不同產(chǎn)地炮天雄的質(zhì)量考察與比較

覃 軍，鄧廣海，陳艷紅，龔又明

（廣州中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院藥學(xué)部，廣東 廣州 510120）

·實(shí)驗(yàn)研究·

不同產(chǎn)地炮天雄的質(zhì)量考察與比較

覃 軍，鄧廣海，陳艷紅，龔又明

（廣州中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院藥學(xué)部，廣東 廣州 510120）

目的考察不同產(chǎn)地炮天雄的質(zhì)量，測(cè)定雙酯型生物堿和單酯型生物堿的差異。方法色譜柱采用Kromasil100-5-C18柱（250mm× 4．6mm，5 m），以乙腈-四氫呋喃(25∶15)為流動(dòng)相A，以0．1mol／L醋酸銨溶液為流動(dòng)相B，進(jìn)行梯度洗脫，流速為1m L／min，檢測(cè)波長(zhǎng)為235 nm，柱溫為30℃。結(jié)果 四川、湖北的炮天雄單酯型生物堿含量最高，毒性成分較大的雙酯型生物堿則以四川、香港的為最低。結(jié)論 不同產(chǎn)地的炮天雄受當(dāng)?shù)卦幉牡挠绊懀芘谥平?jīng)驗(yàn)、工藝的影響，應(yīng)盡快制訂炮天雄相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)。

炮天雄；酯型生物堿；產(chǎn)地；高效液相色譜法

天雄來(lái)源于毛茛科烏頭 Acontum carmichaeliDebx．個(gè)大形長(zhǎng)的附子，是烏頭類(lèi)中藥的一種[1]，主產(chǎn)于廣東、廣西、四川、湖南、湖北等。其性味辛、熱，歸腎經(jīng)，有大毒，具祛風(fēng)散寒、益火補(bǔ)陽(yáng)的功效，用于治療關(guān)節(jié)痛、中風(fēng)、四肢拘攣、風(fēng)濕寒痹、心腹冷痛等[2]。附子在《神農(nóng)本草經(jīng)》中列為下品，藥典中也明確標(biāo)注有毒，但臨床應(yīng)用甚廣，因其同時(shí)還有顯著的藥理作用[3-4]，是“為最有用亦最難用”之藥[5]。炮天雄是嶺南特色炮制品種，亦是嶺南地區(qū)常用的附子飲片之一，東南亞、港臺(tái)等地區(qū)的人民通常將嶺南炮天雄作為滋補(bǔ)食療的佳品。炮天雄的基本炮制過(guò)程雖與炮附片一致，但兩者在砂燙程度上不一樣。炮天雄嶺南特色炮制工藝難度較高，各地區(qū)現(xiàn)主要依靠工人經(jīng)驗(yàn)來(lái)確定炮制浸漂、蒸制、炒制時(shí)間與火候的程度，造成不同地區(qū)炮天雄在質(zhì)量上有所差異。本研究中就不同地區(qū)炮天雄的含量差異進(jìn)行測(cè)定，為保證中藥材成品的質(zhì)量及毒性的可控性及建立炮天雄的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供參考。

1 儀器與試藥

1．1 儀器

Agilent1260型高效液相色譜儀(美國(guó)Agilent公司；BS110S型天平（萬(wàn)分之一，賽多利斯公司），BS200SWEI型天平（千分之一，賽多利斯公司），XP26型天平（百萬(wàn)分之一，Mettler Toledo）；HWS28型恒溫水浴鍋（上海一恒科技有限公司）；RV10型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（德國(guó)IKA公司）；SHZ-DⅢ型循環(huán)水式真空泵。

1．2 試藥

苯甲酰新烏頭原堿（批號(hào)為111795-201102，含量以 97．0%計(jì)），苯甲酰烏頭原堿（批號(hào)為 111794-201102，含量以96．5%計(jì)），苯甲酰次烏頭原堿（批號(hào)為111796-201002，含量以97．3%計(jì)），新烏頭堿（批號(hào)為110799-201106，含量以98．5%計(jì)），次烏頭堿（批號(hào)為110798-201106，含量以 99．8%計(jì)），烏頭堿（批號(hào)為110720-201111，含量以98．8%計(jì)），均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院。炮天雄樣品采自廣東廣州、湖北竹山、陜西興平縣、廣東韶關(guān)、四川安縣、香港、云南麗江，取樣大小均勻，經(jīng)鑒定均為正品。

2 方法

2．1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

色譜柱：Kromasil100-5-C18柱（250mm×4．6mm，5μm）；流動(dòng)相：乙腈-四氫呋喃(25∶15)為流動(dòng)相A，0．1mol／L醋酸銨溶液(每1 000m L加冰醋酸0．5 mL)為流動(dòng)相B，進(jìn)行梯度洗脫，見(jiàn)表1；流速：1m L／min；檢測(cè)波長(zhǎng)：235 nm；柱溫：30℃；進(jìn)樣量：10μL。在此色譜條件下的色譜圖見(jiàn)圖1。

表1 流動(dòng)相梯度洗脫程序

圖1 高效液相色譜圖

2．2 溶液制備

對(duì)照品溶液：取單酯型生物堿（苯甲酰新烏頭原堿對(duì)照品、苯甲酰烏頭原堿對(duì)照品、苯甲酰次烏頭原堿）對(duì)照品及雙酯型生物堿（新烏頭原堿對(duì)照品、烏頭原堿對(duì)照品、次烏頭原堿）對(duì)照品適量，精密稱(chēng)定，加異丙醇-二氯甲烷（1∶1）混合溶液制成每1mL各含25μg的混合溶液，即得。

供試品溶液[1]：取本品粉末（過(guò)3號(hào)篩）約2 g，精密稱(chēng)定，置具塞錐形瓶中，加氨試液3m L，精密加入異丙醇-乙酸乙酯（1∶1）混合溶液50 m L，稱(chēng)定質(zhì)量，超聲處理（功率 300 W，頻率 40 kHz，水溫在 25℃以下）30 min，放冷，再稱(chēng)定質(zhì)量，用異丙醇-乙酸乙酯（1∶1）混合溶液補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過(guò)。精密量取續(xù)濾液25 mL，40℃以下減壓回收溶劑至干，殘?jiān)芗尤氘惐?二氯甲烷（1∶1）混合溶液3m L溶解，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2．3 方法學(xué)考察

線性關(guān)系考察：取單、雙酯型生物堿對(duì)照品溶液適量，按擬定色譜條件分別將0．5，1，2，4，8，12，20μL注入液相色譜儀，測(cè)定，記錄峰面積，以峰面積積分值(A)與對(duì)照品溶液含量(X)進(jìn)行線性回歸，結(jié)果詳見(jiàn)表2。

精密度試驗(yàn)：精密吸取供試品溶液10μL，注入液相色譜儀，重復(fù)進(jìn)樣6次。結(jié)果苯甲酰新烏頭原堿、苯甲酰烏頭原堿、苯甲酰次烏頭原堿的 RSD分別為1．97%，1．92%，1．94%(n＝6)，表明儀器精密度良好。詳見(jiàn)表3。

表2 線性關(guān)系考察結(jié)果(n＝7)

表3 單酯型生物堿精密度試驗(yàn)結(jié)果(n＝6)

穩(wěn)定性試驗(yàn)：取同一供試品溶液，按擬訂色譜條件，分別于0，2，4，6，12，24 h時(shí)進(jìn)樣10μL。結(jié)果苯甲酰新烏頭原堿、苯甲酰烏頭原堿、苯甲酰次烏頭原堿的 RSD分別為0．65%，0．95%，1．71%(n＝6)，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。詳見(jiàn)表4。

重復(fù)性試驗(yàn)：取同一批樣品6份，按2．2項(xiàng)下方法平行制備供試品溶液6份。結(jié)果峰面積積分值苯甲酰新烏頭原堿的 RSD為0．41%(n＝6)，苯甲酰烏頭原堿的RSD為1．68%(n＝6)，苯甲酰次烏頭原堿的 RSD為0．36%(n＝6)，表明方法重復(fù)性良好。詳見(jiàn)表5。

加樣回收試驗(yàn)：取己知含量的樣品約1．0 g，共6份，精密稱(chēng)定，精密加入所測(cè)成分約等量的對(duì)照品，照含量測(cè)定項(xiàng)下操作，計(jì)算加樣回收率。結(jié)果見(jiàn)表6。

表4 穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果(n＝6)

表5 重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果(n＝6)

2．4 樣品含量測(cè)定

取炮天雄粉末（過(guò)3號(hào)篩）約2 g，按2．2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按擬訂色譜條件，分別測(cè)定各產(chǎn)地樣品中酯型生物堿的含量，計(jì)算干燥品含單、雙酯型生物堿的總量。結(jié)果見(jiàn)表7。

表6 加樣回收試驗(yàn)結(jié)果(n＝6)

表7 各產(chǎn)地樣品含量測(cè)定結(jié)果

3 討論

炮天雄不單是嶺南地區(qū)的習(xí)用中藥，在民間的傳統(tǒng)食用歷史也較為悠久，是滋補(bǔ)食療佳品，具有補(bǔ)腎助陽(yáng)的作用。其中，天雄散主要治療男性病、不孕癥、男性尿頻等[6-9]。因中藥的同名異物、異物同名的問(wèn)題，藥典中尚未在附子一項(xiàng)下收載天雄，僅收錄了常用幾種炮制品，天雄商品和飲片規(guī)格不為人所熟悉，但港澳、東南亞地區(qū)仍習(xí)慣沿用“炮天雄”入方治療元陽(yáng)素虛、腎虧陽(yáng)虛證[10]。

附子等烏頭類(lèi)的中毒反應(yīng)在臨床并不少見(jiàn)[11-12]，而炮天雄作為附子制品的一種，無(wú)論是少數(shù)民族藥或地方習(xí)用品，只要臨床上有使用的需要?jiǎng)t其炮制規(guī)范和質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)亟待規(guī)范[13]。目前，烏頭堿類(lèi)藥物的單酯型生物堿、雙酯型生物堿及總生物堿的含量測(cè)定方法主要有高效液相色譜法、反相高效液相色譜法、液-質(zhì)聯(lián)用法、雙波長(zhǎng)薄層掃描法、高效毛細(xì)管電泳法和分光光度法[14-15]，本研究中考察了炮天雄烏頭類(lèi)生物堿的特性，采用高效液相色譜法，操作簡(jiǎn)便，精確度高，重復(fù)性好。

單酯型生物堿含量由高到低為四川安縣、湖北竹山、廣東廣州、陜西興平、香港、廣東韶關(guān)、云南麗江。雙酯型生物堿限量由低到高為四川安縣、香港、湖北竹山、廣東廣州、廣東韶關(guān)、陜西興平、云南麗江。這與炮天雄在炮制過(guò)程中受到環(huán)境、工藝條件等因素影響而產(chǎn)生質(zhì)量差異有關(guān)，炮天雄的原藥附子在四川、湖北種植歷史悠久，質(zhì)量好。本研究結(jié)果顯示，四川、湖北的炮制品單酯型生物堿含量最高。不同地區(qū)的炮制工藝不同，也是導(dǎo)致炮天雄質(zhì)量差異的主要原因。炮天雄主要經(jīng)過(guò)切制、悶潤(rùn)姜汁、蒸煮、熱砂拌炒等加工過(guò)程[16]，不同地區(qū)炮制人員經(jīng)驗(yàn)的差異導(dǎo)致其質(zhì)量有差異。

綜上所述，不同產(chǎn)地炮天雄的質(zhì)量不僅體現(xiàn)在炮制工藝上，更體現(xiàn)在炮制質(zhì)量的差異上。苯甲酰烏頭堿毒性約為烏頭堿的1／200，苯甲酰烏頭原堿的毒性僅為烏頭堿的1／2 000，不僅是附子的毒性成分，同時(shí)也是藥效成分。相對(duì)于炮附子、炮天雄的雙酯型生物堿成分含量更低，而毒性較弱的單酯型生物堿含量更高，故有效成分含量比重更高。炮附片的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)不適用炮天雄，建議盡快制訂炮天雄的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。

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Quality Com parison of Pao Tianxiong from Different Producing Places

Qin Jun,Deng Guanghai,Chen Yanhong,Gong Youming
(Pharmaceutical Department,The Second Affiliated Hospital of Guangzhou University of Chinese Medicine,Guangzhou,Guangdong,China 510120)

Ob jective To study the quality of Pao Tianxiong from different producing places and to determine the difference between mono and di-ester alkaloids．M ethods Kromasil 100-5-C18column(250 mm×4．6 mm,5μm)was used;the acetonitrile-tetrahydrofuran(25∶15)was used as mobile phase A with 0．1 mol／L ammonium acetate solution as mobile phase B,gradient．The flow rate was 1 mL／min;detection wavelength is 235 nm;column temperature is 30℃．Results Pao Tianxiong from Sichuan and Hubei had the highest amount of mono-ester alkaloid content;Pao Tianxiong from Sichuan and Hong Kong had the lowest amount of di-ester alkaloids which were toxic．Conclusion Pao Tianxiong produced in different places are affected by local indigenous herbs;more importantly,it is affected by the processing experience and technology．Therefore,we need to make relevant standards for Pao Tianxiong as soon as possible．

Pao Tianxiong;ester alkaloids;place of origin;HPLC

R282.5；R284.1

A

1006-4931(2017)03-0011-04

2016-09-07；

2016-10-17)

10．3969／j．issn．1006-4931．2017．03．004

廣東省科技計(jì)劃項(xiàng)目[2016A040403104]。

覃軍，男，副主任中藥師，研究方向?yàn)橹兴庯嬈|(zhì)量管理與控制，（電話）020-81887233（電子信箱）qinkum＠163．com。

龔又明，男，碩士研究生，主管中藥師，研究方向?yàn)橹兴庂|(zhì)量監(jiān)控與中藥炮制，（電子信箱）4896318＠qq．com。