利用涂片法觀察蕨類植物孢子發生發育*

戴錫玲　曹建國　王全喜

（上海師范大學生命與環境科學學院　上海　200234）

涂片法是一種將游離的細胞和動、植物中比較疏松的組織均勻地涂在載玻片上的制作方法，是常見的臨時玻片標本制作方法之一［1］，適用于微小的（微生物、細胞）或呈液體狀態（血液）的實驗材料［2］，在觀察動、植物染色體時通常采用該方法［3-5］；在研究高等植物的孢粉發育時也經常用到此方法，還有切片法［6-7］。本文將涂片法應用于蕨類植物瓶爾小草（Ophioglossum vulgatum）孢子發生發育的觀察，取得了良好的效果。

瓶爾小草是多年生的小型草本蕨類植物，葉通常單生，有營養葉和孢子葉之分，孢子囊穗長2.5～3.5 cm，遠超出于營養葉之上［8］（圖 1，本文附圖見封四）。制作涂片時，先將載玻片和蓋玻片清洗干凈，于載玻片的中間滴一滴蒸餾水，取不同發育時期的瓶爾小草孢子囊穗（圖2），因其孢子囊由孢子囊穗基部到頂端漸次成熟［7］，因此，將孢子囊穗的上、中、下部分別折斷，在斷面顯露2個超半圓形的孢子囊（圖3），將孢子囊的斷面在水滴中點蘸，使孢子囊中的大量不同發育時期的細胞（如孢子母細胞或孢子）落入水中，這些細胞群肉眼可見，然后左手持平載玻片（或放在平臺上），右手用鑷子夾住蓋玻片，先使蓋玻片的一邊接觸到水，且蓋玻片和載玻片成45°角，在向左推的同時向下均速降蓋玻片，避免產生氣泡，使細胞成一薄層分布，去掉多余的水分后利用光學顯微鏡鏡檢。

在瓶爾小草孢子囊的發育早期，孢子囊內數量眾多的孢原細胞為不規則多邊形，排列緊密［7］，因此很難被蘸取到水滴中。當孢原細胞分裂形成孢子母細胞時，因絨氈層原生質團侵入孢子母細胞間，使之相互之間分離，且部分細胞壁變圓（圖4），最終孢子母細胞呈球形，徹底彼此分離，周圍絨氈層原生質團中含大量淀粉粒（圖5）。隨后，孢子母細胞減數分裂形成四分孢子，表面膜將四分孢子緊密包圍在一起，外周的淀粉粒仍然較多（圖6）。瓶爾小草四分孢子呈四面體型排列，孢子為橢球形，表面光滑，此時裂縫尚未形成（圖7）。隨后，在孢子近極面的質膜收縮，出現三裂縫最初的褶皺，并在孢子表面形成外壁，最初外壁很薄，較平滑；此時，絨氈層原生質團更加濃厚，其中淀粉粒的數量較孢子母細胞階段進一步增加（圖8）。隨著外壁的增厚，孢子的透明度下降，裂縫加粗，長度幾達孢子赤道線，孢子近極面出現少量大的疣塊狀突起（圖9）。隨著成壁物質在孢子表面的沉積，裂縫明顯變短變矮，孢子表面具密集均勻的孔穴（圖10）。孢子外壁厚度繼續增加，表面發育出不規則低矮的脊狀突起，部分脊狀突起相互融合，此時，絨氈層殘余物中的淀粉粒基本消失（圖11）。最后，孢子發育為球形，脊狀突起相互融合成網狀；在孢子外壁表面形成周壁，周壁與外壁性質不同，呈褐色；此時，裂縫最短最細，長約為孢子半徑的1/3（圖12）。

與切片法［6-7］相比，利用涂片法觀察蕨類植物孢子發生發育具有如下特點：①操作簡便：涂片法觀察孢子發育只需取材、折斷（或切斷）孢子囊、涂片、蓋片、鏡檢等5步，只需用光學顯微鏡觀察即可，相比切片法操作更簡便，更適合于教學中采用。②不使用化學試劑：涂片法只需要蒸餾水，不需要任何化學試劑（如切片法中需要固定劑、染色劑等）。因此，涂片法相對來說更經濟且環保。③觀察效果直觀：因涂片法在操作過程中不使用任何化學藥品處理孢子，最大限度保持了孢子的活體狀態，因此，孢子的形態不會發生變化（若利用切片法觀察早期的孢子會出現皺縮變形等現象），使孢子各發育階段的形狀和大小特征更真實可靠。此外，該方法對孢子的顏色及裂縫和紋飾表面形態變化的觀察也是切片法所無法直觀觀察到的。④適用于孢子囊較大的種類：蕨類植物的孢子囊大小差異較大。像瓶爾小草這樣孢子囊較大的種類，不用解剖鏡，徒手就可以折斷孢子囊，使孢子暴露并進行涂片。而孢子囊較小的種類，例如蜈蚣草Pteris vittata，需將孢子囊在解剖鏡下刺破，使孢子散發在載玻片上［9］，利用涂片法操作有難度。

蕨類植物屬于高等的孢子植物，其孢子經孢子母細胞減數分裂產生，也是配子體世代的第1個細胞，在蕨類植物的世代交替中起著重要的作用。因此，利用簡便的涂片法可以加深學生對蕨類植物的生活史及孢子發生發育知識的理解，培養學生的動手能力和學習興趣，使理論知識變得直觀生動。

［1］馮玉樺.玻片標本的種類和制作.生物學教學，2004，29(5)：46.

［2］朱曉林，王靜，許香春.顯微觀察類實驗中臨時玻片標本的制作.實驗教學與儀器，2015(2)：37.

［3］于天飛，呂建偉，李默.鳥類骨髓細胞染色體的制備.生物學教學，2010，35(6)：36.

［4］宋娟娟，唐源江，廖景平,等.瀕危植物矮沙冬青減數分裂期染色體行為的觀察.熱帶亞熱帶植物學報，2003，11(2)：166.

［5］黃遠.新黑麥減數分裂時期的定位觀察.生物學通報，2008，43(11)：53.

［6］戴錫玲，王賽賽，王全喜.團扇蕨是觀察蕨類植物孢子囊發育的好材料.生物學通報，2012，47(9)：52.

［7］戴錫玲，包家茜，曹建國,等.瓶爾小草是觀察厚囊蕨類孢子囊發育的好材料.生物學通報，2015，50(2)：42.

［8］中國科學院中國植物志編輯委員會.中國植物志：2卷.北京：科學出版社，1959.

［9］戴錫玲，張蕾，王全喜.富砷植物蜈蚣草孢子和配子體發育的顯微觀察.生物學通報，2012，47(5)：55.