三氯乙酸法脫除黃精多糖中蛋白的工藝優化

施伽+楊浩+楊思文+李麗

摘 要：該文采用正交設計試驗優化黃精多糖脫除蛋白的最佳條件。在單因素實驗的基礎上，以蛋白脫除時間、三氯乙酸濃度、蛋白脫除溫度、蛋白質濃度為自變量，以黃精多糖中蛋白脫除率為考察指標，通過L9（34）正交試驗得出黃精多糖蛋白脫除率的最佳工藝條件為：蛋白脫除時間40min、三氯乙酸濃度6%、蛋白脫除溫度80℃、蛋白質濃度0.11mg/mL，在該條件下黃精多糖蛋白的脫除率為93.51%。

關鍵詞：黃精多糖；三氯乙酸法；蛋白脫除

中圖分類號 TS252.5 文獻標識碼 A 文章編號 1007-7731（2017）06-0029-03

Deproteinization of Polygonatum Polysaccharide by Trichloroacetic Acid

Shi Jia et al.

（Tongren University，Tongren554300，China）

Abstract：Optimization of the optimum conditions for deproteinization of polygonatum polysaccharide by orthogonal design.Orthogonal design was employed to evaluate the significance of four crucial variables including reaction time，concentration of trichloroacetic acid，deproteinization temperature，protein concentration，and to determine the effect of prime factors on the rate of deproteinization.The optimum conditions were reaction time 40min，concentration of trichloroacetic acid 6%，deproteinization temperature 80℃，and protein concentration 0.11mg/mL.Under these conditions，the rate of deproteinization was 93.51%.

Key words：Polygonatum polysaccharide；Trichloroacetic acid；Deproteinization

黃精又名老虎姜、雞頭參、玉竹[1]，為百合科黃精屬多年生草本植物，在我國主要產于云南、貴州、四川、廣西等地，已有2 000多年的藥用歷史[2-4]。黃精多糖是黃精重要的活性成分之一，含量達到17.79%，具有降血糖、降血壓、調脂等生理功能[5]。傳統方法提取的黃精多糖，殘留有一定的蛋白，分離蛋白的方法主要有：乙醇醇沉法、大孔樹脂吸附法、三氯乙酸法、Sevag法及酶法脫蛋白等[6]，其中三氯乙酸法脫蛋白效果好，但容易引起多糖損失[7-8]。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 新鮮黃精，二年生，采于銅仁市印江縣梵凈山下，在55℃烘箱烘中干燥至恒重后，用鋼磨打粉機粉碎為粉末后備用。無水乙醇，三氯乙酸，磷酸，乙醚（均為分析純）。牛血清蛋白（購于源葉生物），考馬斯亮蘭（購于Solarbio）。

1.2 儀器與設備 分光光度計，旋轉蒸發儀，高速離心機，鋼磨打粉機，索式提取器。

1.3 方法

1.3.1 黃精多糖的提取 改進徐渭沉[9-11]等多糖提流程：準確稱量10g黃精粉末用乙醚回流2h脫脂后取渣，于50℃干燥黃精渣，用于多糖的提取，熱水提取多糖條件：溫度80℃，固液比1∶15，提取時間4h，提取次數1次，提取結束后。用高速離心機8 000r/min離心10min后取其上清液，在80℃濃縮至20mL，加入5倍95%的乙醇，醇沉過夜，通過離心機離心取其沉淀，制得黃精多糖溶液備用。

1.3.2 黃精多糖的蛋白質測定

1.3.2.1 標準曲線的制備 采用考馬斯亮藍法[12-13]。（1）考馬斯亮蘭G-250染料試劑（0.1mg/mL）：稱0.01g考馬斯亮蘭G-250，溶于5mL、95%的乙醇，再在乙醇溶液中加入10mL、85%的磷酸，用蒸餾水溶解定容于100mL棕色容量瓶后過濾備用。（2）標準蛋白質溶液（0.1mg/mL）：稱0.01g牛血清蛋白，加水稀釋至100mL。精確吸取上述標準品溶液0.0、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9mL于10mL試管中，加入5mL考馬斯亮蘭G-250染料試劑然后定溶至6mL靜至3min備用。（3）標準曲線的制作：分別在595nm處測出吸光度[14-15]，以吸光度值為縱坐標（Y），以牛血清蛋白質量（mg）為橫坐標（X），生成標準曲線，得到的標準曲線回歸方程為y=6.4962x+0.0028，相關系數為0.9959，標準曲線的擬合度良好，表明測定吸光度與牛血清蛋白濃度呈良好的線性關系，如圖1所示。

1.3.2.2 黃精多糖中的蛋白質的測定 取1mL多糖溶液于試管中，加入5mL考馬斯亮蘭G-250染料試劑，靜置3min后，用分光光度計在595nm處測定其吸光度值。將吸光度值帶入回歸方程y=6.492x+0.0028中計算出多糖溶液中蛋白質質量，并計算蛋白脫除率。

1.3.3 黃精多糖脫除蛋白條件單因素試驗

1.3.3.1 蛋白脫除時間選擇試驗 準確量取蛋白質濃度為0.06mg/mL的多糖溶液10mL，脫蛋白溫度為70℃，加入濃度為6%三氯乙酸3mL，考察脫蛋白時間為10min、20min、30min、40min、50min條件下多糖蛋白脫除率。

1.3.3.2 三氯乙酸濃度選擇試驗 蛋白脫除溫度為70℃，脫蛋白時間為30min，加入三氯乙酸3mL，考察三氯乙酸濃度分別為2%、4%、6%、8%、10%條件下多糖的蛋白脫除率。

1.3.3.3 蛋白質濃度選擇試驗 準確量取不同濃度的蛋白質多糖溶液10mL，溫度為70℃，時間為30min，加入濃度為6%三氯乙酸3mL，考察蛋白質濃度分別為0.05mg/mL、0.06mg/mL、0.07mg/mL、0.08mg/mL、0.09mg/mL條件下多糖蛋白脫除率。

1.3.3.4 脫除蛋白溫度選擇試驗 準確量取蛋白質濃度為0.06mg/mL的多糖溶液10mL，脫蛋白時間為30min，加入濃度為6%三氯乙酸3mL，考察脫蛋白溫度為50℃、60℃、70℃、80℃、90℃條件下多糖蛋白脫除率。

1.3.3.5 正交試驗法優化黃精多糖脫蛋白條件 在單因素試驗的基礎上，以脫蛋白時間、脫蛋白溫度、蛋白質濃度、三氯乙酸濃度作為研究的4因素，每因素取3個水平，以黃精多糖脫蛋白作為考察指標，進行L9（34）正交試驗設計，見表1。

2 結果與分析

2.1 脫蛋白時間對蛋白脫除率的影響 由圖2得出，隨著脫蛋白時間的增加，蛋白質脫除率呈先升高后降低的趨勢，當脫蛋白時間在10～40min范圍時隨著時間的的延長蛋白質脫除率逐漸增加，在40min時，蛋白質脫除率有了顯著的提高（P<0.05），達到最大值82.49%。之后隨著時間的增長，蛋白脫除率逐漸降低，所以蛋白脫除時間不宜過長。因此，在后續實驗中采用30、40、50min進行正交實驗。

2.2 三氯乙酸濃度對蛋白脫除率的影響 由圖3得出，隨著三氯乙酸濃度的增加，蛋白脫除率逐漸增大，在6%時，有顯著提升（P<0.05），隨著三氯乙酸濃度繼續升高，蛋白脫除率不再有顯著的變化。因此，在后續實驗中采用4%、6%、8%進行正交實驗。

2.3 蛋白質濃度對蛋白脫除率的影響 由圖4可得出，隨著蛋白質濃度的增加，蛋白質脫除率呈先上升后下降的趨勢，當蛋白質濃度上升至0.07mg/mL時，脫除率有了顯著的提高，但隨著蛋白質濃度的增加，脫除率逐漸降低，脫除率顯著下降（p<0.05）。因此，在后續實驗中采用0.06、0.07、0.08mg/mL進行正交實驗。

2.4 溫度對蛋白脫除率的影響 由圖5可得出，隨著溫度的增加，蛋白質脫除率呈先升后降的趨勢，當脫蛋白溫度為70℃時，蛋白質脫除率達到最大值為80.95%，當溫度高于70℃后蛋白質脫除率逐漸降低。因此，在后續實驗中采用60、70、80℃進行正交實驗。

2.5 最佳工藝條件的確定 由表2正交試驗結果的直觀分析可以看出，蛋白脫除條件為A2B2C3D3時，即脫蛋白時間為40min、三氯乙酸濃度為6%、脫蛋白溫度為80℃、蛋白質濃度為0.11mg/mL，黃精多糖蛋白的蛋白質脫除率效果最佳。且由極差分析可知，各因素對黃精多糖蛋白的蛋白質脫除率效果影響的主次順序為：D>C>B>A，即蛋白質濃度>脫蛋白溫度>三氯乙酸濃度>脫蛋白時間。其中由方差分析結果可知，脫蛋白時間這一因素對多糖提取率有顯著的影響（p<0.05）。正交試驗使黃精多糖中蛋白質的脫除工藝得到了優化，最優組合為A2B2C3D3。由于最優組在正交實驗中沒有出現，所以進行驗證試驗。根據正交實驗分析所得出的提取條件，進行了3次重復試驗，平均蛋白脫除率為 93.51%，高于單因素實驗的提取得率，表明此優化工藝可行。

3 結論

通過單因素及L9（34）正交實驗，確定了三氯乙酸法脫除黃精多糖中蛋白質的最佳條件為三氯乙酸濃度6%，脫除時間40min，脫除溫度80℃，蛋白質濃度0.08mg/mL，此條件下黃精多糖中蛋白的脫除率達93.51%，是一種效率高、試劑用量少的脫除黃精多糖蛋白質的有效方法。

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