血管緊張素(1-7)通過抑制JAK/STAT信號通路對抗高糖誘導的人臍靜脈內皮細胞損傷*

陳健芳， 陳景福， 陳 巍， 徐崢嶸， 李潮生， 王振花， 張 耀， 陳 軍△

(1廣東醫科大學， 廣東 湛江 524023； 2寶安人民醫院心血管內科， 廣東 深圳 518101; 3東莞市第三人民醫院心血管內科， 東莞市心血管研究所， 廣東 東莞 523326)

血管緊張素(1-7)通過抑制JAK/STAT信號通路對抗高糖誘導的人臍靜脈內皮細胞損傷*

陳健芳1,2， 陳景福3， 陳 巍2， 徐崢嶸2， 李潮生2， 王振花2， 張 耀1,2， 陳 軍2△

(1廣東醫科大學， 廣東 湛江 524023；2寶安人民醫院心血管內科， 廣東 深圳 518101;3東莞市第三人民醫院心血管內科， 東莞市心血管研究所， 廣東 東莞 523326)

目的： 研究血管緊張素(1-7)[Ang-(1-7)]能否通過抑制JAK/STAT信號通路對抗高糖誘導的人臍靜脈內皮細胞(HUVECs)損傷。方法: CCK-8 檢測細胞存活率；Western blot 法檢測內皮細胞 JAK2、STAT3、p-JAK2、p-STAT3、cleaved caspase-3和內皮型一氧化氮合酶(eNOS)的蛋白水平；Hoechst 33258染色熒光顯微鏡照相法檢測內皮細胞凋亡數量；DCFH-DA 染色熒光顯微鏡照相法檢測內皮細胞內活性氧簇(ROS)的水平。結果: 應用高糖(40 mmol/L)處理 HUVECs 12～48 h能明顯上調 JAK2 的磷酸化水平，于24 h達最高峰；在24～48 h能明顯上調STAT3 的磷酸化水平，于36 h最高；在12～24 h能明顯上調cleaved caspase-3的表達，在3～48 h隨著時間延長,eNOS的表達逐漸降低。2 μmol/L的Ang-(1-7)或20 μmol/L的JAK/STAT通路抑制劑AG490預處理0.5 h 可顯著抑制由高糖引起的內皮細胞損傷，表現為p-STAT3、p-JAK2及cleaved caspase-3蛋白水平降低、細胞存活率及eNOS 表達升高，細胞凋亡數量和胞內ROS生成減少。結論: Ang-(1-7)能通過抑制JAK/STAT通路對抗高糖誘導的人臍靜脈內皮細胞損傷。

血管緊張素(1-7)； JAK/STAT 信號通路； 高糖； 人臍靜脈內皮細胞； AG490

血管緊張素(1-7)[angiotensin (1-7)， Ang-(1-7)]是腎素-血管緊張素系統(renin-angiotensin system，RAS)的一個重要成員，由血管緊張素轉換酶 2(angiotensin-converting enzyme 2，ACE2)降解 Ang-Ⅱ而生成，并具有對抗 Ang-Ⅱ的作用。RAS在心血管疾病及代謝性疾病的發生中起重要的作用。研究顯示，糖尿病早期心肌組織內Ang-Ⅱ水平明顯升高[1]，提示Ang-Ⅱ可能參與糖尿病的心血管損害。與G蛋白偶聯的Mas受體被認為是Ang-(1-7)的受體。Ang-(1-7)通過與Mas受體結合發揮多種作用，如舒張血管平滑肌，降血壓，提高脂肪組織對胰島素的敏感性及抗炎癥等[2-3]。最近有報道指出，糖尿病患者血漿中ACE2表達減少，Ang-(1-7)的水平降低[4]；ACE2過表達的糖尿病小鼠可改善血糖調控[5]；Ang-(1-7)的非肽類似物AVE-099可減輕糖尿病引起的心血管損害[6]。敲除Mas受體基因可使阻斷了Ang-(1-7)作用的小鼠對胰島素的敏感性和葡萄糖耐受性降低;而且，在轉基因的大鼠過表達Ang-(1-7)則能改善脂質和糖代謝[7]。

Janus激酶/信號轉導子及轉錄激活子(Janus kinase/signal transducer and activator of transcription，JAK/STAT)通路是近年發現可參與細胞信號轉導的重要通路之一。研究發現，JAK/STAT通路可參與糖尿病并發癥的發生發展。Marrero等[8]發現，高糖通過激活JAK/STAT通路引起腎小球濾過膜細胞的增殖而導致糖尿病腎病。另外，有研究發現高糖可通過激活JAK/STAT通路上調牛視網膜毛細血管內皮細胞的血管內皮生長因子[9]。但是，JAK/STAT 通路在Ang-(1-7)對抗高糖引起血管內皮細胞損傷中的作用及其機制尚未明確。

為此，本研究建立高糖損傷人臍靜脈血管內皮細胞模型，旨在探討高糖對血管內皮細胞JAK/STAT通路蛋白表達水平的影響、Ang-(1-7)預處理能否抑制高糖對JAK/STAT通路蛋白表達的激活作用及JAK/STAT通路抑制劑AG490能否抑制高糖引起的血管內皮細胞損傷。

材 料 和 方 法

1 材料

Ang-(1-7)、AG490、Hoechst 33258和DCFH-DA購自Sigma；CCK-8試劑盒購自Dojindo；DMEM(低糖)培養基購自HyClone；胎牛血清(fetalbovine serum，FBS)購自Gibco；抗p-JAK2、p-STAT3、caspase-3和eNOS抗體購自CST；抗JAK2、STAT3和GAPDH抗體購自Proteintech；HUVECs購自廣州吉妮歐公司。

2 方法

2.1 HUVECs的體外培養 細胞培養在含10% FBS的低糖DMEM培養基中，置于5% CO2、37 ℃的溫箱中培養。待細胞融合達80%后，用0.25%胰蛋白酶-EDTA消化，適度消化后加完全培養基終止胰蛋白酶的消化作用。用滅菌槍頭將瓶壁細胞吹落形成細胞懸液。1 200 r/min離心5 min，棄上清，按1∶3傳代。實驗前換用無血清的DMEM培養液培養12 h，然后進行分組實驗。

2.2 實驗分組 實驗分為 6組：正常對照(control)組；高糖(high glucose，HG)損傷組：應用40 mmol/L葡萄糖處理HUVECs 24 h；Ang-(1-7)+HG 組：2 μmol/L Ang-(1-7) 預處理HUVECs 30 min，撤去，用 PBS洗2次，接著用40 mmol/L葡萄糖作用24 h；AG490+HG 組：20 μmol/L AG490預處理HUVECs 30 min，撤去，用 PBS 洗2次，接著用40 mmol/L葡萄糖作用24 h；Ang-(1-7) 組：2 μmol/L Ang-(1-7) 作用于 HUVECs 30 min，撤去，用PBS洗2次，接著用DMEM培養基作用24 h；AG490 組：20 μmol/L AG490作用于HUVECs 30 min，撤去，用PBS洗2次，接著用DMEM培養基作用24 h。

2.3 CCK-8實驗測定細胞存活率 將HUVECs接種于96孔培養板中，細胞在培養孔內生長至大約 80% 時，按照實驗要求給予不同處理，于每孔中加入10 μL CCK-8 溶液，37 ℃孵育24 h，使用酶標儀檢測各孔吸光度(A)值，波長設定為450 nm。按公式:細胞存活率(%)=處理組A/對照組A×100%，求出處理組細胞存活率，實驗重復5次。

2.4 Western blot法檢測JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3、cleaved caspase-3和eNOS的蛋白水平 將HUVECs 接種于 60 mm 培養皿中，貼壁生長至80%時給予不同處理因素，棄培養液，用預冷的PBS洗2次，各皿加入80 μL裂解液后置4 ℃裂解30 min，12 000 r/min離心15 min，取上清，蛋白濃度采用BCA法進行測定。總蛋白經SDS-PAGE分離后，轉移到PVDF膜上。用5%脫脂奶粉封閉90 min，分別加入I抗[p-JAK2 和JAK2(1∶2 000);p-STAT3和STAT3 (1∶5 000);cleaved caspase-3和eNOS (1∶1 000)]，4 ℃過夜，然后用 TBST 洗3次(每次10 min)，加入II 抗(1∶10 000)，室溫孵育60 min，然后再用TBST洗3次(每次10 min)。ECL發光液將PVDF膜顯色，暗室曝光，凝膠成像系統掃描分析結果。

2.5 Hoechst 33258核染色檢測內皮細胞凋亡 將HUVECs接種于6孔培養板中，當細胞貼壁生長至 80% 時，給予各實驗組不同的處理因素后，棄培養液，PBS沖洗3次，然后用4%的多聚甲醛于4 ℃環境中固定10 min，棄去多聚甲醛，PBS沖洗3次，將HUVECs與5 mg/L Hoechst 33258于37 ℃孵育30 min，再用PBS沖洗3次。在熒光顯微鏡下隨機地選取 5 個不重復區攝片，采用ImageJ 1.41軟件分析各視野平均綠色熒光強度，進而對每組的各個樣本進行統計分析。

2.6 細胞內活性氧簇 (reactive oxygen species，ROS)含量的檢測 將HUVECs接種于6孔培養板中，當細胞貼壁生長至80%時，給予各實驗組不同的處理因素后，棄培養液，PBS沖洗3次，將HUVECs與10 μmol/L DCFH-DA于37 ℃孵育30 min，再用PBS沖洗3次。在熒光顯微鏡下隨機地選取5個不重復區攝片，采用 ImageJ 1.41 軟件分析各視野平均綠色熒光強度，進而對每組的各個樣本進行統計分析。

3 統計學處理

用SPSS 20.0 統計學軟件進行統計分析。實驗數據以均數±標準差(mean±SD)表示，組間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，采用SNK-q檢驗進行均數之間的兩兩比較，以P<0.05 為差異有統計學意義。

結 果

1 高糖上調HUVECs的 p-JAK2 和 p-STAT3的蛋白水平

采用不同葡萄糖濃度(20～60 mmol/L)分別處理 HUVECs 24 h 后發現，葡萄糖濃度為40 mmol/L時可顯著上調 JAK2及STAT3的磷酸化水平。與對照組相比，差異有統計學顯著性(P<0.01)。使用高糖(40 mmol/L)處理 HUVECs 12～48 h可顯著上調 JAK2 蛋白的磷酸化水平(P<0.01)，其中在24 h時 p-JAK2 的蛋白水平達到最高; 應用高糖處理HUVECs 24～48 h 可顯著上調 p-STAT3 的蛋白水平(P<0.01)，并且在36 h時STAT3蛋白磷酸化水平最高，見圖 1。

Figure 1. High glucose up-regulated the protein levels of p-JAK2 and p-STAT3 in the HUVECs. Mean±SD. n=5. ** P<0.01 vs 0 mmol/L; ##P<0.01 vs 0 h.

2 JAK/STAT通路介導高糖引起的人臍靜脈內皮細胞的細胞毒性

高糖(40 mmol/L)處理HUVECs 24 h可產生細胞毒性，使細胞存活率降低至(60.5±2.4)%。在高糖處理細胞前，分別應用 0.5、1、2、4、6、8和10 μmol/L Ang-(1-7) 預處理HUVECs 30 min，其中 2、4 和 6 μmol/L Ang-(1-7) 均能顯著抑制 HG 引起的細胞毒性，使細胞存活率明顯升高，但各組之間差異無統計學顯著性；單獨應用10 μmol/L Ang-(1-7) 處理細胞30 min 則對細胞存活率無明顯影響。在高糖處理血管內皮細胞前，應用2 μmol/L Ang-(1-7)或20 μmol/L AG490預處理30 min使高糖對內皮細胞毒性作用顯著減弱，與 HG 處理組比較，差異有統計學顯著性(P<0.01)。2 μmol/L Ang-(1-7)或20 μmol/L AG490本身對內皮細胞存活率無明顯的影響，見圖2。據此，本實驗應用 2 μmol/L Ang-(1-7)作為后續實驗的有效保護濃度。

3 Ang-(1-7)與AG490對高糖致血管內皮細胞凋亡的抑制作用

Hoechst 33258核染色的檢測結果顯示，正常的血管內皮細胞的染色質分布均勻，呈現出彌散均勻的低密度熒光。應用 40 mmol /L 葡萄糖處理血管內皮細胞 24 h 后，呈現典型的凋亡特征(即細胞核呈現濃縮致密的固縮形態或顆粒熒光)的細胞數量增多，與正常對照組比較差異顯著(P<0.01)。然而，2 μmol/L Ang-(1-7)或20 μmol/L AG490 預處理血管內皮細胞 30 min均能顯著地減少凋亡細胞的數量，與 HG 組比較，差異顯著(P<0.01)。2 μmol/L Ang-(1-7)或20 μmol/L AG490本身對細胞凋亡數量無明顯影響，見圖3。

Figure 2. Ang-(1-7) and AG490 antagonized high glucose (HG, 40 mmol/L glucose)-induced cytotoxicity in the HUVECs. CTL: control. Mean±SD. n=5. **P<0.01 vs control group; ##P<0.01 vs HG group．

Figure 3. The inhibitory effect of Ang-(1-7) and AG490 on HG-induced apoptosis of the HUVECs. Mean±SD. n=5. ** P<0.01 vs control group; ##P<0.01 vs HG group．

4 Ang-(1-7)與AG490減輕高糖引起的人臍靜脈內皮細胞的氧化應激

HG作用于HUVECs 24 h可使胞內DCFH的平均熒光強度(mean fluorescence intensity，MFI)明顯增強，與正常對照組相比，2組差異有統計學顯著性(P<0.01)。但經 2 μmol/L Ang-(1-7)或20 μmol/L AG490 預處理 30min 可使胞內 ROS 堆積明顯減少，與高糖組相比，差異有統計學顯著性(P<0.01)。而單獨用2 μmol/L Ang-(1-7)或20 μmol/L AG490預處理則對胞內 ROS 生成無明顯作用，見圖4。

Figure 4. Ang-(1-7) and AG490 reduced HG-induced accumulation of reactive oxygen species (ROS) in the HUVECs. Mean±SD. n=5. **P<0.01 vs control group; ##P<0.01 vs HG group．

5 Ang-(1-7)與AG490明顯減弱高糖介導的HUVECs中cleaved caspase-3表達的升高和eNOS 表達的下調

高糖使人臍靜脈內皮細胞凋亡蛋白cleaved caspase-3的表達升高,eNOS表達水平下降，且具有時間和劑量依籟性，與對照組相比，差異有統計學顯著性(P<0.01)，見圖5。應用高糖處理血管內皮細胞24 h使eNOS蛋白的表達水平下降，與對照組相比，差異有統計學顯著性(P<0.01)。但是，在高糖處理血管內皮細胞前，應用2 μmol/L Ang-(1-7)或20 μmol/L AG490預處理30 min使高糖對eNOS蛋白的表達下調作用顯著減弱，與 HG 處理組比較，差異有統計學顯著性(P<0.01)。2 μmol/L Ang-(1-7)或20 μmol/L AG490本身對內皮細胞eNOS蛋白表達水平無明顯的影響。另一方面，應用高糖處理血管內皮細胞24 h使cleaved caspase-3蛋白的表達水平升高，與對照組相比，差異有統計學顯著性(P<0.01)。但是，在高糖處理血管內皮細胞前，應用2 μmol/L Ang-(1-7)或20 μmol/L AG490預處理30 min使高糖對cleaved caspase-3蛋白表達的升高作用顯著減弱，與 HG 處理組比較，差異有統計學顯著性(P<0.01)。2 μmol/L Ang-(1-7)或20 μmol/L AG490本身對內皮細胞cleaved caspase-3蛋白表達水平無明顯的影響，見圖6。

6 Ang-(1-7)減弱高糖介導的HUVECs磷酸化JAK/STAT 水平的升高

應用高糖處理血管內皮細胞24 h，JAK/STAT 通路蛋白的磷酸化水平升高，與對照組相比，差異有統計學顯著性(P<0. 01)。但是，在高糖處理血管內皮細胞前，應用2 μmol/L Ang-(1-7)預處理30 min使高糖對JAK/STAT 通路蛋白的磷酸化的上調作用顯著減弱，與 HG 處理組比較，差異有統計學顯著性(P<0.01)。2 μmol/L Ang-(1-7)本身對內皮細胞JAK/STAT 通路蛋白的磷酸化水平無明顯的影響，見圖7。

Figure 5. High glucose up-regulated the protein levels of cleaved caspase-3 and induced decline in eNOS expression in the HUVECs. Mean±SD. n=5. **P<0.01 vs 0 mmol/L; ##P<0.01 vs 0 h group．

Figure 6. Ang-(1-7) and AG490 reversed the inhibitory effect of HG on eNOS protein expression and attenuated HG-induced expression of cleaved caspase-3 in the HUVECs. CTL: control. Mean±SD. n=5. ** P<0.01 vs CTL group; ##P<0.01 vs HG group．

Figure 7. Ang-(1-7) at 2 μmol/L attenuated HG-induced JAK/STAT protein phosphorylation. Mean±SD. n=5. CTL: control. **P<0.01 vs CTL group; ##P<0.01 vs HG group.

討 論

JAK/STAT信號通路是近年來發現的一條由細胞因子刺激的信號轉導通路，JAK 是一類胞質內非受體型可溶性酪氨酸蛋白激酶，STAT 是一類能與靶基因調控區 DNA 結合的胞質蛋白，是 JAK 的下游底物。JAK 家族酪氨酸磷酸化后募集胞質中的 STATs，使其磷酸化后形成二聚體進入細胞核內，在核內它們與目的基因啟動子結合，進而激活基因表達，參與細胞的增殖、分化、凋亡及免疫調節等許多重要的生物學過程。最近有研究發現JAK/STAT 通路參與高糖誘導的人臍靜脈內皮細胞損傷過程[10]。Manea 等[11]研究發現，阻斷 JAK/STAT 通路可抑制高糖引起的人臍靜脈內皮細胞株 EAhy926內皮素-1(endothelin-1，ET-1)的升高，而后者在維持血管內皮細胞穩態中發揮著重要作用；Tawfik 等[12]發現JAK2 在氧化應激介導的主動脈內皮細胞凋亡中發揮了重要作用。由此可見，JAK/STAT 通路與血管病變及內皮細胞功能密切相關。

我們研究發現，高糖處理血管內皮細胞使p-JAK2及p-STAT3表達增加、凋亡蛋白cleaved caspase-3表達增加及使eNOS表達降低，細胞存活率下降、細胞凋亡增多及ROS 生成增加。采用JAK2/STAT通路抑制劑AG490預處理內皮細胞可以對抗高糖誘導的內皮細胞損傷作用，表現在增加細胞存活率，減少細胞凋亡和cleaved caspase-3表達水平，減少內皮細胞內ROS生成水平及增加eNOS表達水平。提示了JAK2/STAT 通路參與了高糖誘導內皮細胞損傷作用。

根據以往的研究報道，我們推測Ang-(1-7)可能通過 JAK/STAT 通路對抗高糖誘導的血管內皮細胞的多種損傷，而在本研究中我們也證實了這一點。本研究在高糖損傷人臍靜脈內皮細胞模型證實，Ang-(1-7)預處理內皮細胞可以對抗高糖誘導的內皮細胞損傷作用，使血管內皮細胞存活率上升，減少細胞凋亡和cleaved caspase-3表達水平，減少內皮細胞內ROS生成水平及增加eNOS表達水平。提示了Ang-(1-7)能保護血管內皮細胞對抗高糖引起的損傷。在上述實驗基礎上，本研究進一步探討Ang-(1-7)能否通過JAK/STAT信號通路保護血管內皮細胞對抗高糖引起的上述的損傷。研究發現，Ang-(1-7)預處理HUVECs 30 min能明顯地減弱高糖對血管內皮細胞JAK/STAT信號通路蛋白p-JAK2及p-STAT3的水平。提示JAK/STAT信號通路可能是Ang-(1-7)保護血管內皮細胞對抗高糖損傷的重要機制之一。

綜上所述，本研究證實，高糖可通過激活JAK/STAT信號通路損傷血管內皮細胞， Ang-(1-7)可通過調控JAK/STAT信號通路對抗高糖引起的血管內皮細胞損傷。本文為防治糖尿病心血管病提供了新思路。

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(責任編輯： 盧 萍， 羅 森)

Angiotensin (1-7) protects human umbilical vein endothelial cells against high glucose-induced injury by inhibiting JAK/STAT signaling pathway

CHEN Jian-fang1,2, CHEN Jing-fu3, CHEN Wei2, XU Zheng-rong2, LI Chao-sheng2, WANG Zhen-hua2, ZHANG Yao1,2, CHEN Jun2

(1GuangdongMedicalUniversity,Zhanjiang524023,China;2DepartmentofCardiology,People’sHospitalofBaoan,Shenzhen518101,China;3DepartmentofCardiology,TheThirdHospitalofDongguanCity,CardiovascularInstituteofDongguanCity,Dongguan523326,China.E-mail:szcjun@126.com)

AIM: To investigate whether angiotensin (1-7) [Ang-(1-7)] protects human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) against high glucose-induced injury by inhibiting JAK/STAT signaling pathway. METHODS: The cell viability was examined by CCK-8 assay. The expression levels of JAK2, STAT3, p-JAK2, p-STAT3, cleaved caspase-3 and endothelial nitric oxide synthase (eNOS) were detected by Western blot. The number of apoptotic cells was observed by photofluorography with Hoechst 33258 nuclear staining. The intracellular levels of reactive oxygen species (ROS) were tested by DCFH-DA staining followed by photofluorography. RESULTS: Expose of the HUVECs to high glucose (40 mmol/L) for different time significantly increased phosphorylation level of JAK2 which reached the peak at 24 h. The protein level of p-STAT3 significantly increased at 24～48 h and reached the peak at 36 h. The expression of cleaved caspasep-3 was significantly up-regulated at 12～24 h, and the expression of eNOS gradually decreased at 3～48 h with prolongation of time. Pretreatment of the HUVECs with Ang-(1-7) at 2 μmol/L or AG490 (an inhibitor of JAK/STAT pathway) at 20 μmol/L for 0.5 h before exposure of the cells to high glucose for 24 h markedly attenuated high glucose-induced injury of the HUVECs, by increasing the cell viability and eNOS expression, and decreasing the apoptotic cells, ROS production and cleaved caspase-3 expression. Furthermore, pretreatment with Ang-(1-7) for 0.5 h also decreased the protein levels of p-JAK2 and p-STAT3. CONCLUSION: Ang-(1-7) protects the HUVECs against high glucose-induced injury by inhibiting JAK/STAT signaling pathway.

Angiotensin (1-7); JAK/STAT signaling pathway; High glucose; Human umbilical vein endothelial cells; AG490

1000- 4718(2017)03- 0481- 08

2016- 10- 12

2016- 11- 08

廣東省深圳市寶安區社會公益項目(No. 2015009)

△通訊作者 Tel: 0755-27788311； E-mail: szcjun@126.com

R363

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.03.016