化，二者合用時可以進一步抑制Akt磷酸化，說明柚皮素和PI3K抑制劑具有協同抑制Akt磷酸化作用，見圖5。

討 論

Figure 4.Naringenin inhibited Akt phosphorylation in ADP (10 μmol/L)-stimulated platelets. R: resting platelets. Mean±SD. n=3. *P<0.05, **P<0.01 vs control group.

Figure 5.The effect of naringenin on Akt phosphorylation in ADP-stimulated platelets. Mean±SD. n=3.**P<0.01 vs ADP group; #P<0.05 vs ADP+naringenin.

ADP是第一個已知的低分子血小板弱活化劑，它對血小板功能有決定性的作用。當血小板活化后，ADP從血小板致密顆粒中釋放，作為二次激動劑，通過作用于多種受體，增強自身及其它血小板誘導劑的效果，放大血小板反應，并有助于血栓的穩定化[9]。人類血小板至少表達2個明確的ADP受體，分別為P2Y1和P2Y12，它們屬于G蛋白偶聯受體的嘌呤能類。ADP引起的血小板最佳活化需要P2Y1和P2Y12的活化[10]。Gq偶聯的P2Y1受體介導磷脂酶C的β亞型活化，導致細胞質的Ca2+水平暫時升高、整合素αIIbβ3活化、血小板變形和聚集。Gi偶聯的P2Y12受體可以使腺苷酸環化酶(adenylate cyclase，AC)下調，從而降低環磷酸腺苷(cyclic adenosine monophosphate，cAMP)濃度，同時激活PI3K的β、γ受體，最終活化鳥苷三磷酸酶，抑制環磷酸鳥苷生成，減少對磷酸二酯酶的抑制，從而使cAMP降解，最終導致血小板聚集[11]。由于P2Y12只在血小板和腦中表達，相對于P2Y1更有選擇性，因此目前抗ADP受體的藥物主要是針對P2Y12受體的。

近年來，PI3K-Akt信號通路在血小板聚集和穩定血栓中的作用越來越受到重視。PI3K是一種細胞內磷脂酰肌醇激酶，在血小板的功能反應和血栓形成方面發揮重要作用[12]。根據其基本結構、調節方式和作用底物的不同，PI3K可以分為Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型，其中Ⅰ型(PI3Kα、PI3Kβ、PI3Kδ和PI3Kγ)均發現在人和鼠血小板中表達，是與血小板密切相關的、研究比較成熟的亞型[12]。近年來，越來越多研究表明，PI3Kp110β在動脈血栓形成血小板作用方面處于核心地位。一系列研究發現PI3Kp110β抑制劑或PI3Kp110β缺陷，均能影響血小板的活化和防止動脈血栓的形成，并提出PI3Kp110β有可能成為抗血栓藥物的新靶點[13-16]。我們觀察了柚皮素對PI3Kp110β蛋白表達的影響，實驗結果顯示，用ADP刺激血小板活化可使PI3Kp110β表達顯著升高，同時，柚皮素處理均可顯著抑制ADP誘導的PI3Kp110β蛋白表達。Akt是PI3K下游的信號分子，PI3K的激活能導致Akt的磷酸化，Akt是一個廣泛被接受的PI3K/Akt信號通路的活化標志。Akt在介導血小板顆粒釋放、血小板聚集和血栓形成中起重要作用，因此，PI3K/Akt信號通路已經成為一個新興的治療血小板相關疾病的靶點[17-18]。我們的研究發現，柚皮素可以抑制ADP誘導的Akt磷酸化，并呈劑量相關性，200 μmol/L柚皮素即可明顯抑制Akt的磷酸化，表明柚皮素通過抑制PI3K-Akt信號通路從而發揮抗血小板聚集作用的。進一步對PI3K活性分析顯示，柚皮素和PI3K抑制劑具有協同抑制Akt磷酸化的作用，而PI3Ks可以被酪氨酸激酶調控[19]，從而表明柚皮素抑制效果的產生可能與對酪氨酸激酶信號通路的影響有關。

整合素受體αIIbβ3在血小板中介導了2種信號通路[“由內-向外”的信號通路(inside-out)和“由外-向內”的信號通路(outside-in)]。血小板的聚集反映了inside-out信號，上述實驗已證實柚皮素能調控這一信號。血小板在纖維蛋白原上的擴展實驗可以反映柚皮素對outside-in信號的調控。我們的研究結果顯示柚皮素能明顯抑制血小板在固化纖維蛋白原上的擴展。血小板與纖維蛋白原的結合主要依賴整合素αIIbβ3 介導的inside-out這一信號轉導過程，柚皮素可以有效抑制這個過程，而血小板在纖維蛋白原上的擴展是依賴于αIIbβ3 介導的outside-in信號轉導過程的，柚皮素同樣能有效抑制這一過程，而αIIbβ3介導的inside-out和outside-in 2個過程均受PI3K調控[15-16]，這表明柚皮素可能通過PI3K/Akt這一過程發揮抗血小板作用的。

綜上所述，柚皮素可以抑制ADP誘導的洗滌血小板聚集，同時可以抑制血小板擴展功能。柚皮素抗血小板作用的潛在分子機制可能與抑制PI3K/Akt信號通路有關，這將為其防治心腦血管疾病的研究提供實驗依據。

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(責任編輯： 林白霜， 余小慧)

Antiplatelet aggregation of naringenin via inhibiting PI3K/Akt signalinginvitro

HUANG Man-ting1, WU Huan-lin2, XU Dan-ping2

(1TheSecondClinicalCollege,GuangzhouUniversityofChineseMedicine,2GuangdongProvincialHospitalofTraditionalChineseMedicine,Guangzhou510020,China.E-mail:danpingxu@hotmail.com.cn)

AIM: To investigate the antiplatelet aggregation of naringenin and its possible mechanism. METHODS:The effects of naringenin at different concentrations on adenosine diphosphate (ADP)-induced platelet aggregation and platelet spreading on immobilized fibrinogen were detected by aggregational detector and observed under fluorescence microscope, respectively. The expression of phosphoinositide 3-kinase (PI3K) and the phosphorylation of Akt were analyzed by Western blot.RESULTS:Naringenin significantly inhibited ADP-induced platelet aggregation in a dose-dependent mannerinvitroandinvivo, and inhibited platelet’s spreading on immobilized fibrinogeninvitro. Further studies indicated that naringenin inhibited platelet activation accompanied by attenuating not only the activation of PI3K, but also the phosphorylation of Akt. Moreover, naringenin combined with LY294002 additively inhibited the ADP-induced platelet aggregation. CONCLUSION: Naringenin may inhibit platelet activation by regulation of PI3K/Akt signaling pathway.

Naringenin; Platelet aggregation; Adenosine diphosphate; PI3K/Akt signaling pathway

1000- 4718(2017)03- 0517- 06

2016- 09- 26

2016- 11- 15

國家自然科學基金資助項目(No. 81403341)；廣東省中醫藥管理局科技專項(No. 20141093)；廣東省科技計劃項目(No. 2016A020226011)

△通訊作者 Tel: 020-39318374; E-mail: danpingxu@hotmail.com.cn

R363

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.03.022