蠟樣芽孢桿菌分型方法研究進展

曹飛揚，王 娉，江連洲，陳 穎,*

（1.中國檢驗檢疫科學研究院農產品安全研究中心，北京 100176；2.東北農業大學食品學院，黑龍江 哈爾濱 150030）

蠟樣芽孢桿菌分型方法研究進展

曹飛揚1,2，王 娉1，江連洲2，陳 穎1,*

（1.中國檢驗檢疫科學研究院農產品安全研究中心，北京 100176；2.東北農業大學食品學院，黑龍江 哈爾濱 150030）

蠟樣芽孢桿菌是一種食源性條件致病菌，在環境和食品中分布比較廣泛， 所引起的食物中毒常分為腹瀉型和嘔吐型。研究蠟樣芽孢桿 菌的分型方法對該菌的預防、預警、溯 源及分子流行病學的調查都具有重要意義。目前，蠟樣芽孢桿菌的分型方法主要包括噬菌體分型、生化分型等傳統分型方法以及多位點序列分型、重復序列聚合酶鏈式反應分型、隨機擴增多態性DNA分型、脈沖場凝膠電泳分型等分子分型方法。以蠟樣芽孢桿菌為對象，綜述其分型方法的研究進展，以期為該菌的分型提供一定參考。

蠟樣芽孢桿菌；傳統分型；分子分型

曹飛揚, 王娉, 江連洲, 等. 蠟樣芽孢桿菌分型方法研究進展[J]. 食品科學, 2017, 38(17): 286-290. DOI:10.7506/ spkx1002-6630-201717046. http://www.spkx.net.cn

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蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus）是革蘭氏陽性菌，兼性需氧，隸屬于芽孢桿菌屬。B. cereus呈長桿狀，大小為（1.0～1.2） μm×（3.0～5.0 ）μm，產圓形或橢圓形的芽孢。在普通培養基上可生長成直徑為3～8 mm的白色菌落，該菌落為圓形或近似圓形、稍有光澤、質地較軟；在甘露醇卵黃多黏菌素（mannitol-egg-yolkpolymyxin，MYP）瓊脂上呈現微粉紅色菌落，周圍有白色至淡粉紅色沉淀環[1]。B. cereus的生化特點是不發酵甘露糖、阿拉伯糖、木糖，厭氧條件下可以發酵葡萄糖，通常能把明膠液化，產酪蛋白酶、卵磷脂酶、青霉素酶和過氧化氫酶。B. cereus能合成青霉素酶，對青霉素有很強的抗性，且該菌有很強的耐熱性，它游離的芽孢在100 ℃條件下至少30 min才能被殺死。據相關報道，乳制品中還存 在一些耐低溫的B. cereus，在冷藏溫度甚至更低溫度條件下仍然可以生長繁殖，引起食物中毒[2]。

B. cereus在水、空氣、土壤中廣泛存在，因此，食品很容易受到該菌的污染，幾乎所有種類的食品都曾檢出過蠟樣芽孢桿菌，例如各種類型的乳制品、糧食、肉制品、海產品及蔬菜水果等[3-4]。B. cereus是動物及植物源性食品的主要污染物，其引起的食品中毒事件在國內外均有報道，中毒后可以導致胃腸功能紊亂、各種局部或全身性感染，如壞死性腸炎、肝功能衰竭、菌血癥和腦膜炎[5-7]，但其最為常見的是導致腹瀉型和嘔吐型2 種類型的食物中毒，其中腹瀉是由溶血素BL（Hbl）、非溶血性腸毒素（Nhe）、細胞毒素K（CytK）、腸毒素FM（EntFM）及腸毒素T（BecT）等腸毒素所引起的；嘔吐是由一種小的環狀熱穩定十二肽毒素Ereulide引起的[8]。

病原菌的鑒定和分型對現代公共衛生傳染病監測和疫情應對至關重要，及時、準確的菌株分型數據有助于快速檢測到疾病爆發源，從而可以采取一定的控制措施，防止未來病原菌的爆發[9]。B. cereus的傳統分型方法主要有生化分型、噬菌體分型、血清分型等，但存在操作繁瑣、分型周期長、分辨率低等缺點。隨著分子生物學的發展，B. cereus的分子分型方法越來越多，如多位點序列分型、重復序列聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）分型、隨機擴增多態性DNA分型、脈沖場凝膠電泳分型等，這些分型方法有效地彌補了傳統分型方法的不足。目前，B. cereus分型的研究處于起步階段，本文對B. cereus分型方法的研究進展進行綜述，以期為該菌的鑒定和分型提供一定的參考。

1 蠟樣芽孢桿菌的傳統分型方法

20世紀早期，細菌主要依據形態學進行鑒定，很難鑒定到種或亞種。為了對細菌進行細分，基于血清學、抗生素敏感性、噬菌體抗性、生化表型等的分型方法逐漸產生[10]。

噬菌體分型是一種基于噬菌體對宿主細菌感染和裂解具有高度特異性而進行分型的方法。1988年，姚敬業等[11]從水中獲取13 株B. cereus噬菌體對中國16 個地區的121 株食品中毒株及602 株食品分離株進行了分型，結果顯示723 株蠟樣芽孢桿菌被分為41 個型別，其中型別C20、C30、C24、C27、C19及A4占的比重較大；食品中毒株的分型率為75%，以A4型最多見，明顯高于食品分離株的分型率（51%）。噬菌體分型特異性較高，對病原菌的溯源具有一定的應用價值，但也存在操作繁瑣、重復性差、個別菌株不能分型等不足之處，目前在B. cereus分型中應用較少。

目前，傳統生化分型在B. cereus分型中占主要地位，依據GB 4789.14—2014《食品微生物學檢驗 蠟樣芽孢桿菌檢驗》[1]，通過明膠液化實驗、V-P實驗、淀粉水解、硝酸鹽還原、檸檬酸鹽利用，可將B. cereus分成15 個生化型別。李春等[12]于2015年對各類即食食品中分離的52 株B. cereus進行生化分型，結果表明4 株分離菌株不能分型，其余48 株B. cereus分離菌株分為7 個型，以2、8、9型為主，通過與ERIC-PCR分型結果相比發現這次實驗的生化分型沒有分子分型精確。理論上，生化分型可以為B. cereus的溯源提供一定的依據，但其操作復雜、所需試劑繁多、分型時間長，且有些菌株不能分型。

2 蠟樣芽孢桿菌的分子分型方法

2.1 多位點序列分型

多位點序列分型（multilocus sequence typing，MLST）是近年來發展比較迅速的分子分型方法，分辨能力較高，對病原體流行病學及進化學的研究具有重要意義[13]。這種方法通常是選取7 對管家基因并對每個基因450～500 bp的片段進行測序，將每個位點的序列上傳至MLST網站進行分析，獲取相應等位基因的編號，每一株菌的等位基因編號排列組合構成該菌的等位基因圖譜或序列型（sequence typing，ST）[14-16]。MLST技術可以通過比較ST評估不同來源的菌株之間的親緣關系，即親緣關系比較近的菌株ST相同或僅有個別的基因座存在差異。2007年，Olsen等[17]運用改進的MLST對B. cereus群進行分型，通過對比adk基因片段的核苷酸序列實現了B. anth racis（炭疽芽孢桿菌）與B. cereus群內其他種的區分，為B. cereus群內種間鑒別提供了參考。2014年，劉勇[18]對大米中分離的13 株嘔吐性B. cereus進行了MLST分型，結果顯示11 株菌株為ST26序列型，這可為產嘔吐毒素B. cereus的初篩提供依據；并發現了2 株新的嘔吐性B. cereus序列型，豐富了嘔吐型菌株的多樣性，表明了嘔吐性B. cereus在進化過程中正趨向于多樣化。MLST方法準確度高、重現性好，便于實驗室之前的數據比對分析，有利于追溯病原菌的傳播途徑和來源，但MLST對管家基因高度一致的菌株分型并不適合。

2.2 重復序列PCR分型

重復序列PCR（repetitive sequence-PCR，Rep-PCR）分型技術是Versalovic等[19]在1991年發明的一種基因組指紋分型方法。這種方法是以基因組的重復序列為引物進行PCR擴增，并用瓊脂糖凝膠電泳對擴增產物進行分析，最后基于電泳結果進行分型。目前常用于細菌分型有細菌基因外重復回文序列擴增（repetitive extragenic palindromic-PCR，REP-PCR）、腸內細菌基因組間重復序列擴增（enterobacterial repetitive intergenic consensus sequence-PCR，ERIC-PCR）和細菌基因組重復序列擴增（BOX-PCR）等[20-22]。2007年，López等[23]運用REPPCR、ERIC-PCR、BOX-PCR 3 種重復序列PCR方法對133 株B. cereus蜂蜜分離株進行分型，通過這3 種方法的結合可以把所有分離菌株分為7 個型，表明REP-PCR基因組指紋可用于表征B. cereus；這些數據也說明蜂蜜中分離B. cereus具有高度的基因多樣性，表明B. cereus污染可能來自花粉、設備、灰塵等多個源頭。2011年，Chaves等[24]運用REP-PCR對1980—2000年巴西的97 株食源性B. cereus進行分型，結果分為7 個主要型別（2 株及以上），表明這些菌株具有高度的基因多樣性，且多樣性隨時間的推移一直保持；同時發現1型包括的菌株最多（10 株菌，9 株相似度為100%），并且這些菌株擁有除ces基因外的所有已知腸毒素相關基因，這可以為產腸毒素B. cereus的初篩提供參考。REP-PCR技術操作簡單、快速，分辨率高，重復性好，可用于細菌的多樣性研究，但有關研究表明，REP-PCR對相同來源菌株的分型有局限[25]。

2.3 隨機擴增多態性DNA分型

隨機擴增 多態性DNA（random amplifi ed polymorphic DNA，RAPD）分型是一種建立在PCR技術之上的基因組多態性檢測方法。這種方法以基因組DNA為模板，采用隨機選擇的單一引物擴增基因組DNA，擴增產物經電泳分離、電泳結果分析可以實現對細菌的分型[26]。2010年，Thorsen等[27]運用RAPD對非洲發酵食品中的19 株B. cereus進行分型，結果分為2 個型，且2型的7 株B. cereus均可以產生嘔吐毒素，說明RAPD分型方法可以用于產嘔吐毒素B. cereus的識別。2012年，Oh等[28]運用RAPD對生米及米飯中分離的B. cereus群進行分型，結果發現B. cereus群的生米分離株的多樣性多于B. cereus群的米飯分離株；并且，具有相同RAPD圖譜的B. cereus群分離株一般會具有相似的毒性，這說明RAPD技術可能適用于B. cereus產毒素種類的判別。Hall等[29]于2012年運用RAPD技術對熱巧克力飲料中的B. cereus群來源進行了分析，結果發現B. cereus群最主要的源頭是巧克力粉，同時機器部件也是B. cereus群的一個來源，這為RAPD技術在B. cereus群溯源中的應用提供了依據。RAPD技術在B. cereus分型中的應用比較廣泛，相對于擴增片段長度多態性、脈沖場凝膠電泳等技術來說具有簡單、快速、多態性好等優點，但RAPD技術也存在一定的局限性，如穩定性和重復性較差[30]。

2.4 擴增片段長度多態性分型

擴增片段長度多態性（amplified fragment length polymorphism，AFLP）分型是基于PCR技術的基因組限制性片段長度多態性檢測方法。該方法是通過限制性內切酶對基因組DNA進行酶切，形成大小不同的DNA片段，再用雙鏈寡核苷酸接頭連接酶切片段， 然后設計引物對連接后片段進行擴增，最后通過電泳檢測擴增后的DNA片段[31-32]。2011年，Tourasse等[33]通過結合2 214 株分離菌株的AFLP與多位點序列分型、多位點酶電泳分型數據對B. cereus群進行分析；結果表明B. cereus群中可以發現來源不同且親緣關系非常近的新群，同時發現了來自食品的B. cereus分離菌株可以與臨床、環境等其他來源的B. cereus分離菌株基因型相同，這是之前所不被認可的。AFLP具有多態性強、穩定性和重復性好等優點，但AFLP技術所用引物取決于接頭，對接頭技術要求較高，所以目前運用AFLP對B. cereus分型的研究并不多見[34]。

2.5 脈沖場凝膠電泳分型

脈沖場凝膠電泳（pulsed-field gel electrophoresis，PFGE）技 術是1984年Schwartz等[35]發明的一種電泳技術，用于分離大片段線性DNA分子。這種方法的原理是DNA分子在交替變換的脈沖電場下泳動方向發生改變，且不同分子質量的DNA分子定向速率不同，分子質量小的DNA分子比大的DNA分子重新定向快、在凝膠中移動速率快，最終可以分離大小不同的DNA片段，達到分型的目的[36]。2011年，Kim等[37]運用PFGE對39 株產嘔吐毒素B. cereus（35 株臨床分離菌株和4 株食品分離菌株）及3 株產腸毒素B. cereus參考菌株進行分型，結果發現在70%的相似性水平下分為17 個型，且臨床分離菌株的電泳條帶多于食品分離菌株；通過結合生物學特性、PFGE型、RAPD型及抗生素耐藥型數據，這些菌株被分為7 個型，其中7型由3 株產腸毒素B. cereus參考菌株組成，5型和6型涵蓋了大部分的產嘔吐毒素B. cereus，且5型均為臨床分離株，說明PFGE分型與其他分型方法結合可以把產腸毒素B. cereus與產嘔吐毒素B. cereus區分開，同時也可以用于區分部分臨床分離菌株和食品分離菌株。PFGE技術具有分辨率強、重復性好等優點，廣泛應用于病原菌的溯源、臨床及醫學等方面，但該方法耗時長、成本高、易受主觀因素的影響，目前在B. cereus分型中的應用并不廣泛。

2.6 全基因組測序分型

全基因組測序（whole genome sequencing，WGS）技術是基于細菌的整個基因組對細菌進行分型的方法，該方法對流行病學的調查至關重要，并且將來可能會應用于臨床[38-39]。近年來，隨著一些技術手段的發展，WGS技術正趨向于低成本、高通量。然而WGS技術最大的挑戰不在于測序的成本及實施的復雜性，而在于大量數據的產生[9,40]。運用WGS技術對微生物分型的重要條件是有一個可利用的網絡生物信息和數據儲存平臺，且該平臺儲存的WGS參考數據庫能逐漸增多。目前鮮見運用WGS技術對B. cereus進行分型的報道，但隨著B. cereus研究的不斷深入以及WGS技術的發展，運用WGS技術對B. cereus進行研究將有很廣闊的空間[41]。

2.7 基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜分型

基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜（matrix assisted laser desorption ion ization time of flight mass spectrometry，MALDI-TOF-MS）技術作為新興的技術，其應用于菌種鑒定和分型中的研究越來越多。這種方法主要是通過檢測微生物的核糖體蛋白質的質譜數據，與已知微生物的質譜數據比對進行菌種鑒定，并基于質譜數據聚類而進行分型[42]。MALDI-TOF-MS鑒定速率快，100 個樣品從點樣到分析出結果，大約需要1 h，同時該方法還具有操作簡單、高通量、重復性好等優點，但該方法也存在儀器比較昂貴、成本高、對微生物的純度要求高等缺點[43]。目前，運用MALDI-TOF-MS方法對B. cereus進行鑒定和分型的研究鮮見報道，但該技術應用于其他細菌的報道已經很 多，Espinal等[44]運用MALDI-TOF-MS技術對不動桿菌屬分離株的不同種進行了區分，為其他細菌的分型提供了參考；趙貴明等[45]運用MALDI-TOF-MS技術實現了對克羅諾桿菌的鑒定和分型，并且其分型結果與分子分型結果一致，進一步說明了該方法的準確性和發展空間。盡管目前MALDI-TOF-MS技術存在一些局限，但該方法高效率、高通量等優點決定其必將成為B. cereus分型技術發展的一個趨勢。

3 結 語

本文對B. cereus的噬菌體分型、生化分型等傳統分型方法以及MLST、Rep-PCR、RAPD、PFGE等分子分型方法的研究進展進行了概述。MLST技術應用范圍較廣，幾乎適用于所有種屬的細菌，目前MLST多用于B. cereus群內B. anthracis、B. cereus、蘇云金芽孢桿菌（B. thuringiensis）等各個種的區分，也常用于產嘔吐毒素B. cereus的識別，研究發現序列型ST26是產嘔吐毒素B. cereu s的優勢菌株[18]。MLST可實現數據在全球范圍內共享，提高了核酸序列變異分析的可靠性和自動化，隨著測序技術的發展和成本的下降，MLST將會在B. cereus鑒定、分型發揮更大的作用[46]。REP-PCR分型是一種有效的基因分型方法，在微生物鑒定、分型及親緣關系研究中有廣闊的前景，比較適用于B. cereus分型。但REP-PCR的分型效果易受反應體系、循環參數等外界因素的影響，所以需要 建立一種高效、穩定的REP-PCR分型體系，從而實現對B. cereus的高效、準確的分型[47]。RAPD技術在微生物的分類鑒定、溯源等方面應用廣泛，目前多用于芽孢桿菌的多樣性研究。Oguntoyinbo等[48]結合RAPD和核糖體DNA擴增片段限制性內切酶分析技術實現了對芽孢桿菌屬內B. cereus、B. subtilis、B. licheniformis等的區分。AFLP和PFGE技術雖有諸多優勢，但目前在B. cereus分型中的應用并不普遍，常與其他分型方法結合對B. cereus進行分型。

隨著科技的發展，越來越多的細菌分型方法應運而生，逐漸向高效率、低成本、高分辨率、高通量的方向發展。選擇合理的B. cereus分型方法有利于該菌的溯源，從而預防和控制該菌引起的食源性疾病。

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Advances in Methods for Bacillus cereus Typing

CAO Feiyang1,2, WANG Ping1, JIANG Lianzhou2, CHEN Ying1,*
(1. Agro-Product Safety Research Center, Chinese Academy of Inspection and Quarantine, Beijing 100176, China; 2. College of Food Science, Northeast Agricultural University, Harbin 150030, China)

Bacillus cereus is a food-borne opportunistic pathogen widely present in the environment and foods. It is frequently associated with two types of food-borne illness: emesis and diarrhea. The study on Bacillus cereus typing has important implications for the prevention, early warning, tracing and molecular epidemi ological survey of Bacillus cereus. Currently, the popular methods for typing Bacillus cereus include traditional typing methods such as phage typing and biochemical typing, and molecular typing methods such as multilocus sequence typing, repetitive sequence-PCR, random amplifi ed polymorphic DNA, and pulsed-fi eld gel electrophoresis. In this paper, all these methods are reviewed with the aim of providing references for the typing of Baci llus cereus.

Bacillus cereus; traditiona l typing methods; molecular typing methods

10.7506/spkx1002-6630-201717046

TS207.4

A

1002-6630（2017）17-0286-05引文格式：

2016-07-28

“十三五”國家重點研發計劃重點專項（2016YFD0401102）；中國檢驗檢疫科學研究院院所基金項目（2016JK006）作者簡介：曹飛揚（1989—），男，碩士，研究方向為食品質量安全檢測與控制。E-mail：feiyangc@163.com

*通信作者：陳穎（1972—），女，研究員，博士，研究方向為食品質量安全與控制。E-mail：chenyingcaiq@163.com