甘草酸對博萊霉素誘導的實驗性肺纖維化的干預作用*

李 祎， 李 鑫， 李 琦,3， 蘇程程， 周 欣， 彭守春， 魏路清△， 姬文婕△

(1天津中醫藥大學研究生院，天津300193； 2中國人民武裝警察部隊后勤學院附屬醫院呼吸與重癥醫學科， 3錦州醫科大學武警后勤學院附屬醫院研究生培養基地， 4中國人民武裝警察部隊后勤學院附屬醫院心臟醫院，天津 300162)

·短篇論著·

甘草酸對博萊霉素誘導的實驗性肺纖維化的干預作用*

李 祎1,2， 李 鑫2， 李 琦2,3， 蘇程程2， 周 欣4， 彭守春2， 魏路清2△， 姬文婕2△

(1天津中醫藥大學研究生院，天津300193；2中國人民武裝警察部隊后勤學院附屬醫院呼吸與重癥醫學科，3錦州醫科大學武警后勤學院附屬醫院研究生培養基地，4中國人民武裝警察部隊后勤學院附屬醫院心臟醫院，天津 300162)

目的： 探討甘草酸(GA)對博萊霉素(BLM)誘導的小鼠肺纖維化的干預作用及其可能機制。方法: 將160只雄性C57BL/6J小鼠隨機分為生理鹽水(NS)組、BLM組、BLM+NS組和BLM+GA組。通過口咽氣管吸入法吸入博萊霉素(2.5 mg/kg)建立實驗性肺纖維化模型，BLM+GA組及BLM+NS組每天給予40 mg/kg甘草酸或等體積的生理鹽水灌胃，于術后第3、7、14、21天取材。采用HE染色和Masson染色觀察肺組織病理學變化及纖維化程度，采用流式細胞術檢測循環單核細胞和肺泡巨噬細胞的亞群比例變化，采用RT-qPCR檢測肺組織中轉化生長因子β1(TGF-β1)mRNA的表達水平，采用堿水解法檢測肺組織中羥脯氨酸(HYP)含量。結果：與NS組相比，BLM組和BLM+NS組肺組織的炎癥浸潤及膠原含量明顯增多，實驗性肺纖維化模型制備成功。與BLM+NS組相比：BLM+GA組肺組織的炎癥細胞浸潤及膠原纖維沉積較少；第3、7天的Ly6Chi單核細胞亞群比例和第7、14天肺泡巨噬細胞M2表型比例顯著降低(P<0.01)；肺組織TGF-β1 mRNA表達量和HYP含量顯著降低(P<0.01)。結論：GA可以減輕博萊霉素誘導的小鼠肺組織的炎癥反應和膠原纖維沉積，可能與GA對單核巨噬細胞的表型偏移和調控以及肺組織TGF-β1的表達下調有關。

甘草酸； 肺纖維化； 單核細胞； 肺泡巨噬細胞； 轉化生長因子β1

特發性肺纖維化(idiopathic pulmonary fibrosis，IPF)是一種慢性、進行性、纖維化間質性肺炎，其發病率逐年增加，發病機制尚不明確[1-2]，尚無有效治療手段。甘草酸(glycyrrhizic acid，GA)是中草藥甘草根部提取的重要組成成分之一，呈水溶性[3]。現代研究表明，甘草酸具有抗炎、抗氧化、抗纖維化及提高機體免疫調節能力等作用[4]。本研究使用博萊霉素(bleomycetin，BLM)經口、咽、氣管吸入法制備小鼠肺纖維化模型[5]，采用GA灌胃干預，通過觀察單核巨噬細胞亞群、轉化生長因子β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)、羥脯氨酸(hydroxyproline，HYP)在肺纖維化過程中的變化，探討GA在博萊霉素(bleomycin, BLM)誘導的小鼠肺纖維化進展中的作用。

材 料 和 方 法

1 動物

C57BL/6小鼠，雄性，8周齡，18～20 g，購自中國人民解放軍軍事醫學科學院實驗動物中心，許可證號為SCXK-(軍)2012-0004。小鼠在12 h/12 h光照周期，通風良好、溫度和濕度合格環境中適應性飼養1周。

2 主要試劑

注射用鹽酸博萊霉素(鹽酸博萊霉素A2，NIPPON KAYAKU)；甘草酸、流式抗體(Biolegend)；TRIzol試劑(Invitrogen)；MMLV 反轉錄酶、dNTPs(Promega)；SYBR Green實時定量PCR試劑盒(Roche)；羥脯氨酸測試盒(南京建成生物工程研究所)；異氟烷﹙河北一品制藥有限公司﹚；其余試劑均為國產分析純。所用引物由北京鼎國昌盛生物技術有限公司根據設計合成。

3 主要方法

3.1 動物模型的制備及標本的采集處理 將160只C57BL/6小鼠隨機分為生理鹽水(normal saline, NS)組、BLM組、BLM+NS組及BLM+GA組，每組40只。經2%異氟烷麻醉后，采取經口咽吸入BLM法建立實驗性肺損傷模型，BLM組按2.5 mg/kg劑量給予博萊霉素50 μL，NS組吸入同等體積的無菌生理鹽水，待小鼠完全蘇醒后常規飼養；模型制備完成第1天開始，BLM+GA組按每日40 mg/kg的劑量經灌胃給予GA，BLM+NS組給予等體積的無菌生理鹽水。造模后的第3、7、14、21天將各組小鼠分為灌洗組和非灌洗組，取下頜外周靜脈血行外周血單核細胞亞群流式細胞術檢測。灌洗組行支氣管肺泡灌洗術，取支氣管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid，BALF)，離心后取細胞沉淀進行肺泡巨噬細胞表型流式細胞術檢測，肺組織待檢測羥脯氨酸含量；非灌洗組取左肺行病理學染色，右肺用于提取RNA。

3.2 小鼠肺組織的病理學檢測 小鼠左肺在4 %多聚甲醛中固定24 h后常規石蠟包埋切片(7～8 μm)，進行HE染色和Masson染色，用Nikon i80顯微鏡觀察肺組織炎癥反應和纖維化程度。觀察HE染色圖像的炎癥細胞浸潤程度及肺泡腔變化，采用炎癥評分(inflammation score，IS)表示炎癥反應程度；觀察Masson染色圖像的膠原纖維含量分布變化，采用膠原容積分數(collagen volume fraction，CVF)代表纖維化程度。

3.3 堿水解法檢測羥脯氨酸含量 依照HYP試劑盒說明書配制試劑，堿水解法水解肺組織，調pH值，冷卻后3 500 r/min離心10 min，取上清1 mL，于550 nm波長處測量各管吸光度，計算肺組織中HYP含量。

3.4 流式細胞術檢測小鼠循環單核細胞亞群比例 取小鼠外周循環新鮮EDTA抗凝血30 μL，加入staining buffer/Ly6G/CD11b/Ly6C抗體混勻，并設立陰性對照，室溫避光孵育15 min，加入紅細胞裂解液混勻，再避光孵育10 min，上流式細胞儀檢測。設門策略：首先從SSC/Ly6G散點圖中選定Ly6G-群，再識別SSC/CD11b+細胞，最后按熒光標記劃分Ly6C為Ly6Chi和Ly6Clo。

3.5 流式細胞術檢測小鼠肺泡巨噬細胞亞群比例 取小鼠BALF在4 ℃、300×g條件下離心15 min，紅細胞裂解液重懸細胞沉淀，細胞計數取一定量細胞，離心，棄上清，staining buffer重懸，加入7-AAD/CD64/CD206抗體混勻，室溫孵育15 min，再次離心重懸，上機，流式細胞儀檢測。設門策略：Count/7-AAD直方圖中選定活細胞，FSC/CD64散點圖中選定CD64+細胞，FSC/CD206標記肺泡巨噬細胞為AM1和AM2。

3.6 RT-qPCR檢測小鼠肺組織的 mRNA水平 采用TRIzol提取法提取第7天各組肺組織的總RNA，NanoDrop 2000 C分光光度法測定計數總RNA含量及濃度。首先RNA甲醛變性電泳檢測其完整性，然后行反轉錄為cDNA，再按照OneStep Real-Time PCR試劑盒說明書的標準操作步驟行PCR，β-actin作為內參照，擴增條件為95 ℃ 10 min；75 ℃ 15 s、60 ℃ 1 min，45個循環。依據GenBank數據庫中的目的基因cDNA序列，由北京鼎國昌盛生物技術有限公司合成設計特異性引物序列(表1)，運用2﹣ΔΔCt法計算RT-qPCR結果并分析。

表1 引物序列

4 統計學處理

用GraphPad Prism 6.0統計軟件進行分析，計量資料以均數±標準誤(mean±SEM)表示，組間比較采用t檢驗及單因素方差分析，多重比較應用Tukey’s法。以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 各組小鼠肺組織的病理學變化

光學顯微鏡下觀察，各時點的NS組肺組織結構基本正常，而造模后第3、7天的HE染色圖像中，BLM組可見大量炎癥細胞浸潤和肺泡結構破壞，第7天的炎癥評分明顯高于NS組(P<0.01)；與BLM+NS組比較，BLM+GA組可見炎癥細胞浸潤及肺泡破壞結構情況明顯減輕，差異有統計學意義(P<0.01)。造模后第21天的Masson染色圖像中，BLM組可見纖維結節及大量藍染膠原纖維沉積，膠原容積分數均高于NS組(P<0.01)；BLM+GA組中膠原纖維含量較少，具有統計學差異(P<0.01)，見圖1。

2 各組小鼠羥脯氨酸檢測結果

檢測第21天各組小鼠肺組織中羥脯氨酸含量，BLM組HYP含量明顯高于NS組，差異具有統計學意義(P<0.01)；而BLM+GA組的HYP含量較BLM+NS組明顯降低(P<0.01)，見圖1。

Figure 1.GA reduced BLM-induced alveolar inflammation and pulmonary fibrosis. A: HE staining of lung tissues from each group at 3 d and 7 d (×200), and Masson, trichrome staining at 21 d (×200); B: GA reduced BLM-induced alveolitis, collagen volume fraction and lung HYP content. Mean±SEM. n=5. **P<0.01 vs NS group; ##P<0.01 vs BLM+GA group.

3 各組小鼠不同單核細胞亞群比例變化

循環單核細胞Ly6Chi亞群比例在博萊霉素誘導肺損傷早期升高較多，BLM組及BLM+NS組第3、7天均明顯升高，BLM+GA組與BLM+NS組相比顯著下降，具有統計學意義(P<0.01)。而循環單核細胞Ly6Clo亞群比例變化趨勢與Ly6Chi相反，見圖2。

Figure 2.Temporal dynamics of circulating monocyte subsets after BLM administration. A: the gating strategies for circulating monocyte subsets; B: the representative dynamic profiles of Ly6Chi and Ly6Clo monocytes in different groups; C: the percentage of monocyte subsets detected in different groups. Mean±SEM. n=5. **P<0.01 vs NS group; ##P<0.01 vs BLM+GA group.

4 各組小鼠不同肺泡巨噬細胞亞群比例偏移

與NS組比較，BLM組肺泡巨噬細胞M2型亞群比例第7、14天均明顯升高，BLM+GA組與BLM+NS組相比顯著下降，具有統計學意義(P<0.01)。M1型亞群比例變化趨勢與M2型相反，見圖3。

5 肺組織中TGF-β1 mRNA的表達

與NS組比較，BLM組第7天的TGF-β1相對表達水平顯著升高，差異具有統計學意義(P<0.01)；而BLM+GA組的TGF-β1相對表達水平與BLM+NS組比較明顯降低(P<0.01)，見圖4。

Figure 3.Temporal dynamics of alveolar macrophage (AM) subsets after BLM administration. A: the gating strategies for alveolar macrophage subsets; B: the representative dynamic profiles of AMφM1 and AMφM2 in different groups; C: the percentage of AM subsets detected in different groups. Mean±SEM. n=5. **P<0.01 vs NS group; ##P<0.01 vs BLM+GA group.

討 論

IPF是最常見的一種特發性間質性肺炎，主要病變為彌漫性肺泡炎和肺泡結構紊亂，最終發展為肺纖維化。多發于老年人群，具有較高的死亡率，尚未發現有效的預防與治療手段[2, 6]。甘草酸在體內水解成化學結構類似于甾體激素的甘草次酸，是甾體激素代謝失活酶抑制劑，可以提高糖皮質激素的活性[7]。有研究表明，甘草酸可通過核因子κB(nuclear factor-κB，NF-κB)信號通路，抑制單核細胞趨化蛋白-1(monocyte chemotactic protein 1，MCP-1)、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)等大量促炎因子，調控炎癥和氧化應激相關反應，有效改善肝臟、腎臟等組織的急性炎癥損傷與纖維化發展[8-9]。

在肺纖維化過程中，循環單核細胞可分化為肺泡巨噬細胞，其中抗炎作用的Ly6Chi單核細胞亞群分化為經典活化M1型巨噬細胞，Ly6Clo單核細胞亞群分化為具有選擇性活化，抑制炎癥發展的M2型巨噬細胞。M2型巨噬細胞的偏移引起成纖維細胞的過度增殖，促進纖維化形成[10-11]。本實驗室的前期研究中證明，通過早期降低Ly6Chi單核細胞比例可以減輕肺部炎癥反應的發展，抑制選擇性活化的M2型巨噬細胞比例可以緩解膠原纖維的沉積[12-14]。有研究報道，TGF-β1是肺纖維化過程中最重要最直接的細胞因子，可以促進成纖維細胞增殖、分化為肌成纖維細胞，肌成纖維細胞產生大量基質蛋白成分分泌到細胞外基質中，如α-SMA、膠原蛋白等細胞外基質成分在TGF-β1的刺激下合成增多并沉積，進一步增加TGF-β1誘導肺成纖維細胞分化為肌成纖維細胞，進一步促進肺纖維化的發展[15-16]。

Figure 4.TGF-β1 mRNA level in the lung tissues after GA intervention. Mean±SEM. n=5. **P<0.01 vs NS group; ##P<0.01 vs BLM+GA group.

本實驗研究過程中，經GA干預組的 Ly6Chi單核細胞比例和M2型肺泡巨噬細胞比例均較BLM+NS組明顯降低，減輕了肺組織早期炎癥反應及后期膠原纖維的沉積程度。與本實驗室的前期研究，博萊霉素誘導小鼠肺纖維化的炎癥反應及纖維化進展期中Ly6Chi單核細胞亞群比例和M2型巨噬細胞表型偏移的變化趨勢一致，單核巨噬細胞表型偏移起到了重要的調節作用[14]。GA干預組TGF-β1 mRNA的表達水平呈下調趨勢。因此，GA可能是通過調控單核巨噬細胞表型偏移和調節TGF-β1的表達量，從而減輕炎癥細胞聚集和成纖維細胞增生，進而緩解肺組織纖維化程度。

[1] Raghu G, Collard HR, Egan JJ, et al. An official ATS/ERS/JRS/ALAT statement: idiopathic pulmonary fibrosis: evidence-based guidelines for diagnosis and management[J]. Am J Respir Crit Care Med, 2011, 183(6):788-824.

[2] Bendstrup E, Hyldgaard C, Altraja A, et al. Organisation of diagnosis and treatment of idiopathic pulmonary fibrosis and other interstitial lung diseases in the Nordic countries[J]. Eur Clin Respir J, 2015, 2.

[3] Asl MN, Hosseinzadeh H. Review of pharmacological effects of Glycyrrhiza sp. and its bioactive compounds[J]. Phytother Res, 2008, 22(6):709-724.

[4] 韓瑤聃, 王 彬, 王政雨, 等. 甘草酸藥理作用的研究進展[J]. 中國新藥雜志, 2012, 20(21):2499-2505.

[5] Lakatos HF, Burgess HA, Thatcher TH, et al. Oropharyngeal aspiration of a silica suspension produces a superior model of silicosis in the mouse when compared to intratracheal instillation[J]. Exp Lung Res, 2006, 32(5):181-199.

[6] Baddini-Martinez J, Baldi BG, Costa CH, et al. Update on diagnosis and treatment of idiopathic pulmonary fibrosis[J]. J Bras Pneumol, 2015, 41(5):454-466.

[7] 張明發, 沈雅琴. 甘草酸及其苷元甘草次酸的糖皮質激素樣作用[J]. 現代藥物與臨床, 2011，26(1):33-35.

[8] Zhao H, Liu Z, Shen H, et al. Glycyrrhizic acid pretreatment prevents sepsis-induced acute kidney injury via suppressing inflammation, apoptosis and oxidative stress[J]. Eur J Pharmacol, 2016, 781:92-99.

[9] Zhao H, Zhao M, Wang Y, et al. Glycyrrhizic acid attenuates sepsis-induced acute kidney injury by inhibiting NF-κB signaling pathway[J]. Evid Based Complement Alternat Med, 2016, 2016:8219287.

[10]Gibbons MA, MacKinnon AC, Ramachandran P, et al. Ly6Chi monocytes direct alternatively activated profibrotic macrophage regulation of lung fibrosis[J]. Am J Respir Crit Care Med, 2011, 184(5):569-581.

[11]Murray PJ, Wynn TA. Protective and pathogenic functions of macrophage subsets[J]. Nat Rev Immunol, 2011, 11(11):723-737.

[12]Ji WJ, Ma YQ, Zhou X, et al. Temporal and spatial characterization of mononuclear phagocytes in circulating, lung alveolar and interstitial compartments in a mouse model of bleomycin-induced pulmonary injury[J]. J Immunol Methods, 2014, 403(1-2):7-16.

[13]Xiang GA, Zhang YD, Su CC, et al. Dynamic changes of mononuclear phagocytes in circulating, pulmonary alveolar and interstitial compartments in a mouse model of experimental silicosis[J]. Inhal Toxicol, 2016, 28(9):393-402.

[14]馬永強, 姬文婕, 鄭春秀, 等. 實驗性肺纖維化小鼠循環單核細胞亞群的動態變化及意義[J]. 醫學研究生學報, 2014, 27(9):909-914.

[15]Harris WT, Muhlebach MS, Oster RA, et al. Plasma TGF-beta(1) in pediatric cystic fibrosis: potential biomarker of lung disease and response to therapy[J]. Pediatr Pulmonol, 2011, 46(7):688-695.

[16]Buckley ST, Medina C, Ehrhardt C. Differential susceptibility to epithelial-mesenchymal transition (EMT) of alveolar, bronchial and intestinal epithelial cellsinvitroand the effect of angiotensin II receptor inhibition[J]. Cell Tissue Res, 2010, 342(1):39-51.

(責任編輯： 陳妙玲， 余小慧)

Effect of glycyrrhizic acid on bleomycin-induced pulmonary fibrosis

LI Yi1, 2, LI Xin2, LI Qi2, 3, SU Cheng-cheng2, ZHOU Xin4, PENG Shou-chun2, WEI Lu-qing2, JI Wen-jie2

(1GraduateSchoolofTianjinUniversityofTraditionalChineseMedicine,Tianjin300193,China;2DepartmentofRespiratoryMedicineandIntensiveCareUnit,AffiliatedHospitalofLogisticsUniversityofChinesePeople’sArmedPoliceForce,3PostgraduateTrainingBase,AffiliatedHospitalofLogisticsUniversityofChinesePeople’sArmedPoliceForce,JinzhouMedicalUniversity,4InstituteofCardiovascularDiseaseandHeartCenter,AffiliatedHospitalofLogisticsUniversityofChinesePeople’sArmedPoliceForce,Tianjin300162,China.E-mail:ji_wenjie@hotmail.com;wei_luqing@hotmail.com)

AIM: To investigate the influence of glycyrrhizic acid (GA) on bleomycin (BLM)-induced pulmonary fibrosis. METHODS:C57BL/6 male mice were randomly divided into normal saline (NS) group, BLM group, BLM+NS group and BLM+GA group. The mice were administered with BLM (2.5 mg/kg) via oropharyngeal aspiration. GA (40 mg/kg) or NS was delivered daily via oral gavage after BLM administration. The mice were sacrificed on days 3, 7, 14 and 21. HE staining and Masson’s trichrome staining were used to conduct histopathologic examination. The proportions of different circulatory monocytes subsets and polarization state of the bronchoalveolar lavage fluid (BALF) -derived alveolar macrophages (AM) were measured by flow cytometry. The mRNA expression of transforming growth factor-β1 (TGF-β1) was examined by RT-qPCR. RESULTS: Compared with BLM+NS group, GA significantly alleviated BLM-induced inflammation and collagen levels, and then decreased the proportions of Ly6Chimonocytes on day 3, 7 and AM M2 on day 7, 14. GA effectively down-regulated the mRNA level of TGF-β1 and the content of HYP in the BLM-treated lung tissues. CONCLUSION: GA attenuates the BLM-induced pulmonary inflammation and fibrosis, which may be related to adjusting and controlling a dynamic view of mononuclear phagocyte changes and down-regulation of TGF-β1 in the lung tissues.

Glycyrrhizic acid; Pulmonary fibrosis; Monocytes; Alveolar macrophage; Transforming growth factor-β1

1000- 4718(2017)03- 0528- 06

2016- 09- 05

2016- 11- 03

國家自然科學基金資助項目(No. 81102088；No. 81441101；No. 81570335)；天津市自然科學基金資助項目(No. 15JCZDJC35000)；武警后勤學院附屬醫院重點項目(No. FYZ201510；No. FYZ201605)

△通訊作者 姬文婕 Tel: 022-60578746； E-mail: ji_wenjie@hotmail.com； 魏路清Tel: 022-60578671； E-mail: wei_luqing@hotmail.com

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10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.03.024