強化生物除磷系統的功能微生物研究進展

魏儒平 閆誠 楊欣妍 何曉云 王鑫 楊柳燕

（1. 南京大學環境學院 南京大學污染控制與資源化研究國家重點實驗室，南京 210046；2. 浙江省環境監測中心，杭州 310012）

特約綜述

強化生物除磷系統的功能微生物研究進展

魏儒平1閆誠1楊欣妍1何曉云2王鑫1楊柳燕1

（1. 南京大學環境學院 南京大學污染控制與資源化研究國家重點實驗室，南京 210046；2. 浙江省環境監測中心，杭州 310012）

人類活動過程中排放的磷是導致水體富營養化的重要原因之一，因此，采取強化生物除磷（Enhanced biological phosphorus removal，EBPR）技術去除污水中磷，減輕對環境不利影響。由于具有經濟、可持續的優點，EBPR系統在污水除磷中得到廣泛應用，而體系中微生物群落組成合理、功能完整是EBPR系統高效穩定運行的關鍵所在。為了深入了解EBPR系統除磷機理和實現高效穩定運行，對系統中微生物群落結構和主要功能微生物進行了大量研究。EBPR系統中除了具有聚磷能力的聚磷菌（Polyphosphate-accumulating organisms，PAOs）外，還包括沒有聚磷能力的非聚磷菌（non-PAOs），主要為聚糖菌（Glycogen-accumulating organisms，GAOs）和一些輔助細菌等。目前，發現與聚磷相關的功能微生物種類越來越多，研究最多的PAOs和GAOs分別為Accumulibacter和Defluviicoccus。PAOs和GAOs在不同的環境條件下存在競爭或合作關系，但是PAOs在特定條件下是否能夠表現出GAOs的代謝特性這一問題還存在爭論。除傳統碳源、pH和溫度等因素影響生物除磷外，外源污染物（如抗生素和重金屬）對EBPR系統中功能微生物也產生影響。為了獲得高效PAOs，傳統分離方法、藍白斑篩選法和人工構建工程菌的方法先后得到應用。現代分子生物學技術的發展為EBPR系統中功能微生物研究提供了先進可靠的技術手段，通過高效聚磷菌的構建實現高效除磷是未來提高實際污水中生物除磷效率的一個重要發展方向。

強化生物除磷；聚磷菌；聚糖菌；藍白斑篩選；高效聚磷工程菌

水體富營養化已經是全球面臨的重大水環境問題，人類活動中氮磷等營養元素進入水體是導致富營養化的主要原因，由于磷是水體藻類生長的限制因子［1］，因此，控制磷的排放比控制氮的排放更具有實際意義。強化生物除磷（Enhanced biological phosphorus removal，EBPR）工藝作為經濟、可持續的除磷方法在污水處理廠中得到廣泛應用［2］。EBPR工藝通過活性污泥處理污水過程中厭氧階段和好氧階段的交替運行，為系統中某些能夠“超量吸磷”的微生物營造合適的生長條件，磷隨著好氧階段末端的排泥得到去除。

EBPR系統高效穩定運行的關鍵是體系中微生物群落組成合理、功能完整。近30年來很多研究者對該系統主要功能微生物進行了大量的研究，但仍未能全面深入了解系統中微生物的群落結構組成、功能和影響因素。此外，很多學者也嘗試從該體系中獲得純培養的功能菌株，在人工控制條件下將其重新添加到體系中，以恢復或增強EBPR的除磷效果。

因此，本文從微生物學的角度對EBPR系統進行綜述，重點關注功能微生物的組成、影響因素和高效聚磷菌的獲取方法。在厘清功能微生物種群、尋找獲取高效聚磷菌新方法的基礎上，旨為EBPR系統的高效穩定運行提供技術參考。

1 EBPR系統中功能微生物及影響因素

1.1 主要功能微生物

EBPR系統中存在大量微生物，包括非細胞型的病毒和細胞型的古生菌、細菌、真菌和微型藻類等［3］，其中功能微生物是研究者們關注的重點。這類微生物除了具有聚磷能力的聚磷菌（Polyphosphateaccumulating organisms，PAOs）外，還包括沒有聚磷能力的非聚磷菌（non-PAOs），主要包括聚糖菌（Glycogen-accumulating organisms，GAOs）和一些輔助細菌等［4］。

1.1.1 聚磷菌 聚磷菌是指具有厭氧釋磷、好氧吸磷特性的一類微生物。它們可以在厭氧條件下分解多聚磷酸鹽（Polyphosphates，poly-P），以正磷酸鹽的形式釋放到細胞外，同時利用釋放的能量合成聚羥基鏈烷酸（Polyhydroxylkanoates，PHAs）；在好氧階段，PAOs可以過量攝取水中溶解態正磷酸鹽合成多聚磷酸鹽儲存在細胞體內，隨著剩余污泥排出污水處理系統，從而達到生物除磷的目的。

γ-變 形 菌 綱（γ-protebacteria） 的 不 動 桿 菌（Acinetobacter）是最早發現能夠去除EBPR系統中磷的微生物。40多年前，研究者們開始嘗試用純培養的方法從EBPR系統中分離出具有聚磷能力的單菌株。1975年，Fuhs 等［3］首次運用該方法獲得一株能夠聚磷的不動桿菌。在后來很長一段時間內不動桿菌都被認為是EBPR系統中唯一的PAOs，大量的研究也集中在不動桿菌上［5-7］。然而，研究發現不動桿菌不符合PAOs的代謝模型［8］，因此不是主要的聚磷菌。

隨著分子生物學技術的廣泛應用，研究者們發現在污水處理廠規模運行的EBPR系統中，不動桿菌的豐度要遠小于β-變形菌（β-proteobacteria）和放線菌（Actinobacteria）等其他微生物［9］。Che等［10］運用電子顯微鏡和16S rRNA基因測序等方法分析了SBR活性污泥的微生物群落，結果發現β-變形菌是最豐富的微生物，負責系統中磷和COD的去除。

四球蟲屬（Tetrasphaera）被認為是EBPR系統中具有聚磷能力的微生物。Kristiansen等［11］研究發現，在丹麥污水處理廠的活性污泥中，四球蟲屬豐度很高，占據重要生態位，而且四球蟲屬的微生物不僅可以聚磷，在反硝化與發酵過程中也起著重要作用。

目前公認的聚磷能力最強、研究最多的PAOs是一類屬于β-變形菌綱紅環菌屬（Rho-docyclacae）的菌株［12］，Hesselmann等［13］最早將它命名為“Candidatus Accumulibacter phosphatis”，通常縮寫為“Accumulibacter”。

最新研究［14］顯示，在側流EBPR系統中，PAOs具有很高的豐度，微生物群落結構分析表明，反應器中主要存在的微生物是變形菌門（特別是β-變形菌綱和γ-變形菌綱）；對細菌進一步分析表明，多種微生物屬于PAOs，包括Accumulibacter、四球蟲屬、紅環菌屬以及反硝化聚磷菌（Denitrifying phosphate-accumulating organisms，DPAOs）。

目前，從實驗室到污水處理廠規模的EBPR系統中發現的PAOs種類很多，除上述的不動桿菌、放線菌、四球蟲屬、紅環菌屬及Accumulibacter外，希瓦氏菌（Shewanella）［15］、假單胞菌（Pseudomonas）、氣單胞菌（Aeromonas）、聚磷小月菌（Microlunatus phosphovorus）、俊片菌（Lampropedia）等［16］都是PAOs，具有聚磷能力。

1.1.2 聚糖菌 GAOs的代謝機制與PAOs類似，它們可以在厭氧條件下分解糖原，同時合成聚羥基鏈烷酸（PHAs）以儲存釋放的能量；在好氧階段，GAOs消耗PHAs合成糖原。與PAOs相同，20多年前開始的關于GAOs的研究也是試圖尋找符合GAOs代謝模型的微生物。Cech等［17-18］在以葡萄糖和乙酸鹽為碳源的系統中觀察到大量排列成四分體的球形細胞，但是在厭氧條件下沒有正磷酸鹽釋放，他們將這種生物稱為“G細菌”。隨后有研究者根據其形態將其稱為“Tetrad-forming organisms（TFOs）”［19］。GAOs這一術語是 Mino 等［20］提出，該定義是基于其好氧階段合成糖原的代謝特性而不是其形態類型。目前，研究者們關注最多的GAOs是“Candidatus Competibacter phosphatis”，通常簡稱為 Competibacter，屬于 γ-變形菌綱［21］；另一種主要GAOs的發育地位近似Defluviicoccus vanus，通常簡稱為Defluviicoccus，屬于α-變形菌綱［22］。

GAOs不能儲存多聚磷酸鹽，對于EBPR系統中磷酸鹽的去除沒有貢獻。而且，GAOs與PAOs爭奪底物，抑制PAOs生長，從而對磷酸鹽的去除產生負面影響［23］。Mielczarek 等［24］調查了丹麥 28 個污水處理廠規模運行的EBPR系統，結果發現除磷效率降低往往伴隨著GAOs的累積。

由于PAOs和GAOs代謝機制十分相似，有學者提出PAOs在一定條件下是否可以轉化成GAOs？早前的研究［25］表明，當細胞內Poly-P耗盡時，PAOs在厭氧條件下不能攝取乙酸。但是，也有研究得出了不同的結論。Zhou等［26］使用富含80%典型聚磷菌Accumulibacter的污泥，在厭氧和Poly-P限制條件下研究這些微生物利用乙酸的能力。他們發現，3個周期之后，幾乎沒有正磷酸鹽的釋放，但是PAOs仍然能夠吸收乙酸并將其儲存為PHAs，而糖原降解的顯著增加表明PAOs以糖原為主要能源，這表現出了GAOs的關鍵特征。

1.1.3 其他微生物 發酵細菌和水解細菌等也是EBPR系統中的重要微生物，它們通過發酵和水解作用將大分子有機物分解為功能微生物可直接利用的小分子，為其提供碳源和能量。這些細菌與PAOs、GAOs及相關微生物一起構成EBPR系統中完整的群落結構，保證系統發揮良好的除磷性能。

放線菌門和厚壁菌門（Firmicutes）是發酵細菌兩個主要門類。Jeppe 等運用同位素標記的RNA探針鑒定了污水處理廠規模運行的EBPR系統中葡萄糖發酵細菌的種類和豐度，結果發現四球蟲屬、丙酸桿菌（Propionicimonas）和乳球菌（Lactococcus）、鏈球菌（Streptococcus）是主要的葡萄糖發酵細菌，它們都屬于革蘭氏陽性菌［27］。在10個污水處理廠規模的EBPR系統中，這4種細菌平均共占總生物體積的39%，其中四球蟲屬是最豐富的葡萄糖發酵細菌，占總生物體積的33%，丙酸桿菌、鏈球菌和乳球菌分別占4%、1%和0.4%。有研究發現甘露糖和半乳糖可以被發酵為乙酸、丙酸、乳酸和甲酸等揮發性脂肪酸，但是何種微生物的作用尚不明確。此外，絲狀細菌、四球蟲屬和微絲菌屬（Microthrix）分別被認為是EBPR系統中水解蛋白質、多糖和脂質的主要細菌［28］。

1.2 影響EBPR系統功能微生物的因素

在研究EBPR系統功能微生物時，聚磷菌和聚糖菌是關注的焦點。之前的觀點普遍認為PAOs與GAOs之間存在競爭關系［29］；而最近有文獻報道，在以亞硝酸鹽為電子受體同時去除硝酸鹽和正磷酸鹽的過程中，PAOs與GAOs表現出良好的合作關系［30］。EBPR系統中主要功能微生物（PAOs和GAOs）的種類及其豐度受到很多因素的影響。

1.2.1 碳源 碳源是影響EBPR系統中功能微生物的重要因素，常見的碳源種類有葡萄糖［31］、乙酸［32］、丙酸［33］等。除了單一種類碳源外，不同比例的混合碳源也受到一些研究者的關注［34］。姜濤［35］研究表明，以乙酸鈉和丙酸鈉作為碳源時，PAOs對二者的吸收速率基本相同，而GAOs對乙酸鈉的吸收速率要遠高于對丙酸鈉的吸收速率。采用葡萄糖作為碳源時，厭氧區也存在糖原的合成，導致PAOs繼續利用糖原進行后續酵解，從而降低EBPR系統的穩定性。張蘭河等［36］在連續流的A2/O反應器中考察不同碳源對PAOs和GAOs種類和豐度的影響，結果發現采用葡萄糖作為碳源時，GAOs富集最多，PAOs數量較少，說明葡萄糖不利于PAOs生長。采用乙酸和丙酸作為碳源時，分別獲得最多的PAOs和最少的GAOs，聚磷菌更容易成為優勢種。

1.2.2 pH EBPR系統的性能受到外部pH的強烈影響，這是因為不同的酸堿條件下微生物的群落結構及相關功能微生物的活性存在很大差異。Zhang等［37］對于EBPR相關的特定酶活性進行研究發現，在pH 6.4-7.6的范圍內，較高的pH值有利于PAOs的生長和提高其活性，從而提高除磷性能。Ahn等［38］研究了實驗室規模的EBPR系統中，在穩定條件下不同pH值對微生物群落組成的長期影響。他們發現，當pH值從7.5降到7.0，再降到6.5的過程中，PAOs:GAOs平衡發生變化，PAOs在代謝過程中表現的越來越像GAOs。他們進而認為，EBPA性能的降低不一定是系統中微生物群落結構發生了變化，而是由于原來功能微生物代謝方式的轉變。Fukushima等［39］在3個實驗室規模的反應器中研究了pH降低對PAOs和GAOs的影響，結果表明pH降低對Accumulibacter數量下降具有即時或延遲的影響。同時，Accumulibacter數量下降與EBPR系統性能開始下降之間也存在時間延遲，這意味著pH降低導致EBPR系統性能降低的原理還需要進一步探索。

1.2.3 溫度 原水和外部環境的溫度是影響EBPR系統微生物群落和功能微生物代謝特征的又一重要因素。微生物的活性、生化反應的速率都受到溫度的影響，之前普遍的觀點認為較低的溫度可能使功能微生物活性降低，代謝速率減慢，導致EBPR系統的除磷效率下降。Erdal等［40］在實驗室對5℃條件下失效的EBPR系統進行了深入的酶學研究，結果表明系統除磷性能的下降可能不是GAOs增殖的結果，而是PAOs的代謝途徑存在向GAOs等non-PAOs轉換的可能，導致PAOs體內儲存更多的糖原而不是poly-P。關于溫度對影響EBPR系統中微生物的機理還沒有完全明確，有待進一步研究。

1.2.4 外源污染物 近幾年來，外源污染物對EBPR系統中微生物群落結構尤其是功能微生物的影響越來越受到研究者們的關注。Hu等［41］評估了紅霉素（ERY）和土霉素（OTC）在短期（24 h）內對EBPR系統的影響，分別考察了個體效應和組合效應。結果表明，10 mg/L 的ERY和OTC可以抑制功能微生物的活性，但24 h內不會引起嚴重的功能微生物死亡；由于OTC對革蘭氏陰性細菌具有特殊的抗性，而PAOs大多屬于這類細菌，所以OTC比ERY對于EBPR系統具有更強烈的負面影響。該團隊還采用高通量測序方法研究了ZnO納米顆粒（NPs）對EBPR系統中微生物群落的影響，結果表明，在高濃度（高于6 mg/L）的ZnO NPs條件下，EBPR體系的物種豐富度降低。暴露于2 mg/L ZnO NPs之中，Competibacter 比 Accumulibacter更容易受其影響。將EBPR系統恢復20 d后，發現反應器中微生物群落轉變是不可逆的［42］。Sun 等［43］研究了 Ni（II）在0.1-10 mg/L范圍內對EBPR的短期和長期影響，微生物群落調查顯示，長期接觸Ni（II）后，α-變形菌綱的GAOs代替PAOs成為EBPR系統中主要的微生物。

2 高效聚磷菌獲取

2.1 高效聚磷菌的篩選和分離

從污水處理廠EBPR系統的活性污泥中篩選和分離出具有聚磷功能的微生物是目前應用最廣泛的獲得高效聚磷菌的方法。

2.1.1 傳統分離方法 傳統篩選和分離高效聚磷菌方法：利用不同培養基將微生物從污泥或污水等環境樣品中分離純化，在缺磷培養基中饑餓放磷之后投加到富磷培養基中計算除磷效率，從而篩選出高效PAOs。周明璟等［44］通過厭氧/好氧交替的平板篩選方法得到15株除磷率高于60%的高效PAOs，包括13株γ-變形菌綱菌株和2株芽孢桿菌；投加菌株后可將活性污泥的除磷率由原來的52%提高到73.3%。莊志剛等［45］以排污口污泥為原始材料，采用傳統微生物篩選方法，分離得到一株高效PAOs，通過分子生物學鑒定為產堿桿菌（Alcaligenes）；該菌株可以耐受濃度45 g/mL 以內的磷。朱衛強等［46］利用同樣的方法從污水處理廠的活性污泥中獲得兩株假單胞菌屬的DPAOs，它們在經過馴化后能有效去除高鹽度廢水中的氮磷。

自然條件下，環境樣品中PAOs通常不是優勢種，為了提高篩菌的效率，有研究者采用先富集后分離的方法獲得高效聚磷菌。李慧等［47］先用SBR反應器對活性污泥進行富集馴化，之后從中篩選得到3株高效PAOs，通過分子生物學鑒定為氣單胞菌屬（Aeromonas）。劉彩云等［48］以污水處理廠成熟的活性污泥為菌種來源，在富集培養基中循環7個周期之后，結合經典微生物篩選方法，獲得一株脫氮除磷效率超過90%的假單胞菌。

2.1.2 藍白斑篩選 2003年，Morohoshi等［49］發現phoU基因突變可導致大腸桿菌中多聚磷酸鹽的積累，在N-甲基-N’-硝基-N-亞硝基胍（NTG）誘變后，在含有5-溴-4-氯-3-吲哚基-磷酸酯（X-P-i）的瓊脂平板上，phoU突變體可以很容易地被篩選出來，由此開發了“藍白斑”篩選法。他們運用這種方法獲得兩株高效PAOs，惡臭假單胞菌MY11和不動桿菌K3，在磷含量9 mg/L的合成培養基中除磷效率接近90%。

隨后，在高效PAOs的篩選中藍白斑篩選法得到越來越多的應用。蔡天明等［50］采用藍白斑篩選，結合傳統方法，從土壤中獲得一株弗氏檸檬酸桿菌（Citrobacter freundii）GM1；在MOPS 培養基中好氧培養24 h 后，GM1 可將初始濃度為43.8 mg/L的磷去除69%。該團隊采用相同的方法分離獲得另一株高效PAOs惡臭假單胞菌GM6；采用SBR工藝處理磷含量約9 mg/L的醫院廢水，加入該菌株20 d后出水磷濃度約0.3 mg/L，去除率達96.8%［51］。張丹丹等［52］采用藍白斑篩選法從污水處理廠活性污泥中分離出兩株高效PAOs，其中一株與植生拉烏爾菌（Raoultella planticola）的同源性為98%，一株與克雷伯氏桿菌（Klebsiella pneumoniae）的同源性為98%。

2.2 高效聚磷菌的構建

除了直接通過篩選和分離得到的野生型高效PAOs外，還可以在深入了解poly-P代謝相關基因和酶的基礎上，使用基因工程手段人工構建高效聚磷工程菌。近年來，越來越多的研究集中在聚磷工程菌的聚磷機制［53］。多聚磷酸鹽激酶（Polyphosphate kinase，PPK）是在PAOs聚磷過程中合成poly-P的關鍵酶，在宿主細胞中過表達PPK基因是構建高效聚磷工程菌的途徑。

王勤等［54］克隆大腸桿菌聚磷激酶，定向轉入到受體菌株大腸桿菌BL21（DE3）中，得到可過表達PPK 的基因工程菌BL-PPK；在IPTG的誘導下，BL-PPK 菌能大量合成poly-P，其細胞內含量比對照菌高20倍，培養液中磷酸鹽濃度約為對照菌培養液中磷酸鹽濃度的1/9。杜宏偉等［55］將攜帶大腸桿菌PPK基因的重組質粒pUTmini-Tn5-PPK整合進入惡臭假單胞菌KT2440中，獲得基因工程菌KT2440-PPK，人工模擬污水實驗結果表明，KT2440-PPK可以去除該模擬污水中90%以上的磷酸鹽。

3 結語

綜上所述，對EBPR系統中的微生物學研究已經取得一定的進展，研究發現的PAOs和GAOs以及其他輔助細菌的種類越來越多。除傳統碳源、pH、溫度等因素外，外源污染物（如抗生素和重金屬）對于EBPR系統中微生物組成的影響逐漸受到關注。為了獲得高效PAOs，傳統分離方法、藍白斑篩選法、人工構建工程菌的方法先后得到應用。但是，PAOs在特定條件下是否能夠表現出GAOs的代謝特性這一問題還存在爭論。現代分子生物學技術的發展將為EBPR系統中功能微生物的研究提供先進可靠的技術手段［56-57］。筆者認為，未來的研究將圍繞以下幾個方面展開。

3.1 深入研究代謝機理

了解EBPR系統中主要功能微生物的代謝機理是研究EBPR系統中PAOs和GAOs種群數量動態變化的基礎。未來的研究將應用聚合酶鏈式反應（PCR）、16s rRNA測序、熒光標記原位雜交（FISH）等一系列現代分子生物學技術，從底物吸收機制、糖酵解途徑、三羧酸循環等幾個方面深入研究EBPR系統中微生物的代謝多樣性和特異性。進一步研究PAOs與GAOs在不同環境條件下的代謝模型，判斷它們的競爭、合作和轉化關系，掌握系統中主要功能微生物的種群結構動態變化過程。

3.2 探索獲取高效聚磷菌的新方法

傳統分離方法和藍白斑篩選法過程比較繁瑣、得到的功能微生物種類較少，人工構建的工程菌效果還不夠穩定［58］。因此，為了簡單、快速獲得高效PAOs，需要不斷改進創新分離和篩選方法。例如，在探明菌株代謝和聚磷機理的基礎上，添加特定顯色劑、改良培養基配方、合理使用富營養培養基和寡營養培養基，直接根據菌落形態和顏色挑選出PAOs。同時，鑒于人工構建的工程菌質粒易丟失、對環境的適應能力較差等現狀，為PPK基因尋找合適的載體和宿主細菌，構建結構穩定、聚磷效率高的工程菌是目前重要的研究方向。

3.3 高效聚磷菌應用于實際污水

目前，研究者普遍使用人工模擬廢水驗證高效PAOs的除磷效果，但是將其應用于實際污水中除磷的研究卻少見報道。實際污水化學成分和微生物群落結構復雜，基于人工模擬廢水的研究成果很難準確指導EBPR系統的實際運行。一方面，選擇在實際污水中能夠成為優勢種群的宿主細菌；另一方面，使用實際污水驗證高效PAOs的除磷效果。總之，應用基因工程技術獲得能夠在污水中生長除磷的高效聚磷工程菌，優化運行條件為體系中功能微生物提供適合的生長環境是未來研究的主要趨勢之一。

［1］Zamparas M, Zacharias I. Restoration of eutrophic freshwater by managing internal nutrient loads. A review［J］. Science of the Total Environment, 2014, 496：551-562.

［2］Liu Y, Chen Y, Zhou Q. Effect of initial pH control on enhanced biological phosphorus removal from wastewater containing acetic and propionic acids［J］. Chemosphere, 2007, 66（1）：123-129.

［3］Fuhs GW, Chen M. Microbiological basis of phosphate removal in the activated sludge process for the treatment of wastewater［J］.Microbial Ecology, 1975, 2（2）：119-138.

［4］Li WW, Zhang HL, Sheng GP, et al. Roles of extracellular polymeric substances in enhanced biological phosphorus removal process［J］. Water Research, 2015, 86（20）：85-95.

［5］Hiraishi A, Morishima Y. Capacity for polyphosphate accumulation of predominant bacteria in activated sludge showing enhanced phosphate removal［J］. Journal of Fermentation & Bioengineering,1990, 69（6）：368-371.

［6］Auling G, Pilz F, Busse H, et al. Analysis of the polyphosphateaccumulating microflora in phosphorus-eliminating, anaerobicaerobic activated sludge systems by using diaminopropane as a biomarker for rapid estimation of Acinetobacter spp［J］. Applied &Environ Microbiol, 1991, 57（12）：3585-3592.

［7］Bark K, Sponner A, K?mpfer P, et al. Differences in polyphosphate accumulation and phosphate adsorption by Acinetobacter isolates from wastewater producing polyphosphate：AMP phosphotransferase［J］. Water Research, 1992, 26（10）：1379-1388.

［8］ Seviour RJ, Mino T, Onuki M. The microbiology of biological phosphorus removal in activated sludge systems［J］. Fems MicroBiol Rev, 2003, 27（1）：99-127.

［9］Wagner M, Erhart R, Manz W, et al. Development of an rRNA-targeted oligonucleotide probe specific for the genus Acinetobacter and its application for in situ monitoring in activated sludge［J］.Applied & Environ Microbiol, 1994, 60（3）：792-800.

［10］Che OJ, Lee DS, Park JM. Microbial communities in activated sludge performing enhanced biological phosphorus removal in a sequencing batch reactor［J］. Water Research, 2003, 37（9）：2195-2205.

［11］Kristiansen R, Nguyen HTT, Saunders AM, et al. A metabolic model for members of the genus Tetrasphaera involved in enhanced biological phosphorus removal［J］. Isme Journal, 2013, 7（3）：543-554.

［12］吉茸, 王少坡, 趙樂丹, 等. 聚磷菌Accumulibacter各進化枝研究進展［J］. 工業水處理, 2017, 37（1）：7-11.

［13］Hesselmann RPX, Werlen C, Hahn D, et al. Enrichment,phylogenetic analysis and detection of a bacterium that performs enhanced biological phosphate removal in activated sludge［J］.Systematic & Applied Microbiology, 1999, 22（3）：454.

［14］Islam MS, Zhang Y, Dong S, et al. Dynamics of microbial community structure and nutrient removal from an innovative sidestream enhanced biological phosphorus removal process［J］. J Environ Mange, 2017, 198（Pt1）：300-307.

［15］Liu H, Yang Y, Ge Y, et al. Interaction between common antibiotics and a Shewanella strain isolated from an enhanced biological phosphorus removal activated sludge system［J］. Bioresource Technology, 2016, 222：114.

［16］葛艷輝. 強化生物除磷系統除磷效果及微生物群落結構分析［D］. 天津：天津大學, 2012.

［17］Cech JS, Hartman P. Glucose induced break down of enhanced biological phosphate removal［J］. Environmental Technology,1990, 11（7）：651-656.

［18］Cech JS, Hartman P. Competition between polyphosphate and polysaccharide accumulating bacteria in enhanced biological phosphate removal systems［J］. Water Research, 1993, 27（7）：1219-1225.

［19］Seviour RJ, Maszenan AM, Soddell JA, et al. Microbiology of the‘G-bacteria’ in activated sludge［J］. Environ Microbiol, 2000, 2（6）：581-593.

［20］Mino T, Liu WT, Kurisu F, et al. Modelling glycogen storage and denitrification capability of microorganisms in enhanced biological phosphate removal processes［J］. Water Science & Technology,1995, 31（2）：25-34.

［21］Nielsen AT, Liu WT, Filipe C, et al. Identification of a novel group of bacteria in sludge from a deteriorated biological phosphorus removal reactor［J］. Applied & Environ Microbiol, 1999, 65（3）：1251.

［22］孫雪, 朱為靜, 王亮, 等. 強化生物除磷系統主要微生物及其代謝機理研究進展［J］. 應用生態學報, 2014, 25（3）：892-902.

［23］Oehmen A, Lemos PC, Carvalho G, et al. Advances in enhanced biological phosphorus removal：from micro to macro scale［J］.Water Research, 2007, 41（11）：2271-2300.

［24］Mielczarek AT, Nguyen HT, Nielsen JL, et al. Population dynamics of bacteria involved in enhanced biological phosphorus removal in Danish wastewater treatment plants［J］. Water Research, 2013,47（4）：1529-1544.

［25］Brdjanovic D, Loosdrecht MCMV, Hooijmans CM, et al. Effect of polyphosphate limitation on the anaerobic metabolism of phosphorus-accumulating microorganisms［J］. Applied Microbiology & Biotechnology, 1998, 50（2）：273-276.

［26］Zhou Y, Pijuan M, Zeng RJ, et al. Could polyphosphateaccumulating organisms（PAOs）be glycogen-accumulating organisms（GAOs）？［J］. Water Research, 2008, 42（10-11）：2361-2368.

［27］Nielsen JL, Nguyen H, Meyer RL, et al. Identification of glucosefermenting bacteria in a full-scale enhanced biological phosphorus removal plant by stable isotope probing［J］. Microbiology, 2012,158（Pt 7）：1818.

［28］Nielsen PH, Mielczarek AT, Kragelund C, et al. A conceptual ecosystem model of microbial communities in enhanced biological phosphorus removal plants［J］. Water Research, 2010, 44（17）：5070-5088.

［29］許秀紅, 李秀, 李紹峰, 等. 強化生物除磷系統中聚磷菌和聚糖菌的競爭研究進展［J］. 化學工程師, 2017（1）：44-48.

［30］Rubiorincón FJ, Lopezvazquez CM, Welles L, et al. Cooperation between Candidatus Competibacter and Candidatus Accumulibacter clade I, in denitrification and phosphate removal processes［J］. Water Research, 2017, 120：156-164.

［31］Che OJ, Park JM. Enhanced biological phosphorus removal in a sequencing batch reactor supplied with glucose as a sole carbon source［J］. Water Research, 2000, 34（7）：2160-2170.

［32］Gebremariam SY, Beutel MW. Effects of glucose on the performance of enhanced biological phosphorus removal activated sludge enriched with acetate［J］. Bioresource Technology, 2012,121（7）：19.

［33］Pijuan M, Saunders AM, Guisasola A, et al. Enhanced biological phosphorus removal in a sequencing batch reactor using propionate as the sole carbon source［J］. Biotechnology & Bioengineering,2004, 85（1）：56-67.

［34］Xie T, Mo C, Li X, et al. Effects of different ratios of glucose to acetate on phosphorus removal and microbial community of enhanced biological phosphorus removal（EBPR）system［J］.Environ Sci Pollut Res Int, 2017, 24（5）：4494-4505.

［35］姜濤. 溫度與碳源對生物除磷系統中PAO和GAO影響及除磷效能研究［D］. 哈爾濱：哈爾濱工業大學, 2011.

［36］張蘭河, 李德生, 王旭明, 等. 不同碳源對聚磷菌與聚糖菌競爭的影響［J］. 化學工程, 2015, 43（10）：1-5.

［37］Zhang C, Chen Y, Liu Y. Effect of pH on enzyme activity involved in enhanced biological phosphorus removal system［C］. 13th international biotechnology symposium and exhibition, 2008：S657.

［38］Ahn J, Mcilroy S, Schroeder S, et al. Biomass granulation in an aerobic：anaerobic-enhanced biological phosphorus removal process in a sequencing batch reactor with varying pH［J］.Journal of Industrial Microbiology & Biotechnology, 2009, 36（7）：885.

［39］Fukushima T, Onuki M, Satoh H, et al. Effect of pH reduction on polyphosphate- and glycogen-accumulating organisms in enhanced biological phosphorus removal processes［J］. Water Science &Technology A Journal of the International Association on Water Pollution Research, 2010, 62（6）：1432-1439.

［40］Erdal UG, Erdal ZK, Daigger GT, et al. Is it PAO-GAO competition or metabolic shift in EBPR system？ Evidence from an experimental study［J］. Water Science & Technology A Journal of the International Association on Water Pollution Research, 2008,58（6）：1329.

［41］Hu Z, Sun P, Hu Z, et al. Short-term performance of enhanced biological phosphorus removal（EBPR）system exposed to erythromycin（ERY）and oxytetracycline（OTC）［J］.Bioresource Technology, 2016, 221：15-25.

［42］Hu Z, Lu X, Sun P, et al. Understanding the performance of microbial community induced by ZnO nanoparticles in enhanced biological phosphorus removal system and its recoverability［J］.Bioresource Technology, 2016, 225：279-285.

［43］Sun J, Yang Q, Wang DB, et al. Nickel toxicity to the performance and microbial community of enhanced biological phosphorus removal system［J］. J Sunetal. /Chemical Engineering Journal,2017, 313：415-423.

［44］周明璟, 紀樹蘭, 崔丹紅, 等. 厭氧/好氧交替快速篩選聚磷菌及其生理特性的研究［J］. 中國環境科學, 2012, 32（10）：1838-1844.

［45］莊志剛, 韓永和, 章文賢, 等. 高效聚磷菌Alcaligenes sp.ED-12菌株的分離鑒定及其除磷特性［J］. 環境科學學報,2014, 34（3）：678-687.

［46］朱衛強, 陳舒, 張培玉. 2株反硝化聚磷菌的篩選及其影響因素［J］. 環境工程學報, 2016, 10（6）：3295-3302.

［47］李慧, 劉丹丹, 陳文清. 反硝化聚磷菌的篩選及脫氮除磷特性［J］. 環境工程 , 2016, 34（4）：25-28.

［48］劉彩云, 朱衛強, 邱晨, 等. 一株反硝化聚磷菌的篩選及其脫氮除磷性能研究［J］. 青島大學學報：自然科學版, 2016, 29（2）：51-56.

［49］Morohoshi T, Yamashita T, Kato J, et al. A method for screening polyphosphate-accumulating mutants which remove phosphate efficiently from synthetic wastewater［J］. Journal of Bioscience &Bioengineering, 2003, 95（6）：637-640.

［50］蔡天明, 管莉菠, 崔中利, 等. 高效聚磷菌株GM1的分離和聚磷特性研究［J］. 土壤學報, 2005, 42（4）：635-641.

［51］Cai TM, Guan LB, Chen LW, et al. Enhanced Biological Phosphorus Removal with Pseudomonas putida GM6 from Activated Sludge［J］. Pedosphere（土壤圈：英文版）, 2007, 17（5）：624-629.

［52］張丹丹, 孫永利, 李鵬峰, 等. 化學強化除磷污水處理廠聚磷菌的分離篩選［J］. 天津理工大學學報, 2016, 32（5）：60-64.

［53］Liang M, Frank S, Lünsdorf H, et al. Bacterial microcompartment directed polyphosphate kinase promotes stable polyphosphate accumulation in E. coli［J］. Biotechnology Journal, 2017, 12（3）.doi：10. 1002/biot. 201600415.

［54］王勤, 趙慶順, 肖琳, 等. 轉聚磷激酶基因的大腸桿菌去除水體中的磷［J］. 中國環境科學, 2006, 26（6）：742-745.

［55］杜宏偉, 武俊, 肖琳, 等. 聚磷激酶基因在假單胞菌中的整合和表達［J］. 環境科學, 2009, 30（10）：3011-3015.

［56］Wilmes P, Andersson AF, Lefsrud MG, et al. Community proteogenomics highlights microbial strain-variant protein expression within activated sludge performing enhanced biological phosphorus removal［J］. Isme Journal, 2008, 2（8）：853.

［57］Albertsen M, Saunders AM, Nielsen KL, et al. Metagenomes obtained by ‘deep sequencing’-what do they tell about the enhanced biological phosphorus removal communities？［J］.Water Science & Technology A Journal of the International Association on Water Pollution Research, 2013, 68（9）：1959-1968.

［58］李海峰, 李志建, 屈建航. 高效聚磷菌的分離、篩選與構建的研究進展［J］. 生物技術, 2012, 22（4）：93-97.

Research Progress on the Functional Microorganisms in Enhanced Biological Phosphorus Removal（EBPR）Systems

WEI Ru-ping1YAN Cheng1YANG Xin-yan1HE Xiao-yun2WANG Xin1YANG Liu-yan1
（1. School of the Environment，Nanjing University，State Key Laboratory of Pollution Control and Resource Reuse，Nanjing 210046 ；2.Zhejiang Environmental Monitoring Centre，Hangzhou 310012）

Phosphorus emission from human activities is one of the major causes of water eutrophication. The technology of enhanced biological phosphorus removal（EBPR）has been widely applied for removing phosphorus from wastewater due to its advantages of economy and sustainability. The key to the efficient and stable operation of EBPR system is that the microbial community in the system is reasonable and functional. For deeply understanding the mechanism of phosphorus removal and the efficient and stable operation of EBPR system，a large number of studies were conducted on the microbial community structure and main functional microorganisms in the system. In addition to polyphosphate-accumulating organisms（PAOs），the EBPR system also includes non-PAOs，mainly glycogen-accumulating organisms（GAOs）and some auxiliary bacteria. Nowadays，more and more types of functional polyphosphate-accumulating microorganisms were identified，and the most studied PAOs and GAOs were Accumulibacter and Defluviicoccus respectively. PAOs and GAOs compete or cooperate under different environmental conditions，but it is still controversial whether PAOs may exhibit the metabolic properties of GAOs under certain conditions.Besides the traditional factors such as carbon source，pH and temperature，the effects of exogenous pollutants，like antibiotics and heavy metals，on functional microorganisms in EBPR system also exist. The traditional separation methods，blue/white screening and the method of artificial construction of gene engineering bacteria have been applied for acquiring efficient PAOs. The development of modern molecular biologytechnology provides advanced and reliable technical means for the research of functional microorganisms in EBPR system，and the efficient removal of phosphorous by constructing high-performance polyphosphate-accumulating microorganisms will be an important trend in future increasing bio-removal phosphorus efficiency from actual wastewater.

enhanced biological phosphorus removal；polyphosphate-accumulating organisms；glycogen-accumulating organisms；blue/white screening；high-efficient polyphosphate-accumulating engineering organisms

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017-0558

2017-07-04

國家水體污染控制與治理科技重大專項（2017ZX07204）

魏儒平，男，碩士研究生，研究方向：環境微生物學；E-mail：18956268200@163.com

楊柳燕，男，教授，博士生導師，研究方向：環境微生物學；E-mail：yangly@nju.edu.cn

（責任編輯 狄艷紅）