轉基因作物對土壤微生物多樣性影響的研究方法

梁晉剛 張秀杰

（農業部科技發展中心，北京 100122）

轉基因作物對土壤微生物多樣性影響的研究方法

梁晉剛 張秀杰

（農業部科技發展中心，北京 100122）

土壤微生物是土壤生態系統的一個重要組成部分，對土壤中的生物化學循環起著不可替代的驅動作用。轉基因作物在生長過程中會不可避免地與土壤微生物發生交流，開展轉基因作物對土壤微生物群落影響的研究對于科學評價轉基因作物的潛在風險具有重要意義。隨著現代生物技術的不斷發展，土壤微生物多樣性及其分析方法已經從傳統的分離培養發展到從種群角度去研究整個土壤微生態系統內的微生物。但是由于土壤微生物的各種特性（如大部分不可培養、體積微小及群體效應等）和儀器設備檢測性能的局限性，單一的研究方法會存在一些弊端，還需要結合其他的手段共同研究土壤生態系統中的微生物多樣性。目前，人們對土壤微生物多樣性的研究主要包括物種多樣性、功能多樣性、結構多樣性及遺傳多樣性等4個方面，國內外關于轉基因作物對土壤微生物多樣性及其群落結構影響的研究方法很多，對常見的研究方法進行了總結，并提出了今后轉基因作物對土壤微生物多樣性及群落結構影響的研究策略。

轉基因作物；土壤微生物；多樣性；研究策略

土壤微生物多樣性是指土壤生態系統中所包含的微生物的種類、這些微生物所攜帶的基因及其與環境之間相互關聯的多樣化程度等。目前，對土壤微生物多樣性影響的研究方法大致可歸為3類，即基于傳統的培養分離法、基于生物化學成分分析法和基于現代分子水平的分析法［3］。在本文中，分析了幾種常用于轉基因作物對土壤微生物多樣性影響的研究方法，可望通過綜合使用多種方法以得到更加真實準確的研究數據。

1 微生物培養計數法

土壤微生物的物種多樣性是指土壤中微生物的物種豐富度以及均一度等指標的多樣性，目前主要通過傳統的分離培養法來研究土壤中可培養微生物的物種多樣性。微生物平板培養法是一種傳統的方法，它根據靶標微生物特性，采用相應的特定培養基對土壤中的微生物進行培養分離［4］。但由于培養技術和方法的局限性，使得能夠被培養的土壤微生物物種的數量只占實際微生物總數的0.1%-1%，因此不能提供反映微生物群落結構與物種多樣性的絕大部分信息［5-6］。但這種傳統培養方法所發揮的作用不容忽視。

由于方法簡單方便，至今仍然是一種不可替代的研究手段。Zeng等［7］通過平板培養試驗研究發現，轉BcWRKY1基因耐鹽玉米對土壤細菌、真菌和放線菌數量均沒有顯著性影響。Wu等［8］通過平板培養試驗，結果也表明添加轉CryIAb基因水稻品系稻桿的土壤中可培養細菌、放線菌和真菌的數量，與添加非轉基因水稻品系稻桿的土壤中的相比，沒有顯著差異；而氨氧化細菌、固氮細菌和纖維素降解細菌的種群數量在試驗中期出現暫時的顯著性差異。周琳等［9］對轉chi+rip雙價抗真菌基因大豆G0431及其親本非轉基因大豆黑農35種植后的根部土壤可培養微生物進行平板培養計數，發現二者根部土壤中的可培養細菌、真菌和放線菌的數量并無顯著差異。Zhang等［10］采用平板培養計數方法研究發現，與受體品種相比，轉CrylAc和CpTI基因棉花SGK321對根際細菌、真菌和放線菌群落數量沒有顯著性影響。燕麗萍等［11］采用平板培養計數法，以轉BADH基因苜蓿和非轉基因苜蓿為材料，連續2年測定這兩種苜蓿根際可培養細菌、放線菌和真菌數量的變化，結果表明，不同年份和不同月份轉基因苜蓿與非轉基因苜蓿根際土壤3大類可培養微生物數量變化的趨勢一致。

由于微生物群落及其生存環境的復雜多變，在進行新培養技術的研發和實際應用的同時，還應結合現代生物技術方法，才能更客觀、全面地反映出微生物群落結構與物種多樣性的真實信息。

2 生物標記物法——磷脂脂肪酸圖譜分析

土壤微生物的結構多樣性是指土壤生態系統中微生物的細胞結構組分等方面的多樣化程度，這是導致微生物代謝方式和生理功能多樣化等的直接原因。目前一般采用生物標記法來研究土壤微生物群落結構的組成。生物標記物通常是細胞外分泌產物或微生物細胞的生化組成成分，它的總量一般與對應的生物量呈正相關。因此，對特異的生物標記物種類及豐度進行檢測可間接反映出樣本中的微生物種類、豐度及群落結構，最主要的生物標記物分析法是磷脂脂肪酸法［3，12］。磷脂脂肪酸（Phospholipid fatty acid，PLFA）是細胞膜的重要組成成分之一，不同類群的微生物可形成特定的PLFA。該方法通過直接提取根際微生物的脂肪酸，能夠直觀地反映出根際微生物群落的組成［13］。

Nam等［14］采用PFLA方法，研究了高水平表達細胞分裂素的轉基因楊樹品系T1403、T1410和T1413對土壤微生物的影響發現，轉基因楊樹與受體楊樹相比，對根際微生物存在暫時的影響。桂恒等［15］利用PLFA方法分析了富含硫氨基酸轉基因大豆對土壤微生物群落結構的影響，結果表明，與非轉基因大豆相比，轉基因大豆品系根際微生物群落的結構發生了明顯的變化。李永山等［16］利用PLFA方法研究了轉Bt基因棉花對土壤微生物群落結構變化的影響發現，與受體棉花相比，轉基因棉花的種植增加了土壤微生物PLFA的含量。

PLFA分析法主要表現在不需要對土壤微生物進行分離培養，避免了人為分離培養過程中的誤差，同時也可涵蓋土壤中大部分不能被培養的微生物。但是，PLFA分析法不能將土壤中存在的某些脂肪酸與特定微生物對應起來，不能從物種的水平上對微生物進行描述，不同種類微生物的特征脂肪酸也可能發生重疊［17］。因此，在采用PLFA方法對土壤微生物群落多樣性分析時，還需結合其他研究方法，才能得到更客觀真實的結果。

3 Biolog ECO微平板法

土壤微生物群落功能多樣性是指土壤微生物能夠執行的功能范圍及過程，包括氧化還原、分解轉化、營養傳遞等功能，是描述土壤微生物群落特征的一個重要指標。對土壤生態系統中微生物功能多樣性的研究最為常用的方法是Biolog微平板分析法。Biolog ECO微平板是特別為群落分析和微生態研究設計的，包含用于土壤群落分析最常用的31種碳源，通過測定并分析不同微生物群落對Biolog ECO微平板中各種單一碳源底物的利用能力的差異，從而獲得微生物群落功能多樣性方面的信息［1］。將Biolog ECO微平板應用于轉基因作物對根際微生物群落功能影響的分析，為評價轉基因作物對土壤微生物的影響提供了新的思路。

陳豐等［18］利用Biolog ECO系統分析了富含硫氨基酸轉基因大豆對土壤微生物群落功能多樣性的影響，結果顯示，轉基因大豆根際微生物群落功能多樣性與受體大豆的相比，二者之間沒有顯著性差異。Liang等［19］通過Biolog ECO微孔板分析了轉基因高蛋氨酸大豆對根際微生物群落碳代謝功能的影響，結果表明，與受體大豆相比，轉基因大豆對根際微生物功能多樣性無顯著性影響。Wei等［20］利用Biolog ECO系統分析了轉Bt基因水稻SHK601對根際微生物群落功能的影響，結果表明，與受體水稻相比，轉基因水稻對根際微生物群落功能有短暫影響。

Biolog ECO微孔板試驗成本較高，檢測的主要是代謝能力較強的微生物，且外部培養環境的改變有可能引起微生物對底物利用的改變［21］。此外，Biolog ECO微孔板所表征的代謝多樣性并不能完全代表原位生態系統中微生物代謝的多樣性［22］。所以，Biolog ECO微孔板在準確性方面仍有一定的局限性，使用Biolog ECO微孔板法時，如能結合其他研究方法，依然可獲得較全面的結果。

4 現代分子生物學方法

土壤微生物的遺傳多樣性是指土壤生態系統中的微生物在基因水平上所攜帶的遺傳物質和遺傳信息的總和。土壤微生物遺傳多樣性的分析方法主要是基于PCR的分析方法。隨著分子生物學技術的發展，直接提取土壤微生物總DNA并進行分子生物學分析，可有效避免傳統微生物培養過程中不可培養微生物的丟失，達到更直接、可靠、全面的了解土壤微生物群落原始組成的目的。這些分子生物學方法主要包括變性梯度凝膠電泳（Denaturing gradient gel electrophoresis，DGGE）、實時熒光定量PCR和16S rRNA基因（16S rDNA）可變區擴增子高通量測序、宏基因組高通量測序及生物信息學分析等方法。

4.1 變性梯度凝膠電泳（DGGE）圖譜技術

DGGE的原理是長度相同但序列不同的DNA片段在含有變性劑并呈梯度分布的聚丙烯酰胺凝膠上，因解鏈行為不同而導致遷移速率不同［23］。該技術已經發展成為研究微生物群落結構的主要分子生物學方法之一。目前，國內外很多學者運用DGGE技術進行了轉基因作物對根際微生物影響的研究。

浦傳亮等［24］采用該技術對轉基因高蛋氨酸大豆根際細菌群落結構進行研究，結果表明，與受體大豆相比，轉基因高蛋氨酸大豆對根際細菌群落多樣性有一定的降低作用，但這一作用隨大豆的生長而逐漸減弱，到成熟期已完全消失。Wu等［25］運用該技術分析了抗小麥黃花葉病毒轉基因小麥對根際細菌、真菌群落結構的影響，結果表明，與受體小麥相比，轉基因抗病小麥對根際細菌、真菌群落結構沒有顯著影響。Wei等［20］利用該技術分析了轉Bt基因水稻SHK601對根際細菌、真菌和放線菌群落結構的影響，結果表明，與受體水稻相比，轉基因水稻對根際微生物群落結構無顯著性影響。Weinert等［26］利用該技術分析產玉米黃質轉基因馬鈴薯根際微生物的變化，發現馬鈴薯不同品種對植物根際細菌和真菌種群的影響要遠大于轉基因因素。Zhang和Xie等［27-28］分別利用該技術分析發現，與受體棉花相比，轉Cry1Ab/Ac基因棉花對根際真菌、放線菌群落結構沒有顯著性影響。

雖然DGGE技術在分析土壤微生物多樣性方面有很多優勢，也已經普遍應用到土壤微生物群落多樣性分析的研究中，但是DGGE技術也存在一些不足之處。例如，只能分離較小的片段，不易鑒定到種的水平，PCR產物的突變和DGGE電泳時出現的共遷移都可能影響結果的準確性，耗時耗力，而且只能檢測土壤中很小一部分微生物等［29］。

4.2 實時熒光定量PCR技術

實時熒光定量 PCR 技術基本原理是在PCR反應體系中加入熒光基團，利用熒光信號實時監測整個PCR進度，并通過標準曲線對待測樣品進行定量分析。目前，該技術已廣泛應用到轉基因作物對土壤微生物影響的研究中。

該方法可以定量檢測土壤中目的菌種的含量以及分布等信息。Liang等［30］利用該技術研究發現，與受體大豆相比，轉基因高蛋氨酸大豆ZD91對根際固氮細菌、氨氧化細菌和反硝化細菌數量無顯著性影響。杜娟等［31］運用該技術分析了轉TaDREB4基因抗旱小麥根際中熒光假單胞菌數量的變化，結果表明各生育期轉基因小麥和非轉基因小麥的根際中熒光假單胞菌的拷貝數之間無顯著差異。Zhang和Xie等［27-28］分別利用該技術分析發現，與受體棉花相比，轉Cry1Ab/Ac基因棉花對根際真菌、放線菌數量沒有顯著性影響。

實時熒光定量PCR具有高靈敏度、高精度、高特異性、實時性等優點，但是，該技術也有一些不足之處，如成本比較高，操作時還要考慮同源和異源DNA的背景、寡核苷酸雜交的特異性、熒光染料或特異性探針的濃度，以及PCR產物的大小等因素，這些因素都會引起結果的偏差。

4.3 高通量測序及生物信息學方法

高通量測序技術能夠對數以百萬計的DNA分子進行同時測序，不需要對各單一種類的微生物個體進行分離和培養，已廣泛應用于土壤微生物遺傳多樣性的研究領域中［32］。

4.3.1 土壤樣品中微生物可變區擴增子高通量測序 首先提取樣品中微生物總DNA，然后運用PCR技術擴增細菌基因組中的16S rDNA、真菌基因組中的18S rDNA或ITS區域，獲得絕大部分微生物16S rDNA、18S rDNA或ITS高可變區的擴增產物，并構建擴增產物的文庫，利用第二代測序平臺進行大規模高通量測序，然后比較分析測序數據，該方法最近幾年已廣泛應用于轉基因作物對土壤微生物群落多樣性影響的研究。

4.3.2 土壤樣品中微生物宏基因組測序 土壤的宏基因組測序也稱全基因組測序，首先提取土壤中的微生物群體基因組DNA，然后把這些微生物的基因組DNA用鳥槍法建庫，檢測合格后，利用高通量測序平臺，原始數據經過數據處理分析，研究土壤中微生物的群體的多樣性等指標，相比16S rDNA可變區擴增子高通量測序，該測序方法能夠更全面的分析微生物的物種及基因等方面的多樣性。

Liang等［30，33］通過 Pyrosequencing測序和克隆文庫構建的方法，研究了轉基因高蛋氨酸大豆ZD91對根際細菌和叢枝菌根真菌群落結構的影響，結果表明轉基因大豆ZD91對根際細菌和叢枝菌根真菌群落結構沒有顯著性影響，且發現大豆生長時期和年份是主要的影響因素。Lu等［34］利用Illumina Miseq測序平臺研究了轉基因耐草甘膦大豆NZL06-698對根際細菌群落結構的影響，結果發現轉基因大豆NZL06-698對細菌alpha多樣性指數沒有顯著性影響，然而對beta多樣性指數有影響，且對包括固氮菌在內的部分細菌門和屬有顯著性影響。Lu等［35］利用Metagenome Sequencing分析了轉基因耐草甘膦大豆ZUTS31在鼓粒期對根際微生物群落結構的影響，結果表明，與清水處理對照相比，噴施草甘膦的轉基因大豆ZUTS31對根際細菌alpha和beta多樣性指數沒有顯著性影響，然而氮固定相關基因相對豐度顯著性降低，產生的原因和機制目前還不清楚。

此類方法可準確檢測不同基因型植物的根際微生物群落組成、結構、多樣性及相對豐度差異，是判斷和評價不同基因型植物對土壤微生物影響的重要方法之一，也是評估轉基因作物對土壤微生態風險的重要手段。

5 展望

轉基因作物被引入到農田后對包含土壤微生物在內的土壤生態系統的潛在風險已受到人們的廣泛關注。目前，隨著DNA高通量測序技術飛速發展，測序成本明顯下降，16S rDNA測序等高通量方法為研究微生物群落結構與功能等提供了一種新的選擇，同時為研究轉基因作物種植對土壤微生物多樣性的影響提供了一種重要的評價手段。另外，由于土壤微生物群落組成復雜，將各種技術方法有機結合起來全面反映根際微生物群落結構組成與多樣性已成為研究的必然趨勢。

［1］楊永華. 轉基因作物對土壤微生物群落的影響及主要研究策略［J］. 農業生物技術學報, 2011, 19（1）：1-8.

［2］李俊生, 關瀟, 吳剛, 等. 轉基因作物對土壤生態系統影響的研究概況［J］. 湖北植保, 2012（6）：50-53.

［3］金明. 土壤微生物多樣性分析方法的研究進展［J］. 農業技術與裝備, 2016, 316（4）：18-20.

［4］李俊, 沈德龍, 林先貴. 農業微生物研究與產業化進展［M］.北京：科學出版社, 2011.

［5］Kirk J, Beaudette L, Hart M, et al. Methods of studying soil microbial diversity［J］. J Microbiol Meth, 2004, 58：169-188.

［6］吳金水. 土壤微生物生物量測定方法及其應用［M］. 北京：氣象出版社, 2006.

［7］Zeng X, Zhou Y, Zhu Z, et al. Effect on soil properties of BcWRKY1 transgenic maize with enhanced salinity tolerance［J］. Int J Genomics, 2016, 5：1-13.

［8］Wu X, Ye Q, Min H, et al. Bt-transgenic rice straw affects the culturable microbiota and dehydrogenase and phosphatase activities in a flooded paddy soil［J］. Soil Biol Biochem, 2004, 36（2）：289-295.

［9］周琳, 束長龍, 黃文坤, 等. 轉雙價抗真菌病害基因大豆對根際土壤微生物群落結構的影響［J］. 應用與環境生物學報, 2010,16（4）：509-514.

［10］Zhang Y, Xie M, Peng D. Effects of the transgenic CrylAc and CpTI insect-resistant cotton SGK321 on rhizosphere soil microorganism populations in northern China［J］. Plant Soil Environ, 2014, 60（6）：285-289.

［11］燕麗萍, 劉翠蘭, 李麗, 等. 轉基因苜蓿對土壤微生物的影響［J］. 草業學報 , 2012, 21（5）：63-68.

［12］張瑞福, 崔中利, 李順鵬. 土壤微生物群落結構研究方法進展［J］. 土壤 , 2004, 36（5）：476-480.

［13］張瑞娟, 李華, 林勤保, 等. 土壤微生物群落表征中磷脂脂肪酸（PLFA）方法研究進展［J］. 山西農業科學, 2011, 39：1020-1024.

［14］Nam K, Nam K, Pack I, et al. Effects of transgenic poplars expressing increased levels of cellular cytokinin on rhizosphere microbial communities［J］. Eur J Soil Biol, 2014, 63 ：78-82.

［15］桂恒, 張培培, 華小梅, 等. 富含硫氨基酸轉基因大豆對根際土壤微生物群落結構的影響［J］. 中國油料作物學報, 2012,34（2）：181-187.

［16］李永山, 范巧蘭, 陳耕, 等. 利用PLFA方法研究轉Bt基因棉花對土壤微生物群落結構變化的影響［J］. 棉花學報, 2009,21（6）：503-507.

［17］Papatheodorou E, Efthimiadou E, Stamou G. Functional diversity of soil bacteria as affected by management practices and phenological stage of Phaseolus vulgaris［J］. Eur J Soil Biol, 2008, 44 ：429-436.

［18］陳豐, 彭欣, 華小梅, 等. 富含硫氨基酸轉基因大豆對根際土壤有機元素含量和微生物群落多樣性的影響［J］. 大豆科學,2012, 31（2）：259-265.

［19］Liang J, Xin L, Meng F, et al. High-methionine soybean has no adverse effect on functional diversity of rhizosphere microorganisms［J］. Plant Soil Environ, 2016, 62 ：441-446.

［20］Wei M, Tan F, Zhu H, et al. Impact of Bt-transgenic rice（SHK601）on soil ecosystems in the rhizosphere during crop development［J］. Plant Soil Environ, 2012, 58（5）：217-223.

［21］Staddon W, Duchesne L, Trevors J. Microbial diversity and community structure of postdisturbance forest soils as determined by sole-carbon-source utilization patterns［J］. Microbial Ecol,1997, 34：125-130.

［22］Yao H, He Z, Wilson M, et al. Microbial biomass and community structure in a sequence of soils with increasing fertility and changing land use［J］. Microbial Ecol, 2000, 40：223-237.

［23］Muyzer G. DGGE/TGGE a method for identifying genes from natural ecosystems［J］. Curr Opin Microbiol, 1999, 2：317-322.

［24］浦傳亮, 梁晉剛, 高金玉, 等. 轉胱硫醚-γ-合酶基因高蛋氨酸大豆對土壤細菌群落結構的影響［J］. 南京農業大學學報,2012, 35（4）：8-14.

［25］Wu J, Yu M, Xu J, et al. Impact of transgenic wheat with wheat yellow mosaic virus resistance on microbial community diversity and enzyme activity in rhizosphere soil［J］. PLoS One, 2014, 9（6）：e98394.

［26］Weinert N, Meincke R, Gottwald C, et al. Rhizosphere communities of genetically modified zeaxanthin-accumu-lating potato plants and their parent cultivar differ less than those of different potato cultivars［J］. Appl Environ Microbiol, 2009, 75 ：3859-3865.

［27］ Zhang Y, Xie M, Li Q, et al. Monitoring changes in the actinobacterial field communities present in the rhizosphere soil of a transgenic cotton producing Cry1Ab/Ac proteins［J］. Crop Prot,2017, 91：1-7.

［28］Xie M, Zhang Y, Peng DL, et al. Field studies show no significant effect of a Cry1Ab/Ac producing transgenic cotton on the fungal community structure in rhizosphere soil［J］. Eur J Soil Biol,2016, 73：69-76.

［29］李寧. RRS對根際土壤氮轉化及微生物多樣性影響［D］. 哈爾濱：東北農業大學, 2007.

［30］Liang J, Sun S, Ji J, et al. Comparison of the rhizosphere bacterial communities of Zigongdongdou soybean and a high-methionine transgenic line of this cultivar［J］. PLoS One, 2014, 9：e103343.

［31］杜娟, 吳季榮, 俞明正, 等. 轉基因小麥根際土壤中熒光假單胞菌數量的變化［J］. 麥類作物學報, 2014, 34（3）：345-350.

［32］Chen K, Pachter L. Bioinformatics for whole-genome shotgun sequencing of microbial communities［J］. PLoS Comput Biol,2005, 1（2）：106.

［33］Liang J, Meng F, Sun S, et al. Community structure of arbuscular mycorrhizal fungi in rhizospheric soil of a transgenic highmethionine soybean and a near isogenic variety［J］. PLoS One,2015, 10：e0145001.

［34］Lu G, Zhu Y, Kong L, et al. Impact of a glyphosate-tolerant soybean line on the rhizobacteria revealed by Illumina Miseq［J］. J Microbiol Biotechnol, 2017, 27（3）：561-572.

［35］Lu G, Hua X, Cheng J, et al. Impact of glyphosate on the rhizosphere microbial communities of an EPSPS-transgenic soybean line ZUTS31 by metagenome sequencing［J］. Curr Genomics, 2017, 18（4）：1-14.

Strategies for Evaluating the Effects of Transgenic Crops on Soil Microbial Diversity

LIANG Jin-gang ZHANG Xiu-jie
（Development Center of Science and Technology，Ministry of Agriculture，Beijing 100122）

Microorganisms are the important components of the soil ecosystem. Soil microbial diversity is crucial to the maintenance of ecosystem functioning as soil microorganisms influence many ecosystem processes and drive biogeochemical cycles. Thus，it becomes a hot topic about the potential risks of transgenic crops to soil microorganisms and their effects on soil ecosystem. With the development of modern biotechnologies，the analysis methods for soil microbial diversity have been developed from the traditional separation culture to study microorganisms in the whole soil microecosystem. However，due to the various characteristics of soil microorganisms（such as majority being non-cultivable，tiny bulk，community quorum sensing，etc.）and the detection limitations of instruments and equipment，there are some disadvantages while only using single research method，and other methods should be combined to study microbial diversity in soil ecosystem.So far，the study on soil microbial diversity mainly includes species diversity，functional diversity，structural diversity and genetic diversity，there are a lot of methods used to study the effects of transgenic crops on the diversity of soil microorganisms. In this review，we summarize these methods，and finally the strategies for the future study are proposed.

transgenic crops；soil microorganisms；diversity；strategies

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017-0491

土壤是生物與環境之間物質循環和能量轉化的重要場所之一，其中蘊含著豐富的微生物資源。土壤微生物參與土壤中諸多的生物化學過程，包括土壤有機質的分解、腐殖質的形成、氮磷鉀碳等營養元素的轉化和循環、菌根的形成等，是土壤生態系統的重要組成部分［1］。轉基因作物及其外源基因表達產物進入土壤后，可能與土壤微生物相互作用而影響微生物的活動過程［2］。因此，轉基因作物對土壤微生物數量、群落功能、結構多樣性的影響是評價轉基因作物環境安全性的重要指標之一。

2017-06-11

轉基因生物新品種培育科技重大專項（2016ZX08012003，2016ZX08011-003）

梁晉剛，男，博士，農藝師，研究方向：轉基因生物安全評價與檢測；E-mail：382408162@qq.com

張秀杰，女，副研究員，研究方向：轉基因生物安全評價與檢測；E-mail：zhxj7410@sina.com

（責任編輯 狄艷紅）