鈣敏感受體通過PI3K/AKT通路對缺氧誘導的A549細胞增殖的影響*

李光偉， 苗宏志， 李 波， 沈云虹， 邱麗萍， 張亞珍， 金香蘭， 朱坤杰△

(1齊齊哈爾醫學院病理生理教研室， 2齊齊哈爾市第一醫院胸心外科， 3齊齊哈爾醫學院機能實驗室， 黑龍江 齊齊哈爾 161006)

鈣敏感受體通過PI3K/AKT通路對缺氧誘導的A549細胞增殖的影響*

李光偉1， 苗宏志2， 李 波1， 沈云虹3， 邱麗萍3， 張亞珍3， 金香蘭3， 朱坤杰3△

(1齊齊哈爾醫學院病理生理教研室，2齊齊哈爾市第一醫院胸心外科，3齊齊哈爾醫學院機能實驗室， 黑龍江 齊齊哈爾 161006)

目的： 探討鈣敏感受體(calcium-sensing receptor，CaSR)在缺氧誘導的A549及A549/DDP細胞增殖中的信號轉導途徑。方法: 通過缺氧培養箱內(93%N2、2% O2、5% CO2)培養24 h的方法復制細胞缺氧模型。應用Western blot技術分析PCNA及p-AKT蛋白不同處理情況下的表達水平；采用流式細胞技術檢測不同處理因素對細胞周期及增殖指數的影響，應用BrdU摻入法分析不同處理因素對細胞DNA合成的影響。結果: 缺氧引起A549及A549/DDP細胞PCNA及p-AKT蛋白水平上調，增加 BrdU 摻入量、S期細胞數量和細胞增殖指數，GdCl3能夠增強缺氧的作用，但上述效應可以被LY294002抑制。結論: PI3K/AKT信號通路在缺氧活化CaSR并促進A549及A549/DDP細胞增殖中起重要作用。

鈣敏感受體； A549細胞； 缺氧； 細胞增殖； PI3K/AKT信號通路

近年來肺癌成為我國第一大癌癥[1]，發病率和死亡率逐年提高。鈣信號轉導在肺癌發生中起重要作用，但其具體機制不詳。鈣敏感受體(calcium-sensing receptor，CaSR)是1993年發現的一種G蛋白偶聯受體[2]，在腫瘤的發生中發揮著重要作用，但它在肺癌中的作用未見報道。我們前期研究發現非小細胞肺癌組織中有CaSR蛋白的表達，其表達強度隨腫瘤分化程度、TNM分期、腫瘤大小及淋巴結轉移情況有關，提示非小細胞肺癌中CaSR的表達可能與腫瘤細胞的增殖、侵襲和轉移密切相關[3]。為探究CaSR在肺癌增殖中的具體機制，我們以A549細胞為研究對象，做如下研究，以期為肺癌的臨床防治提供新思路和新靶點。

材 料 和 方 法

1 細胞、主要試劑和儀器

人肺癌細胞系A549和A549/DDP購置于中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心。

細胞周期試劑盒購置于Becton Dickinson；BrdU購置于Roche；抗增殖細胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen，PCNA)、AKT和p-AKT的Ⅰ抗及Ⅱ抗均購自于Santa Cruz；細胞缺氧培養箱和酶標儀為Thermo產品；流式細胞儀為Becton Dickinson產品。

2 方法

2.1 實驗分組及缺氧模型的復制 對照(control)組：細胞去血清培養24 h后，正常條件培養24 h；缺氧(hypoxia, H)組：細胞去血清培養24 h后，置于細胞缺氧培養箱內培養24 h (93% N2、2% O2、5% CO2)；GdCl3干預組(H+GdCl3組)：細胞去血清培養24 h，加入GdCl3(300 μmol/L)后，置于細胞缺氧培養箱內培養24 h；LY294002干預組(H+LY組)：細胞去血清培養24 h，加入LY294002(10 μmol/L)孵育30 min后加入GdCl3(300 μmol/L)，置于缺氧培養箱內培養24 h。

2.2 Western blot分析CaSR、PCNA、AKT和p-AKT的蛋白水平 A549及A5459/DDP細胞刮下后加入蛋白裂解液及PMSF，冰上放置40 min，12 000 r/mim 4 ℃離心 20 min，取上清進行蛋白定量。取20 μg蛋白樣品，10% SDS-PAGE分離蛋白，100 V轉移1 h至硝酸纖維素薄膜，封閉液中封閉1 h； 分別加入PCNA(1∶500)、AKT(1∶500)、p-AKT (1∶500)和GAPDH(1∶500)I抗，4 ℃過夜。洗膜，堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，AP)標記的抗IgG抗體(1∶1 000)孵育1 h，最后用顯色劑(Promega)顯色，吸光度掃描半定量分析顯影條帶[4-6]。

2.3 流式細胞術檢測細胞增殖周期 分別取各組細胞，經0.25%胰蛋白酶消化，PBS洗滌，調整細胞密度為1×106/L，制成單細胞懸液，2 000 r/min離心5 min，PBS洗滌，2 000 r/min離心5 min，加3 mL預冷的乙醇固定，4 ℃過夜，2 000 r/min離心5 min，加入緩沖液3 mL洗滌，2 000 r/min離心5 min，加A液(trypsin buffer)250 μL，室溫作用10 min，加B液(trypsin inhibitor and RNase buffer)200 μL，室溫作用10 min，加預冷的C液(PI stain solution)200 μL，室溫避光10 min，上機檢測[7]。

2.4 DNA BrdU摻入法測定細胞增殖 細胞種在96孔板上，每孔3 500個。各組細胞去血清培養24 h后按照實驗方法2.1分別給藥及復制模型，每孔加入BrdU標記的溶液(10 μmol/L)，固定60 min，過氧化物酶標記的抗BrdU抗體(1∶100)室溫孵育90 min，細胞沖洗3次，底物溶液室溫孵育5 min， 酶標儀測定450 nm波長處吸光度(A)值[7]。

3 統計學處理

統計學處理使用 SPSS 17.0軟件。數據以均數±標準差(mean±SD)表示，多組間均數比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK-q檢測。以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 不同處理因素對CaSR表達的影響

與對照組比較，缺氧組CaSR表達增加(P<0.05)，GdCl3能增加其表達(P<0.05)，NPS2390(CaSR抑制劑)的作用相反，A549/DDP細胞與A549細胞CaSR蛋白表達結果一致,見圖1。

Figure 1. The protein expression of CaSR determined by Western blot in different groups of the A549 and A549/DDP cells. H： hypoxia. Mean±SD. n=3. △P<0.05 vs control group; *P<0.05 vs H group.

2 不同處理因素對PCNA表達的影響

在A549及A549/DDP細胞中，缺氧組PCNA蛋白表達增加(P<0.05)；缺氧基礎上GdCl3能上調這種增加(P<0.05)；LY294002(PI3K抑制劑)則能夠抑制PCNA的表達上調(P<0.05),見圖2。

Figure 2. The protein expression of PCNA determined by Western blot in different groups of the A549 and A549/DDP cells. H: hypoxia； LY: LY294002. Mean±SD. n=3. △P<0.05 vs control group; *P<0.05 vs H group; #P<0.05 vs H+GdCl3 group.

3 不同處理因素對細胞周期及細胞增殖指數的影響

在A549細胞，與control組比較，缺氧組G0/G1期細胞比例顯著降低，S和G2/M期細胞比例均顯著增加。細胞增殖指數 (proliferation index，PI) 計算結果顯示，缺氧狀態下PI比對照組增加，是對照組的1.34倍(P<0.05)；而H+GdCl3組S和G2/M期細胞比例明顯增加，PI值明顯增高，達到30.55，高于缺氧組(P<0.05)；LY294002可抑制缺氧誘導的A549細胞增殖，PI指數回落到20.48。A549/DDP細胞的變化趨勢與A549細胞一致，見圖3。

Figure 3.The cell cycle analysis by flow cytometry in the A549 and A549/DDP cells. H: hypoxia; LY: LY294002. Mean±SD. n=3. △P<0.05 vs control group; *P<0.05 vs H group; #P<0.05 vs H+GdCl3 group.

4 不同處理因素對BrdU摻入量的影響

對照組BrdU摻入量作為100%，其它組的BrdU摻入量表示為對照組的百分數。A549和A549/DDP細胞結果均顯示，與對照組相比，缺氧組的BrdU摻入量增加(P<0.05)；而H+GdCl3組的BrdU摻入量顯著高于缺氧組(P<0.05)； LY294002可抑制缺氧和GdCl3誘導的細胞增殖，BrdU摻入量降低(P<0.05),見圖4。

Figure 4. The cell proliferation determined by BrdU incorporation assay in the A549 and A549/DDP cells. H: hypoxia; LY: LY294002. Mean±SD. n=3. △P<0.05 vs control group; *P<0.05 vs H group; #P<0.05 vs H+GdCl3 group.

5 不同處理因素對p-AKT蛋白水平的影響

2種細胞Western blot檢測結果顯示，和對照組比較，缺氧能夠上調p-AKT蛋白的水平(P<0.05)；缺氧基礎上GdCl3能夠進一步增加p-AKT蛋白的水平(P<0.05)；這種促進效應可以被PI3K通路阻斷劑LY294002抑制(P<0.05),見圖5。

討 論

肺癌居惡性腫瘤發病率之首，嚴重威脅著人類的健康。目前我國已為世界第一肺癌大國，因此肺癌的診斷和治療已成為我國臨床工作者必須面臨的嚴峻挑戰。鈣離子作為細胞內重要的信息分子可以激活不同的信號通路，參與許多重要生命活動的調節。惡性腫瘤發生發展過程常伴隨鈣離子信號的異常，但其發生機制不甚清楚。因此，認識肺癌發生、發展的分子機制，對于改善患者預后，提高其生存質量有重要意義。

CaSR是細胞膜上一種G蛋白偶聯受體。1993年Brown等[2]首先從牛的甲狀旁腺中克隆出來。在體內分布廣泛，功能主要是維持Ca2+和其它金屬離子穩態，此外在細胞分泌、增殖、分化、趨化、凋亡、基因表達、維持膜電位、離子通道開關、衰老等過程中亦發揮重要作用[8]。大量研究表明，其在腫瘤的發生發展過程中發揮著重要作用。CaSR是影響乳腺癌預后的獨立風險因子[9-11]。我們前期研究發現非小細胞肺癌組織中有CaSR蛋白的表達，其表達強度隨腫瘤分化程度、TNM分期、腫瘤大小及淋巴結轉移情況有關，提示非小細胞肺癌中CaSR的表達可能與腫瘤細胞的增殖及侵襲、轉移密切相關[3]。但其具體機制如何，目前未見報道。

Figure 5.The protein levels of p-AKT in the A549 and A549/DDP cells determined by Western blot. H: hypoxia; LY: LY294002. Mean±SD. n=3. △P<0.05 vs control group; *P<0.05 vs H group; # P<0.05 vs H+GdCl3 group.

缺氧是實質性腫瘤物理微環境的基本特征之一，研究證實缺氧能夠活化多種細胞上的CaSR[12-13]。實驗中我們觀察到缺氧能夠上調A549及A549/DDP細胞鈣敏感受體蛋白的表達，GdCl3能夠加強缺氧的作用，而NPS2390能減弱缺氧的作用，說明缺氧能夠活化A549及A549/DDP細胞的CaSR。

研究證實,CaSR基因敲除可導致體外細胞增殖和體內骨轉移的進程減慢[14]。我們對增殖指標評估的結果顯示：缺氧促進PCNA蛋白的表達，增加BrdU摻入量，能夠使S期細胞數量增多，細胞增殖指數增加。上述這些作用能夠被CaSR激動劑GdCl3所增強，提示缺氧活化的CaSR可能參與了A549及A549/DDP細胞的增殖活動。

PI3K/AKT通路是細胞增殖的經典信號途徑之一，為進一步探索其在缺氧活化CaSR促進A549細胞增殖的作用，我們使用了PI3K信號通路的抑制劑LY294002進行實驗。結果顯示LY294002能夠減弱GdCl3所引起的細胞增殖作用，表現為BrdU摻入量，S期細胞數量均減少，細胞增殖指數降低；蛋白檢測結果顯示：缺氧能夠增加p-AKT蛋白水平，GdCl3能增強缺氧的作用，被LY294002所減弱。這些結果均提示PI3K/AKT信號通路在缺氧活化CaSR促進A549及A549/DDP細胞增殖中起重要作用。

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(責任編輯： 盧 萍， 羅 森)

Calcium-sensing receptor mediates hypoxia-induced proliferation of A549 cells through PI3K/AKT pathway

LI Guang-wei1, MIAO Hong-zhi2, LI Bo1, SHEN Yun-hong3, QIU Li-ping3, ZHANG Ya-zhen3, JIN Xiang-lan3, ZHU Kun-jie3

(1DepartmentofPathophysiology,QiqiharMedicalUniversity,2DepartmentofThoracicandCardiovascularDisease,TheFirstHospitalofQiqihar,3DepartmentofFunctionalLaboratory,QiqiharMedicalUniversity,Qiqihar161006,China.E-mail: 1102044987@qq.com)

AIM: To explore the cell signal transduction pathway of calcium-sensing receptor (CaSR) mediating hypoxia-induced proliferation of A549 cells and A549/DDP cells. METHODS: The cell proliferation was tested by BrdU incorporation assay. The cell cycle analysis was carried out by flow cytometry. The protein levels of PCNA and p-AKT were analyzed by Western blot. RESULTS: Hypoxia significantly increased the protein levels of PCNA and p-AKT, the BrdU incorporation and the cell proliferation index. GdCl3(an agonist of CaSR) amplified the effect of hypoxia. LY294002 (a PI3K inhibitor) decreased the up-regulation of PCNA expression, the BrdU incorporation and the increased cell proliferation index induced by hypoxia and GdCl3in the A549 cells and A549/DDP cells. CONCLUSION: CaSR is expressed in A549 cells and 549/DDP cells, and CaSR activation induced by hypoxia promotes the proliferation of A549 cells and A549/DDP cells through PI3K/AKT signaling pathway.

Calcium-sensing receptor; A549 cells; Hypoxia; Cell proliferation; PI3K/AKT signaling pathway

1000- 4718(2017)03- 0505- 05

2016- 10- 09

2016- 12- 05

齊齊哈爾醫學院博士基金資助項目(No. QY2016B-16)

△通訊作者 Tel： 0452-2663161; E-mail: 1102044987@qq.com

R363；R730.23

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.03.020