云南省德宏州煙草黑脛病菌對烯酰嗎啉的敏感性

賀曉輝，肖志新，宋玉川，胡志明，王 杰，李義強，王鳳龍

（1.云南省香料煙有限責任公司，云南 德宏州 678400；2.中國農業科學院 煙草研究所，山東 青島 266101；3.云南省煙草公司保山市公司，云南 保山 678000）

云南省德宏州煙草黑脛病菌對烯酰嗎啉的敏感性

賀曉輝1，肖志新3，宋玉川1，胡志明3，王 杰2，李義強2，王鳳龍2

（1.云南省香料煙有限責任公司，云南 德宏州 678400；2.中國農業科學院 煙草研究所，山東 青島 266101；3.云南省煙草公司保山市公司，云南 保山 678000）

為明確新開發煙葉生產區云南省德宏州煙草黑脛病菌對烯酰嗎啉的敏感性現狀，從德宏州13個縣市采集68株煙草黑脛病菌株，采用菌絲生長速率法測定了煙草黑脛病菌株對烯酰嗎啉的敏感性和抗藥水平。結果表明，烯酰嗎啉抑制煙草黑脛病菌菌絲生長的EC50范圍為0.462 8~2.575 2 μg/mL，平均EC50為1.388 1 μg/mL，屬于中抗水平。統計分析表明，煙草黑脛病菌68個菌株菌絲生長對烯酰嗎啉的敏感性符合正態分布，最不敏感菌株的EC50值為最敏感菌株的5.56倍。烯酰嗎啉對德宏州煙草黑脛病仍有較高活性，但應與其他殺菌劑進行合理的輪換使用。

煙草黑脛病菌；烯酰嗎啉；抗藥性水平

煙草黑脛病是由煙草疫霉（Phytophthora parasitica var．nicotianae(Breda de Hean)Tucker）引起的一種破壞性極強，危害嚴重的真菌性土傳病害。該病在我國各煙草產區大量發生，是僅次于煙草病毒病的病害，嚴重影響了煙草的產量和品質[1-2]。因德宏州潮濕、多雨條件較適宜煙草黑脛病菌的生長繁殖，再加上主栽品種為品質較好的易感病品種“紅花大金元”，致使近期德宏州煙葉生產區煙草黑脛病發病嚴重，平均發病率為20%～40%，嚴重田塊發病率高達70%～80%，甚至造成絕產，每年給煙農造成嚴重的經濟損失[3-5]。目前，防治煙草黑脛病主要通過采用抗病品種、栽培防治、化學防治等措施，其中化學防治是最普遍且實用的方法，但是病菌極易對常規殺菌劑產生抗藥性[6]。因此，為了有效地對黑脛病進行防治，急需篩選出一批安全、高效的殺菌劑進行合理的替代或輪換。

烯酰嗎啉是一種防治疫霉屬高效內吸性羧酸氨基類殺菌劑，對疫霉屬細胞壁具有獨特的作用方式[7]。其防治范圍為卵菌綱病原菌引起的葡萄、黃瓜、白菜霜霉病、番茄、馬鈴薯、辣椒疫病、大豆疫霉根腐病、煙草黑脛病等。近年來，我國大部分煙區已開始使用烯酰嗎啉類殺菌劑對該病害進行防治[8-9]。因此研究煙草黑脛病菌田間菌株對烯酰嗎啉的敏感性及其抗藥性風險，對預測病原菌抗藥群體的發展動態和制定抗性治理策略具有重要的意義。本研究首次分析了新開發煙葉生產區云南省德宏州煙草黑脛病菌對殺菌劑烯酰嗎啉的敏感性，旨在建立煙草黑脛病菌對烯酰嗎啉的敏感性基線，并對德宏州煙草黑脛病菌的抗藥性水平進行監測，以期為田間抗藥性風險的評估和抗性治理提供理論依據，指導煙草安全生產。

1 材料與方法

1.1 煙草黑脛病菌的分離

2013從云南省德宏州種植烤煙品種“紅花大金元”、KRK26、云煙87的10個縣市和種植香料煙的3個縣市不同煙區采集具有黑脛病典型癥狀的病株，于加有抗生素的選擇性黑麥培養基（RSA）上分離純化所得，總共得到68個菌株。所有煙草黑脛病菌菌株黑暗保存于10oC菌種保存柜。經分子鑒定菌株生理小種種類和具體分布見表1。

1.2 供試藥劑

供試的95%烯酰嗎啉原藥用分析純丙酮溶解，配制成10 μg/mL貯液，保存于4oC冰箱中備用。

1.3 烯酰嗎啉敏感基線的建立

分別對不同煙區68個菌株用含藥平板法進行烯酰嗎啉敏感性測定。供試菌株在黑麥培養基上25oC黑暗培養5~7 d后，分別配制含烯酰嗎啉0.0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、4.0 μg/mL的8個不同濃度梯度的V8汁選擇性培養基平板。

用直徑為5 mm的打孔器在相同圓周的菌落邊緣上切取菌餅，將菌餅正面朝下，分別接種到含烯酰嗎啉系列濃度梯度的V8培養基平板上（直徑9 cm），每處理3次重復，置于25oC恒溫培養箱中黑暗培養3 d后，用十字交叉法測量菌落生長直徑。根據菌落直徑計算出生長量，計算烯酰嗎啉各濃度梯度對黑脛病菌菌絲生長抑制的百分率。

通過SPSS13.0軟件，將藥劑濃度轉化成對數（x），抑制率轉化成機率值（y），建立其毒力回歸方程y=bx+a，根據x與y的線性關系計算出相關系數（R）、烯酰嗎啉對黑脛病菌各菌株抑制中濃度EC50值（菌絲生長50%的有效質量濃度），并進行正態分布檢驗。

根據王文橋等[10]的方法進行煙草黑脛病菌抗性水平劃分，將菌株分為抗性菌株（EC50＞10 μg/mL）、中間型菌株（0.1 μg/mL≤EC50≤10 μg/mL）和敏感菌株（EC50＜0.1 μg/mL）。

2 結果

2.1 煙草黑脛病菌對烯酰嗎啉敏感性測定結果

根據相關文獻描述的煙草黑脛病菌對烯酰嗎啉的敏感性基線，選擇含藥0.0、0.5、1.0、2.0、4.0 μg/mL的5個濃度梯度，測定2013年從德宏州分離純化的煙草黑脛病菌菌株對烯酰嗎啉的敏感性。從表2可以看出，從德宏州13個縣市分離獲得的煙草黑脛病菌對烯酰嗎啉的EC50值在0.462 8~2.575 2 μg/mL，平均EC50為1.388 1 μg/mL，表明所測菌株屬于中間型菌株。其中，最敏感菌株來自梁河芒東LD4，EC50值為0.462 8 μg/mL，而抗藥性水平最高的菌株為盈江弄璋的YN3，其EC50值是2.575 2 μg/mL，為菌株LD4的5.56倍。在所測定的68個菌株中，值得注意的是芒市孟戛、遮放，隴川城子、戶撒和盈江弄璋生產區分離到的煙草黑脛病菌，其EC50值相對其他區域稍高，在今后黑脛病防控措施中應采取合理的殺菌劑輪換施用，避免長期使用靶標單一的殺菌劑后因高選擇壓而導致產生高抗藥性菌株。

2.2 煙草黑脛病菌對烯酰嗎啉敏感性分布

在煙草黑脛病菌對藥劑的敏感性變化范圍內，將EC50等分為10個階段，統計出每個階段菌株的個數和頻率，然后以每個階段EC50的中值為橫坐標，頻率為縱坐標，作出頻率分布圖（圖1），結果表明煙草黑脛病菌絲對烯酰嗎啉的敏感性呈單峰曲線，經K-S正態性檢驗，得到Z=0.120 1，P=0.695，表現較好的連續性，表明德宏州13個縣市的68個煙草黑脛病菌株對烯酰嗎啉敏感性的頻率分布符合正態分布。

3 討論

烯酰嗎啉對疫霉卵菌綱的作用特點是首先影響細胞壁分子結構的重新排列，然后干擾病原菌細胞壁聚合體的組裝，從而干擾細胞壁的形成和促使孢子囊壁的分解，使病原菌出現自動死亡，對病菌作用位點單一。病菌易發生突變，產生抗藥性[11]。鑒于烯酰嗎啉在防治疫霉過程中易產生抗藥性菌株，國內外陸續開展了烯酰嗎啉對煙草黑脛病菌的敏感性、抗性水平、生物活性及防治效果方面的相關研究[12-16]。本研究在前人研究的基礎上，對德宏州13個縣市的紅花大金元、KRK26、云煙87和香料煙煙區分離獲得的煙草黑脛病菌的敏感性、抗藥性水平進行了監測，結果顯示德宏州68個煙草黑脛病菌對烯酰嗎啉的EC50值在0.462 8~2.575 2 μg/mL之間，平均為1.388 1 μg/mL，抗藥性水平與戰徊旭等[12]2010年測定的瀘州田間24個煙草黑脛病菌菌株對烯酰嗎啉的EC50（0.110～1.615 μg/mL）值相比，抗藥性水平有所增加；與大理的0.587 8~2.525 4 μg/mL相似[13]，但明顯低于蘇凱等[14]測定的貴州省47個煙草黑脛病菌對烯酰嗎啉的的抗藥性水平（EC50范圍為0.792 6～4.232 7 μg/mL），由此可以判定烯酰嗎啉對德宏州生產區煙草黑脛病菌仍有較好的防控效果，而且烯酰嗎啉與甲霜靈沒有交互抗性。朱桂寧等[15]報道50%烯酰嗎啉可濕性粉劑對煙草黑脛病的防效顯著優于常用藥劑68%精甲霜靈·代森錳鋅水分散粒劑。因此，烯酰嗎啉可成為甲霜靈等苯酰氨類殺菌劑的理想替換藥劑用于云南德宏州煙草黑脛病的防治。目前我國已經檢測到煙草黑脛病菌對烯酰嗎啉的抗性菌株，證實了烯酰嗎啉存在抗性風險[8]。因此應注意在煙草生產中要合理地進行有效藥劑的輪換，不要長期單一施用烯酰嗎啉類殺菌劑，以免對病原菌造成較大的選擇壓力，增加抗藥性風險。

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Sensitivity of Phytophthora deliciosa to Deacylmorpholine in Dehong Prefecture,Yunnan Province

HE Xiao-hui1,XIAO Zhi-xin3,SONG Yu-chuan1,Hu Zhi-ming3, WANG Jie2,LI Yi-qiang2,WANG Feng-long2

(1.Yunnan Fragrance Tobacco Co.,Ltd.,Dehong,Yunnan 678400,China;2.Tobacco Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences,Qingdao,Shandong 266101,China;3.Baoshan Tobacco Co., Yunnan Province,Baoshan,Yunnan 678000,China)

In order to clarify status quo of the sensitivity of tobacco black shank fungi to enoylmorpholine in the newly developed tobacco production area in Dehong Prefecture,Yunnan Province,the susceptibility was studied.68 strains of tobacco black shank were collected from 13 counties and cities of Dehong.The sensitivity and resistance level of the tobacco black shank strains to the alkenoylmorpholine were determined by the rate method.The results showed that the EC50of mycelia growth was 0.462 8~2.575 2 μg/mL,and the average EC50was 1.388 1 μg/mL,which belonged to the middle resistance level.The results also showed that the sensitivity of 68 mycelial growth to myoylmorpholine was in accordance with the normal distribution.EC50of the least sensitive strains were 5.56 times of the most sensitive ones.Deacylmorpholine was still highly active to tobacco black shank in Dehong,but should be used with other fungicides for reasonable rotation.

tobacco black shank pathogen;enolomorphine;drug resistance level

S435.72

A

2095-3704（2017）01-0008-06

10.3969/j.issn.2095-3704.2017.01.002

賀曉輝,肖志新,宋玉川,等.云南省德宏州煙草黑脛病菌對烯酰嗎啉的敏感性[J].生物災害科學,2017,40(1):8-13.

2017-01-21

云南省煙草公司科技支撐項目（2014YN37）

賀曉輝，農藝師，碩士，主要從事晾曬煙生產技術研究及推廣工作，75350507@qq.com。