傾注法與涂布法對蜂蜜中嗜滲酵母計數的比較分析

蘇 華 羅兆飛＊ 覃艷淑 韋梅良 李 娟

（1.廣西出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術中心南寧530021；2.廣西-東盟食品藥品安全檢驗檢測中心南寧530021）

傾注法與涂布法對蜂蜜中嗜滲酵母計數的比較分析

蘇 華1羅兆飛1＊覃艷淑2韋梅良1李 娟1

（1.廣西出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術中心南寧530021；2.廣西-東盟食品藥品安全檢驗檢測中心南寧530021）

本研究旨在建立準確、可靠、穩定的檢測蜂蜜中嗜滲酵母計數的分析方法。分別采用GB 14963-2011中嗜滲酵母計數的涂布方法以及GB 4789.2-2010中菌落總數測定的傾注法，對蜂蜜樣品中的嗜滲酵母計數。并通過以上兩種不同方式對不同溫度下儲藏的蜂蜜樣品進行比較試驗。結果發現同一樣品、同一稀釋度、同樣的培養條件下，使用傾注法測得的嗜滲酵母數量比涂布法更多，差異極顯著（P＜0.01）。對經不同溫度下儲藏的蜂蜜樣品進行嗜滲酵母計數，各濃度條件下傾注法計數結果比涂布法更多，差異極顯著（P＜0.01）。

傾注法涂布法嗜滲酵母計數蜂蜜

GB14963-2011《食品安全國家標準蜂蜜》于2011年10月20日開始實施，它代替了GB14963-2003《蜂蜜衛生標準》以及GB18796-2005《蜂蜜》中的對應指標，并且在微生物限量中增加了嗜滲酵母計數限量[1-2]。在蜂蜜水分含量超過20%時，其存在的嗜滲酵母容易大量繁殖起來，造成蜂蜜酸敗，同時產生的二氧化碳使得盛裝蜂蜜的密閉容器氣壓過大，有發生容器爆破和蜂蜜外泄的風險[3-4]。因此，新的國家標準增加嗜滲酵母計數限量要求，也是進一步提高蜂蜜產品安全性的需要。

目前，針對嗜滲酵母計數的檢測，主要依據GB14963-2011《食品安全國家標準蜂蜜》附錄A規定的方法進行。該方法采用的是常規取樣稀釋后，再進行平板涂布培養，即在每個平板表面接種0.1mL，用無菌L型涂布棒進行涂布，選擇菌落數量在15～150個的平板計數菌落數量[1]。樣品的最高稀釋度只能達到10-2，而GB 14963-2011中嗜滲酵母限量為≤200 CFU/g，一旦在10-2稀釋度平板上長出3～14個菌落，檢測結果為超標結果，而這些數值恰恰不在標準規定“選擇菌落數量在15～150個的平板，計數菌落數量”的要求中，意味著檢測過程偏離標準要求，給檢測機構的檢測及判斷評判帶來較大的風險，也給監督執法部門的公正執法帶來了技術風險。此外，筆者在實際操作過程中，發現該方法有操作繁瑣、同稀釋度培養計數結果平行性差等問題。因此，迫切需要對蜂蜜中嗜滲酵母的計數方法進行進一步的研究。

本研究擬通過先行常用的菌落計數方法--傾注法與GB14963-2011附錄A的涂布法進行比較分析，尋找更加準確、可靠、穩定的檢測方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1樣品來源購自當地蜂蜜加工企業原料基地。

1.1.2 儀器恒溫培養箱、冰箱（2～5℃）、無菌均質袋和均質器、電子天平、無菌試管（18 mm× 180mm）、無菌吸管（1mL，具0.01 mL刻度；10 mL，0.1 mL刻度）、無菌培養皿、無菌L型涂布棒、顯微鏡（10×～100×）。

1.1.3 培養基和試劑30%葡萄糖溶液（pH 6.5± 0.5）、氯硝胺18%甘油（DG18）瓊脂。

1.2 方法

1.2.1 取樣以無菌操作在天平上稱取固體或液體檢樣25 g，加入30%葡萄糖稀釋液225 g，用拍擊式均質袋拍擊2min，制備成1∶10均勻稀釋液。

1.2.2 梯度稀釋用滅菌吸管吸取1∶10稀釋液1 mL，注入含有9 mL 30%葡萄糖稀釋液的試管內，置于漩渦混懸儀上混勻，制備1∶100稀釋液。另取1mL滅菌吸管，按前述操作依次制備10倍遞增稀釋液，每遞增稀釋一次，換用1支1 mL滅菌吸管。

1.2.3 涂布法根據對檢樣污染情況的估計，選擇2～3個連續的適宜稀釋度，接種0.1 mL稀釋液于DG18瓊脂平板上，接著用無菌的L型涂布棒進行瓊脂表面涂布，接種2個平板。同時在1個DG18瓊脂平板表面接種0.1 m L稀釋液作為空白對照。

1.2.4 傾注法按照GB 4789.2-2010《菌落總數測定》[5]，選擇2～3個連續的適宜稀釋度，在每個培養皿接種1 mL，將15～20 mL冷卻至40℃左右的DG18培養基傾注到無菌培養皿中，并轉動平皿使其混合均勻。同時接種1mL稀釋液作為空白對照。

1.2.5 培養接種完成后盡快將全部平板置25℃± 1℃恒溫箱內避光培養，培養時勿翻轉培養皿。為防止出現霉菌過度生長蔓延而掩蓋目標菌落，培養48 h后即開始每日觀察平板上真菌生長情況。培養7 d結束。

1.2.6 菌落計數選擇菌落數量在15～150個的平板，計數菌落數量。如出現霉菌菌落干擾時，不應計數絲狀菌落。

2 結果

2.1 涂布法和傾注法進行蜂蜜中嗜滲酵母計數對同一蜂蜜樣品分別采用涂布法和傾注法檢測嗜滲酵母的數量，選擇菌落數在15～150個的平板進行計數，進行3次平行試驗。結果顯示（見表1），傾注法檢出嗜滲酵母的數量要高于涂布法的檢出量，差異極顯著（P＜0.01），具有統計學意義。圖1為兩種方法檢測蜂蜜中嗜滲酵母數量較典型的平板結果。

2.2 不同溫度儲藏下，蜂蜜中嗜滲酵母數量的變化分別無菌稱取25 g蜂蜜樣品原料于無菌均質袋中，綁好無菌均質袋口，分別置于4℃、25℃、30℃、37℃、42℃環境下儲藏48 h，接著無菌加入225 g 30%葡萄糖溶液，測定蜂蜜中嗜滲酵母的數量。結果見表2、圖2-圖3，儲藏溫度在25～37℃時，嗜滲酵母的增殖速度加快，但是≥42℃后，嗜滲酵母的死亡率急劇加快。而相應溫度下傾注法的嗜滲酵母計數結果比涂布法更多，4℃、25℃、30℃、37℃、42℃下，涂布法與傾注法間存在極顯著差異（P＜0.01）。

表1 涂布法和傾注法檢測蜂蜜中嗜滲酵母的結果

圖1 涂布法和傾注法蜂蜜中嗜滲酵母平板結果

表2 不同溫度儲藏下，涂布法和傾注法蜂蜜中嗜滲酵母檢測結果

圖2 不同溫度儲藏下，涂布法和傾注法檢測蜂蜜中嗜滲酵母數量的變化

3 討論

本試驗通過涂布法和傾注法比較蜂蜜中嗜滲酵母計數結果的差異，得出以下結果。

1）同一樣品、同一稀釋度、同樣的培養條件下，使用傾注法所測得的嗜滲酵母數量比涂布法更多，差異極顯著（P＜0.01）。

2）涂布法操作過程中，由于每個平板上加入的樣品稀釋液體積僅為0.1 mL，吸樣過程使用標準規定1 mL吸管吸取，容易產生吸量誤差；此外，使用涂布棒進行涂布的過程中，涂布棒本身會吸取一定量的樣品稀釋液，且涂布過程由于涂布棒的不均勻吸附效應，造成實際樣品體積小于0.1 m L，且每個平板間存在偏差。上述兩步操作后，引起實際能夠用于培養的樣品稀釋液體積產生了較大的偏差，因而造成涂布法計數結果偏低、且同一稀釋度的兩個平板計數結果較難平行。

3）采用傾注法進行測定的過程，由于使用1 mL吸管吸取1 mL樣品稀釋液，傾注的體積較涂布法多，且更容易移液準確，操作過程造成的樣品稀釋液體積偏差較小，因此，檢測結果更能夠實際反映樣品中嗜滲酵母的數量，結果更具有代表性。

4）通過不同溫度儲藏蜂蜜樣品的比較試驗發現，蜂蜜在不同溫度儲藏下，儲藏溫度在25～37℃時，嗜滲酵母的增殖速度加快，但是≥42℃后，嗜滲酵母的存活率急劇下降，大部分嗜滲酵母不能長時間耐受超過42℃的溫度，這也許是當時制定國標方法考慮使用涂布法的原因，是為了防止傾注的培養基會殺滅樣品中的嗜滲酵母。而本試驗研究結果表明，在使用傾注法操作過程中，培養基溫度雖然在45℃左右，但屬于短時間的高溫作用于樣品，且對嗜滲酵母的殺滅作用還受到其本身對溫度的耐受能力、蜂蜜中的水分和糖類等導熱介質的影響，未產生對嗜滲酵母的殺滅作用。對經不同溫度下儲藏的蜂蜜樣品進行嗜滲酵母計數，各濃度條件下傾注法計數結果比涂布法更多，也更穩定可靠。

圖3 不同溫度儲藏下，涂布法和傾注法蜂蜜中嗜滲酵母平板結果

綜上所述，蜂蜜中嗜滲酵母計數方法的比較結果表明，傾注法比涂布法更加準確、穩定、可靠，更能確保公正地執行GB14963-2011《食品安全國家標準蜂蜜》的限量要求，最大可能減少監督執法檢測過程中對企業產品質量的誤判，同時建議對該標準附錄A的方法進行修訂，以保護各相關方的利益。

[1]中華人民共和國衛生部.GB14963-2011食品安全國家標準-蜂蜜[S].北京:中國標準出版社,2011.

[2]張敬惠.對新的食品安全國家標準-蜂蜜GB14963-2011的解讀[J].蜜蜂雜志,2012(3):36.

[3]魏穎.蜂蜜國家標準探討[J].食品與發酵工業,2015,41(1): 235-239.

[4]尤守智,蔣波.蜂蜜結晶與發酵問題解析[J].中國蜂業, 2008,59(3):30.

[5]中華人民共和國衛生部.GB4789.2-2010食品安全國家標準食品微生物學檢驗菌落總數測定[S].北京:中國標準出版社,2011:2.

Com parative analysis of the osmophilic yeast counting in honey by pouring method and coatingmethod

Su Hua1Luo Zhaofei1*Qin Yanshu2WeiMeiliang1Li Juan1
（1.Guangxi entry-exit inspection and quarantine inspection and quarantine technology center,Nanning 530021; 2.Guangxi-ASEAN food and drug safety inspection and testing center,Nanning 530021）

The aim of this study was to establish an accurate,reliable and stablemethod for the detection of osmophilic yeast in honey. The coatingmethod(GB 14963-2011)and the pouringmethod(GB 4789.2-2010)were used to detect the osmophilic yeast in honey. And using the two kind ofmethods to detect and analyze the osmophilic yeast in honey samples thatwere stored at different temperatures.The results showed that,for the same dilution ratio of the same sample,the number of osmophilic yeast in honey detected by pouringmethod was higher than that detected by coatingmethod in the same culture conditions,the difference was significant(P＜0.01).For the honey samples which were stored under different temperatures,the number of osmophilic yeast in honey detected by pouringmethod was higher than that detected by coatingmethod in the same dilution ratio,and the differencewas significant(P＜0.01).

Pourmethod Coatingmethod Osmophilic yeast Honey

A

1003-4331（2017）02-0009-04

廣西壯族自治區食品藥品監督管理局項目資助（食品檢驗復檢路徑的設計與應用）。

蘇華（1991-），女，碩士，助理工程師，主要從事微生物檢驗工作。E-mail:1932196279@qq.com。

＊通信作者：羅兆飛（1979-），男，碩士，高級獸醫師，主要從事食品檢驗工作。E-mail:975558@qq.com。