驗證活細胞膜選擇透過性的簡易方法

崔榮榮 何奕騉 郭琪琦

（1首都師范大學生命科學學院 北京 100048 2深圳市第二實驗學校 廣東深圳 518021）

細胞膜又稱細胞質膜，是指圍繞在細胞最外層，主要由脂類和蛋白質組成的一層極薄的膜。細胞膜不僅是細胞結構的邊界，使細胞具有一個相對穩定的內部環境，同時在細胞與環境進行物質運輸、能量轉換，以及信息傳遞過程中也起著決定性的作用。細胞膜是細胞與周圍環境進行選擇性物質交換的屏障與通路[1］。可以說認識整個細胞乃至生命體從細胞膜開始。

細胞膜是選擇透過性膜，大分子物質不能通過活細胞膜。細胞膜控制物質進出這一重要功能，在高中生物學概念體系中非常關鍵，有利于學生理解細胞膜的選擇透過性這一重要概念，同時幫助學生理解細胞膜是系統的邊界。中學教師和學生對于臺盼藍試劑有所耳聞，“臺盼藍拒染實驗”也多次作為高中試題的考查材料，但具體實驗過程和實驗結果并未見相關報道。同時實驗中需要運用活細胞系，由于一般學校沒有細胞培養室，單個的動物活細胞不便于培養和獲取。筆者運用高校資源，根據實驗目的改進了大學教材中 “臺盼藍拒染實驗”，通過實證研究設計并記錄實驗過程，展示具體直觀的過程與結果，填補了高中教材中大分子物質不能隨意進出細胞膜的實驗空缺，為細胞膜控制物質尤其是大分子物質進出提供了實驗依據，驗證了活細胞膜具有控制物質進出細胞的功能，為高中教師開展教學提供教學參考資料。

1 實驗材料

1.1 主要試劑 濃度0.4%臺盼藍50 mL。臺盼藍（Trypan Blue）或稱臺盼蘭、錐蟲藍、曲利苯藍。分子式：C34H24N6O14S4Na4，分子量:960.82，屬于大分子物質，無法隨意進出活細胞膜。因此它可以作為細胞活性染料，常用于檢測細胞膜的完整性[3］。一般細胞膜完整性發生改變，會導致細胞死亡。因此臺盼藍也常用于檢測細胞是否存活。活細胞不會被染成藍色，而死細胞會被染成淡藍色。冰甲醇：－20℃預冷的濃度100%的甲醇，常被用作細胞固定液。通過結合蛋白質形成沉淀，使得蛋白質發生不可逆轉變性，從而改變細胞膜的通透性，同時固定保持細胞形態，便于染色觀察。由于蒸餾水不能調節鹽平衡，會破壞生物蛋白的結構及生物特性，生理鹽水不能調整pH，對完整的、具有活性的物質不能保證其在最適條件下參與生物反應，而磷酸緩沖鹽溶液（PBS）具有鹽平衡、可調整的適宜pH緩沖作用，一般用PBS稀釋有活性的生物制劑。本實驗用PBS作為沖洗液。

1.2 細胞株及常規培養 骨肉瘤細胞株 （U-2OS），由首都師范大學生科學動物細胞實驗室提供。該細胞的特點是細胞核大，細胞形態圓潤，實驗效果明顯。接種細胞之前在培養孔里加入蓋玻片，將細胞接種于蓋玻片上，使細胞在蓋玻片上貼壁培養，這樣設計便于實驗處理之后，直接將蓋玻片扣在載玻片上進行制片觀察。在培養孔中加入血清和雙抗的高糖DMEM培養基，37℃，CO2培養濃度為5%，培養密度 5×105，培養24 h。單層細胞均勻覆蓋在蓋玻片表面，細胞狀態健康。

2 實驗步驟

2.1 冰甲醇固定壞死處理 用壓力泵吸除骨肉瘤細胞培養基后，PBS清洗殘留培養基。將載有細胞的蓋玻片分為左、右2個部分，左邊細胞作為對照組，保持活性；右邊作為實驗組，用一小滴冰甲醇處死并固定細胞，時間控制在5 s即可，用PBS沖洗2～3遍，盡量不污染活細胞。

2.2 貼壁細胞的原位臺盼藍染色實驗 吸除培養盤中多余的PBS，在蓋玻片左右2個部分都滴加臺盼藍，完全覆蓋細胞，同時進行染色，室溫染色約3 min即可，吸除臺盼藍，用PBS沖洗染料2～3次。立即制作裝片觀察并拍照。

3 實驗結果與討論

3.1 結果 未經冰甲醇處理的細胞，細胞膜完整，不能被臺盼藍染色（見圖1，本文附圖見插頁2）；經過冰甲醇處理的細胞，細胞膜喪失完整性，被臺盼藍染成藍色（見圖2）。圖3則顯示了實驗組和對照組對照實驗交界處，對比明顯（圖1～圖3均為物鏡40倍下觀察，圖片比例尺20 μm）。

3.2 討論 經過冰甲醇處理，細胞膜的通透性變大，失去控制物質進出的能力，大分子物質臺盼藍進入細胞，使得細胞染上藍色。未經冰甲醇處理的細胞，細胞膜完整，臺盼藍分子不能進入染色。

此次動物細胞實驗的創新之處在于借鑒了傳統的臺盼藍拒染實驗中試劑的使用，但在此基礎上大膽進行了改進，尤其是在實驗操作和新試劑的使用方面。實驗試劑濃度和實驗時間經過多次摸索得出，可重復。實驗優點在于：

1）未將貼壁培養的細胞用胰蛋白酶消化下來，直接在細胞貼壁原位進行實驗。原實驗胰蛋白酶消化細胞會對細胞的活性有很大影響，酶反應的時間不可控，時間過短消化出的細胞較少。時間較長，對細胞有毒性作用，會破壞細胞膜上的糖蛋白，導致細胞死亡過多，影響實驗效果。

2）創造性地運用冰甲醇固定液，破碎細胞膜同時固定死細胞。原臺盼藍染色實驗，破膜嚴重的細胞多次沖洗后會飄走，原位實驗不改變細胞的位置，直接處理，操作簡便，效果明顯。

3）將細胞直接種植在蓋玻片上，并根據對照原則將蓋玻片上長勢相同的細胞分為左、右2個部分，一部分做破膜處理，一部分保持活性，同時染色，顯微鏡下直接對比，結果更明顯。

4）在細胞染色后用重懸液PBS進行漂洗，洗去浮色后，在顯微鏡下觀察，這個步驟優化了臺盼藍拒染實驗。原實驗在觀察細胞染色情況時，直接吸取混有臺盼藍溶液的細胞液，直接觀察，視野整體藍色，不利于觀察細胞染色情況。

實驗的不足在于實驗所用的細胞材料不易獲得；同時細胞在脫離了適宜的培養環境時，死亡較快，因此對實驗者的操縱技能要求較高。鑒于實驗結果明顯，可以為中學教師教學提供參考。