肥胖2型糖尿病患者與大鼠胃旁路術后血清總膽汁酸水平的變化*

何偉麗， 翟賀寧， 許戈陽， 楊景哥， 楊 華， 王存川△

(暨南大學 1附屬第一醫院普通外科， 2附屬第一醫院內鏡中心， 3醫學院生理學系, 廣東 廣州 510632)

肥胖2型糖尿病患者與大鼠胃旁路術后血清總膽汁酸水平的變化*

何偉麗1， 翟賀寧2△， 許戈陽3， 楊景哥1， 楊 華1， 王存川1△

(暨南大學1附屬第一醫院普通外科，2附屬第一醫院內鏡中心，3醫學院生理學系, 廣東 廣州 510632)

目的： 觀察胃旁路術對肥胖2型糖尿病患者及肥胖2型糖尿病模型大鼠血清總膽汁酸水平的影響，并探討其分子機制。方法: 收集并分析2011年6月～2016年6月暨南大學附屬第一醫院肥胖2型糖尿病患者共87例術后血糖恢復情況及血清總膽汁酸水平變化數據。動物實驗選用SD大鼠，高脂喂養聯合腹腔注射低劑量鏈脲佐菌素的方法制作肥胖2型糖尿病模型，分為正常對照(普通飼料喂養非手術)組、胃旁路手術組及假手術組，檢測手術前后大鼠血糖及血清總膽汁酸水平，HE染色觀察大鼠胰腺組織病理變化，ELISA方法檢測大鼠肝組織膽固醇7α-羥化酶(CYP7A1)含量，real-time PCR和Western blot分別檢測各組大鼠肝組織CYP7A1和小分子異源二聚體伴侶(SHP) mRNA和蛋白水平。結果: 肥胖2型糖尿病患者及模型大鼠胃旁路術后空腹血糖降低，血清總膽汁酸水平升高，肝組織合成膽汁酸經典途徑的限速酶CYP7A1含量降低，CYP7A1 mRNA和蛋白表達量均減少，肝組織膽汁酸合成的負性調節因子SHP mRNA和蛋白表達量均增加，與假手術組比較差異顯著(P<0.05)。結論: 胃旁路手術后肥胖2型糖尿病患者及模型動物血清總膽汁酸水平升高，且該變化并非因經典途徑合成膽汁酸增多。

胃旁路術； 肥胖； 2型糖尿病； 膽汁酸

隨著人們飲食結構的變化、生活方式的改變，近年來肥胖2型糖尿病患者逐年增多[1]，據統計我國超重或肥胖人口約占總人口的1/4，且超重與肥胖人群2型糖尿病患病率分別為12.8%和18.5%，并且我國2型糖尿病患者中約50%腹型肥胖[2-3]。肥胖2型糖尿病患者藥物治療療效欠佳[4]。而近年來開展的胃旁路手術不但緩解了肥胖問題，患者高血糖狀態也得到長期有效控制，甚至達到治愈標準[5]。臨床研究發現胃旁路手術后血清總膽汁酸水平升高[6]。膽汁酸可通過激活法尼酯X受體(farnesoid X receptor, FXR)和G蛋白偶聯膽汁酸受體1(G protein-coupled bile acid receptor 1, GPBAR1; 又稱TGR5)兩大類受體參與糖代謝調節[7]。研究發現低膽汁酸水平更容易導致肥胖和脂代謝紊亂[8]。膽汁酸作為膽汁的主要成分，是以膽固醇為原料在肝細胞內轉化而成，膽汁酸從頭合成是機體肝組織清除膽固醇的主要方式，肝細胞合成膽汁酸途徑有兩種：經典途徑和替代途徑，經典途徑占體內膽汁酸合成80%以上，該途徑合成的限速酶是膽固醇7α-羥化酶(cholesterol 7α-hydroxylase, CYP7A1)，替代途徑由甾醇27-羥化酶(sterol 27-hydroxylase, CYP27A1)催化，約占總膽汁酸合成的18%。正常情況下人體每天合成膽汁酸約0.2～0.6 g，糞便排出約占體內膽汁酸的5%，并通過腸-肝循環維持動態平衡[9]。并且當血清中膽汁酸升高后，可以通過上調SHP負反饋調節CYP7A1，從而維持血清中膽汁酸平衡[10]。盡管臨床研究發現胃旁路術后血清總膽汁酸水平顯著升高，但是其具體分子機制未明。本研究收集并分析2011年6月～2016年6月暨南大學附屬第一醫院肥胖2型糖尿病患者共87例術后血糖恢復情況及血清總膽汁酸水平變化數據，還通過動物實驗研究肥胖2型糖尿病模型大鼠血清總膽汁酸水平的變化，以探討胃旁路手術后血清總膽汁酸變化的分子調控機制。

材 料 和 方 法

1 臨床研究對象

收集2011年6月～2016年6月期間暨南大學附屬第一醫院收治的胃旁路手術治療肥胖2型糖尿病患者術前及術后半年以上隨訪時血清總膽汁酸及血糖等相關數據。

2 實驗動物和主要試劑

SPF級21日齡SD大鼠，購自中山大學實驗動物中心，許可證號為SCXK(粵)2011-0029，飼養于暨南大學實驗管理中心SPF級動物房，動物飼養許可證號為SCXK(粵)2012-0017。普通飼料參照Research Diets公布的AIN-93M，高脂飼料在此基礎上添加動物脂肪(豬油)和蔗糖作為高脂飼料，蛋白質、碳水化合物和脂肪能量比值為13.9∶45.9∶40.2，飼料由廣州市花都區華東信華實驗動物養殖場加工，許可證號為SCXK(粵)2009-0023，經廣州市華大輻照中心鈷60輻照(輻照劑量25.0 kGy)后送入暨南大學實驗管理中心SPF級動物房喂養大鼠。

CYP7A1抗體及試劑盒購自Millipore;SHP抗體購自Santa Cruz;CYP7A1 ELISA試劑盒購自Cloud-Clone;HRP標記的馬抗山羊IgG購自Vector Laboratories;兔抗小鼠Ⅱ抗購自DAKO;發光液購自Engreen Biosystem;real-time PCR試劑盒購自Roche;BCA蛋白檢測試劑盒購自Thermo。

3 主要方法

3.1 樣本采集及臨床指標測定 所有研究對象記錄術前身高、體重，禁食8 h空腹抽取靜脈血，EDTA-K2抗凝管及促凝管測定空腹血糖和糖化血紅蛋白,全自動生化分析儀檢測血清總膽汁酸水平。

3.2 動物模型制備 參照相關文獻[11-12]及預實驗方法制作肥胖2型糖尿病大鼠模型，將大鼠隨機分為正常對照(normal control，NC)組和高脂飼料組，分別予普通飼料和高脂飼料，飼養8周后，在高脂飼料組稱重篩選出體重超過正常對照組平均體重20%的大鼠，腹腔注射鏈脲佐菌素40 mg/kg，制作肥胖2型糖尿病模型，按照以禁食8 h空腹血糖大于11.2 mmol/L，且隨機血糖大于16.7 mmol/L為成模標準[13]，將成模大鼠隨機分為胃旁路手術(Roux-en-Y gastric bypass，RYGB)組和假手術(sham)組，按照相應干預方法進行干預，分別予術前及術后第10周，大鼠麻醉后眶上靜脈采血，離心分離血清進行生化檢測，取一部分大鼠肝組織及胰腺組織于4%甲醛溶液中固定，進行常規HE染色，另一部分于-80 ℃凍存進行蛋白及mRNA水平檢測。

3.3 各組動物干預方法

3.3.1 NC組 作為正常對照，給予普通飼料，不限制飼料和飲水(檢測相關指標時除外)。

3.3.2 RYGB組 根據大鼠胃解剖的特殊性及參考相關文獻[14]，采取以下方法：在屈氏韌帶遠端15 cm處離斷空腸，近端空腸與遠端空腸下15 cm處行端側吻合；切除胃大彎大部分胃組織使體積剩余約10%，形成管狀胃，保留幽門，幽門口處離斷，近端與上提的遠端空腸吻合，遠端縫合形成盲端。

3.3.3 Sham組 分別在胃大彎側切開2 cm切口并縫合，于幽門口及屈氏韌帶下15 cm處離斷并吻合，延長麻醉及手術時間，使之與同期進行胃旁路手術的大鼠的手術時間一致。

3.4 動物血糖及糖耐量測定 通過Roche卓越型血糖儀檢測大鼠尾靜脈采血血糖，術后第10周檢測大鼠糖耐量，檢測方法為大鼠禁食不禁水過夜，用50%葡萄糖以1 g/kg灌胃，尾靜脈采血分別檢測灌胃前及灌胃后15、30、60、120、180 min時的血糖。

3.5 動物血清及組織處理 術前及術后大鼠眶上靜脈采血，血液凝固后于4 ℃、3 500 r/min離心15 min，分離血清用全自動生化分析儀檢測血清總膽汁酸含量。大鼠處死后，迅速取出部分肝組織并置于液氮中，隨后在-80 ℃保存備用，取出的部分胰腺組織放入4%甲醛溶液固定，并進一步石蠟固定做病理HE染色觀察。

3.6 ELSIA法檢測肝組織CYP7A1含量 嚴格按照CYP7A1試劑盒操作說明進行肝組織CYP7A1檢測及建立標準曲線。簡述步驟如下：精確稱取各組大鼠等量肝組織，進行肝組織勻漿并離心取上清稀釋后檢測，采用酶標儀450 nm波長測量各孔吸光度(A)值，繪制標準曲線最佳方程式，根據樣品濃度及稀釋倍數算得各樣品實際濃度。

3.7 Real-time PCR檢測肝組織中mRNA的水平 使用TRIzol試劑盒分離純化術后第10周大鼠肝組織的總RNA，分光光度法測定并計算提取的總RNA含量及濃度。參照One Step real-time PCR試劑盒推薦的標準操作步驟，在Chromo 4實時熒光定量PCR儀上進行PCR，內參照使用β-actin，擴增條件為95℃ 10 min；95℃ 10 s，60℃ 30 s，共設置40個循環。根據GenBank數據庫中的目的基因cDNA序列，使用Primer Premier 6.0軟件設計特異性引物，由上海捷瑞生物工程有限公司合成，β-actin的上游引物序列為5’-CTGAACCCTAAGGCCAACCG-3’，下游引物序列為5’-GACCAGAGGCATACAGGGACAA-3’；SHP的上游引物序列為5’-GAGCCAGGAAGAAACAGGAACAAG-3’，下游引物序列為5’-CGGGGCTTAGAAGTGTGTAGAGAA-3’；CYP7A1的上游引物序列為5’-CGAAGGCATTTGGACACAGAAG-3’，下游引物序列為5’-ACCCAGGCATTGCTCTTTGATT-3’。以β-actin作為內參照，記錄各孔Ct值，取3孔平均值作為最終結果，并采用2-ΔΔCt法進行分析。

3.8 Western blot檢測肝組織CYP7A1及SHP蛋白表達情況 取100 mg大鼠肝組織，提取各組蛋白，BCA法蛋白定量。定量后調整各蛋白濃度，加上樣緩沖液調整濃度為5 g/L后混勻、煮沸變性，約5～10 min。使用12%分離膠分離蛋白，再轉移到PVDF膜上，室溫下用5%脫脂奶粉封閉1～2 h，相應Ⅰ抗4 ℃孵育過夜，Ⅱ抗室溫孵育1 h，洗膜3次后加入ECL發光液，進行曝光并記錄條帶的吸光度做定量分析。

4 統計學處理

使用SPSS 19.0軟件進行數據分析，計量資料以均數±標準差(mean±SD)表示，口服糖耐量數據以曲線下面積進行統計分析，多組間比較用單因素方差分析，各組均數間兩兩比較采用SNK-q檢驗，重復測量的數據比較采用重復測量的方差分析，以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 臨床肥胖2型糖尿病患者血清總膽汁酸術前與術后變化及相關數據

收集2011年6月～2016年6月期間暨南大學附屬第一醫院收治的胃旁路手術治療肥胖2型糖尿病患者，排除有數據缺失的病例后共87例，其中男性55例，女性32例，經進一步統計，平均年齡為(35.1±10.2) 歲，收集術前及術后半年以后隨訪時血糖、糖化血紅蛋白、體重及血清總膽汁酸的數據并統計，結果表明胃旁路手術具有較好的減輕體重和控制血糖效果，并且術后半年以上的血清總膽汁酸水平明顯升高，見表1。

表1 臨床肥胖2型糖尿病患者手術前后血糖、糖化血紅蛋白、身體質量指數及膽汁酸的變化

*P<0.05vsbefore RYGB.

2 大鼠胃旁路手術前后體重變化

NC組作為普通飼料喂養對照組僅作制作模型時的參照及各種因素干預后除體重外其它指標的對照，術前RYGB組體重與sham組比較無統計學差異，均高于NC組(P<0.05)。Sham組和RYGB組第4、10周體重均比術前下降，第10周時顯著低于NC組(P<0.05)，RYGB組比sham組體重下降更明顯，差異有統計學意義(P<0.05)，提示胃旁路手術能夠明顯降低大鼠體重，見表2。

表2 大鼠胃旁路手術前后體重

*P<0.05vsNC group;#P<0.05vssham group.

3 大鼠胃旁路手術前后空腹血糖變化

與sham組比較，胃旁路術后第4、10周RYGB組大鼠空腹血糖水平明顯降低，差異有統計學意義(P<0.05)，提示胃旁路手術具有治療2型糖尿病的作用，見圖1。

Figure 1.Fasting blood glucose in rats before and after gastric bypass surgery. Mean±SD. n=8～9. *P<0.05 vs NC group; #P<0.05 vs sham group.

4 大鼠胃旁路手術后糖耐量變化

空腹糖耐量檢測顯示，RYGB組胃旁路術后第10周大鼠糖耐量曲線接近NC組，曲線下面積明顯低于sham組(P<0.05)，提示胃旁路手術具有確切的長期改善高血糖狀態的作用，見圖2。

5 大鼠胃旁路手術后胰腺組織病理學改變

術后第10周胰腺組織病理HE染色，與NC組比較，sham組胰島萎縮，β細胞凋亡，存留β細胞肥大代償，部分顆粒脫失，脂質沉積；RYGB組胰島細胞增生，向外分泌部沿伸，提示胃旁路手術可以促進胰島細胞的增殖，抑制其凋亡，見圖3。

6 大鼠胃旁路手術前后血清總膽汁酸水平變化

與NC組比較，術前RYGB組及sham組血清總膽汁酸水平稍高;術前RYGB組與sham組比較差異無統計學意義;術后第10周，RYGB組較sham組顯著升高，差異有統計學意義(P<0.05)，見表3。

Figure 2.Glucose tolerance in rats after gastric bypass surgery. AUC: area under the curve. Mean±SD. n=8～9. *P<0.05 vs NC group; #P<0.05 vs sham group.

Figure 3.Pathological changes of pancreatic tissue in rats.

表3 大鼠胃旁路手術前后血清總膽汁酸水平

*P<0.05vsNC group;#P<0.05vssham group.

7 雙抗夾心ELISA法檢測大鼠胃旁路手術后肝組織CYP7A1含量

雙抗夾心ELISA法檢測結果顯示，術后第10周RYGB組與sham組比較肝組織膽汁酸合成限速酶CYP7A1含量明顯降低。RYGB術后膽汁酸合成應該是減少，然而血清膽汁酸水平卻較高，提示有其它途徑導致胃旁路術后血膽汁酸水平升高，見表4。

表4 大鼠胃旁路手術后肝組織CYP7A1含量

*P<0.05vsNC group;#P<0.05vssham group.

8 大鼠胃旁路手術后肝組織CYP7A1和SHP mRNA相對水平

Real-time PCR結果顯示，RYGB組CYP7A1 mRNA水平較sham組顯著降低；RYGB組SHP mRNA水平較sham組顯著增高(P<0.05)，提示胃旁路手術后肝組織膽汁酸合成經典途徑的限速酶CYP7A1受抑制，且負反饋調節因子SHP激活，見圖4。

Figure 4.The relative expression levels of CYP7A1 mRNA and SHP mRNA in rat liver tissue after gastric bypass surgery. Mean±SD. n=8～9. *P<0.05 vs NC group; #P<0.05 vs sham group.

9 大鼠胃旁路手術后肝組織CYP7A1和SHP蛋白水平

Western blot結果顯示，RYGB組術后肝組織CYP7A1蛋白表達低于sham組，差異有統計學意義，見圖5； RYGB組術后肝組織SHP蛋白表達高于sham組，差異有統計學意義(P<0.05)，見圖6，進一步提示胃旁路手術后肝組織膽汁酸合成經典途徑的限速酶CYP7A1受抑制，且負反饋調節因子SHP激活。

Figure 5.The expression level of CYP7A1 protein in rat liver tissue after gastric bypass surgery. Mean±SD. n=8～9. *P<0.05 vs NC group; #P<0.05 vs sham group.

Figure 6.The expression level of SHP protein in rat liver tissue after gastric bypass surgery. Mean±SD. n=8～9. *P<0.05 vs NC group; #P<0.05 vs sham group.

討 論

大量研究表明，胃旁路手術后肥胖2型糖尿病患者的體重和高血糖狀態持續改善，胃旁路術后食物攝入量減少，體重明顯降低，高血糖狀態逐步改善，多數患者可以停用抗血糖藥物，長期療效確切[15]。我們的動物實驗顯示術后第10周大鼠體重明顯降低，空腹血糖及口服糖耐量接近或達到正常水平，提供了進一步的依據。在臨床胃旁路手術后，血清總膽汁酸水平明顯升高是近些年關注的熱點[16-17]，我們的臨床回顧性研究也證實了這種結果。良好的動物模型在疾病的研究中具有重要作用，本課題研究采用聯合高脂飼料和低劑量鏈脲佐菌素的方法，制作肥胖2型糖尿病動物模型，該方法造價便宜，可操作性強，一定程度上符合人類糖尿病的生化和病理特征，最為常用[18]。

從本臨床病例回顧研究表明，胃旁路手術后空腹血糖和糖化血紅蛋白較術前明顯降低，指標多恢復正常范圍，提示胃旁路手術具有較好的減輕體重和緩解2型糖尿病的作用。動物實驗研究也表明，胃旁路手術后大鼠體重明顯降低，低于sham組和NC組，RYGB組術后胰腺組織病理結果表明胰島細胞增殖，向外分泌部沿伸，改變了向萎縮、凋亡的方向發展，促進胰島素的分泌，進而調控空腹血糖及糖耐量，起到良好的治療2型糖尿病的效果，與臨床結論一致[19]。

CYP7A1作為膽汁酸合成的經典途徑的限速酶，在膽固醇的穩態和膽汁酸的平衡中起重要作用，其基因表達受反饋和負反饋機制以及復雜的轉錄級聯網絡的嚴格控制，膽固醇可以通過反饋調節直接激活CYP7A1的表達，促進膽固醇向膽汁酸的轉化；膽汁酸的負反饋調節有多條通路，主要是通過激活FXR，誘導靶基因SHP表達，SHP與LRH-1和LXRα結合從而抑制CYP7A1的表達[9]。SHP作為FXR的靶基因，是孤兒受體超家族的一員，但與其它核受體相比缺少DNA結合結構域，因此也是一個非典型的核受體，SHP在FXR負反饋調節CYP7A1中起到重要的中介作用[10]。

本研究中臨床病例及模型大鼠胃旁路術后血總膽汁酸水平顯著升高，大鼠肝組織SHP mRNA水平升高，蛋白表達增加，提示膽汁酸負反饋通路可能被激活，抑制了膽汁酸合成的限速酶CYP7A1的表達，本研究結果也顯示肝組織CYP7A1活性下降，mRNA水平降低，蛋白表達下降，提示正是這種負反饋機制被激活的結果，膽汁酸的經典合成途徑受抑制，但是血中總膽汁酸水平卻顯著升高，有可能因為胃旁路手術改變了膽汁酸的腸-肝循環，重吸收增加，排泄持續減少有關[20]。由于胃旁路手術即在保留小部分胃底及胃體小彎的方法制作胃小囊，胃小囊與空腸以Roux-en-Y形式吻合，大部分胃、十二指腸全部和近端空腸曠置，食物繞過該部分直接在下段空腸與排入腸道的膽汁匯合又迅速到達回腸，膽汁與食糜混合尚未充分即被大量重吸收，從而增加了血膽汁酸水平[21]，然而這種膽汁酸水平的增加從臨床數據來看并不是不受限制的完全病理狀態的增加，是在逐漸增加到一定范圍后通過負反饋作用對經典合成途徑起到一定抑制，從而使人體總膽汁酸水平達到一個相對高的水平，而具體機制有待進一步研究。血中總膽汁酸水平較高更有利于內源性配體激活膽汁酸相關核受體和膜受體家族相關信號通路，進而調節體內糖脂代謝[22]，維持糖脂代謝平衡。本研究中sham組大鼠血清總膽汁酸含量較NC組高，有統計學意義，是由于肥胖2型糖尿病導致肝臟脂質沉積，脂肪和膽固醇沉積肝細胞促進了膽固醇向膽汁酸轉化的調節，并且已有實驗和臨床數據證實[23-24]。但本研究中胃旁路術后血清膽汁酸增加與其比較更明顯，且具體機制不同。

我們的這一研究進一步證實了臨床肥胖2型糖尿病患者術后半年以上及肥胖2型糖尿病大鼠術后血清總膽汁酸水平升高，其分子機制并非膽汁酸的經典合成途徑增加，而是有其它途徑，比如有可能膽汁酸的腸-肝循環過程中重吸收增加等最終導致血清總膽汁酸水平增加。我們這一發現為研究膽汁酸在胃旁路手術治療肥胖合并糖尿病中作用提供了依據，其分子機制有待進一步深入研究。

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(責任編輯： 盧 萍， 羅 森)

Effects of gastric bypass surgery on serum total bile acid in obese diabetic patients and rats

HE Wei-li1, ZHAI He-ning2, XU Ge-yang3, YANG Jing-ge1, YANG Hua1, WANG Cun-chuan1

(1DepartmentofGeneralSurgery，TheFirstAffiliatedHospital,2DepartmentofEndoscopyCenter,TheFirstAffiliatedHospital,3DepartmentofPhysiology,SchoolofMedicine,JinanUniversity,Guangzhou510632,China.E-mail:yzhn@foxmail.com;twcc@jnu.edu.cn)

AIM: To observe the effects of gastric bypass surgery on the levels of serum total bile acid in the obese diabetic patients and rats. METHODS: Anthropometric data of obese diabetic patients with gastric bypass surgery from June 2011 to June 2016 were collected in the First Affiliated Hospital of Jinan University. Obese diabetic animal mo-del was established in SD rats by high-fat diet feeding combined with intraperitoneal injection of low-dose streptozocin. Gastric bypass surgery or sham operation was performed on the rats with successful modeling. The levels of serum total bile acid were measured by a Hitachi automatic biochemistry analyzer， and the content of hepatic cholesterol 7α-hydroxylase (CYP7A1) was detected by ELISA. The expression of hepatic CYP7A1 and small heterodimer partner (SHP) at mRNA and protein levels was determined by real-time PCR and Western blot, respectively. RESULTS: The serum levels of total bile acid were significantly increased in postoperative obese diabetic patients and rats as compared with control groups. Gastric bypass surgery inhibited rat hepatic CYP7A1 content, mRNA level and protein level, but stimulated hepatic SHP expression. CONCLUSION: Total serum bile acid increases in both patients and rats after gastric bypass surgery by non-typical bile acid synthesis pathway.

Gastric bypass; Obesity; Type 2 diabetes mellitus; Bile acid

1000- 4718(2017)03- 0462- 07

2017- 01- 05

2017- 01- 18

國家自然科學基金資助項目(No. 31401001)；廣東省自然科學基金資助項目(No. 2016A030310086);廣州市科技計劃(No. 2014Y2-00097); 中央高校基本科研業務費專項資金資助項目(No. 21615333)；暨南大學第一臨床醫學院科研培育專項基金資助項目(No. 2013104)

△通訊作者 翟賀寧 Tel： 020-38688447； E-mail： yzhn@foxmail.com； 王存川 Tel： 020-38688685； E-mail： twcc@jnu.edu.cn

R363; R587.1

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.03.013