固相萃取/超高效液相色譜-串聯質譜法測定畜肉中16種鎮靜劑類獸藥殘留

劉家陽，黃 旭，賈宏新

(遼寧省食品檢驗檢測院 ，遼寧 沈陽 110015)

固相萃取/超高效液相色譜-串聯質譜法測定畜肉中16種鎮靜劑類獸藥殘留

劉家陽1，黃 旭2，賈宏新3*

(遼寧省食品檢驗檢測院 ，遼寧 沈陽 110015)

建立了畜肉中16種鎮靜劑類獸藥殘留的固相萃取凈化/超高效液相色譜-串聯質譜(LC-MS/MS)的同時測定方法。樣品均質后經氫氧化鈉溶液水解，加入鹽酸溶液提取。提取液經固相萃取柱MCX凈化，洗脫液氮氣吹干后用流動相溶解，經0.22 μm濾膜過濾，采用Waters ACQUITY UPLC BEH C18(2.1 mm×100 mm,1.7 μm)色譜柱分離，在電噴霧電離源(ESI)和多反應監測(MRM)正離子模式下測定，外標法定量。結果表明：采用基質匹配外標法測定，16種鎮靜劑類化合物在一定濃度范圍內呈良好的線性關系(r2≥0.996 8)，在樣品中的檢出限和定量下限分別為0.01～0.05 μg/kg和0.1～0.5 μg/kg，在3個濃度加標水平下的平均回收率為71.6%～112%，相對標準偏差(RSD)為2.9%～15.8%。市售多種鮮肉制品的測定結果表明，該方法選擇性好、操作簡單快速、結果準確，適用于畜肉中16種鎮靜劑類獸藥殘留的同時快速測定。

固相萃取；超高效液相色譜-串聯質譜；鎮靜劑；畜肉

近年來畜肉及其制品中獸藥殘留問題逐漸成為人們關注的焦點[1]。鎮靜劑藥物是一類通過抑制中樞神經系統減弱其生理機能而達到緩和激動、消除躁動、恢復安靜情緒的藥物[2]。近年來，安眠鎮靜類藥物被個別不法畜牧業主作為生長促進劑用于養殖業[3]。鎮靜劑類藥物在畜禽體內具有一定的代謝周期，非法使用會保持其藥物原形或代謝產物在畜禽體內殘留。消費者食用此產品后會對中樞神經系統造成不良影響，甚至出現增加機體代謝負擔和功能性減退等問題，因此許多國家將此類藥物列為禁用藥物。國際食品法典委員會(CAC)、歐盟等組織和地區均對此類藥物推出限量標準[4-5]。我國農業部第235號公告中明確規定氯丙嗪、地西泮等在動物源性食品中不得檢出；阿扎哌隆和阿扎哌醇具有相應的參考值；安眠酮禁止使用等[6]。目前鎮靜劑殘留的檢測方法主要有酶聯免疫法[7]、高效液相色譜法[8-10]、液相色譜-串聯質譜法[11-13]和氣相色譜-串聯質譜法[14-16]。其中酶聯免疫法易出現假陽性結果和交叉反應；高效液相色譜法的抗干擾能力差，靈敏度低且不能滿足標準限值的要求；GC-MS方法需對樣品進行繁瑣的衍生化處理；LC-MS/MS技術無需衍生化處理，而且在滿足多組分同時檢測的情況下仍有較好的選擇性、靈敏度和特異性，彌補了前幾種方法的缺陷。從實際應用來看，LC-MS/MS方法也是報道最多的方法。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

超高效液相色譜-串聯四極桿質譜聯用儀(Waters ACQUITY H-CLASS TQD)；高速冷凍離心機(美國Thermo公司 MULTIFUGE X1R)；渦旋振蕩器(美國IKA VORTEX公司 GENIUS 3)；超聲波清洗器(美國BANDELIN 512H)；氮吹儀(Preekem N1公司)；天平(感量0.000 1 g，美國Sartorius公司)；Milli-Q超純水器(美國Millipore公司)；Oasis MCX 6 cc/150 mg固相萃取柱(美國Waters公司)。

甲醇、乙腈、正己烷(色譜純，Fisher公司)；甲酸(色譜純，Sigma公司)；鹽酸、氫氧化鈉、氨水(分析純，北京化工廠)；乙酸銨(分析純，中國國藥制劑有限公司)；實驗用水為超純水。

1.2 混合標準溶液的制備

分別準確稱取上述標準品10.0 mg置于10 mL棕色容量瓶中，加入甲醇溶解并定容至刻度，搖勻，于-20 ℃冰箱保存。臨用前，用甲醇稀釋成100 ng/mL的混合標準使用液。

1.3 樣品前處理

1.3.1 樣品預處理 畜肉或肉制品去皮去骨，剔除筋膜，用均質器充分粉碎混勻后，放置-18 ℃以下冷凍貯存。

1.3.2 樣品提取 稱取2.0 g已粉碎樣品(精確至0.01 g)置于50 mL聚丙烯離心管中，加入5 mol/L氫氧化鈉溶液0.40 mL,渦旋混合30 s，于65 ℃水浴中放置1 h，期間將樣品每隔20 min取出渦旋30 s。水浴后立即加入1.0 mol/L鹽酸溶液10.0 mL劇烈振蕩20 s，超聲10 min，渦旋混合2 min，于-10 ℃，10 000 r/min高速冷凍離心8 min。傾出上清液置于另一50 mL聚丙烯離心管中，在原離心管中再加入1.0 mol/L鹽酸溶液7.0 mL重復以上操作，合并上清液并用1.0 mol/L鹽酸溶液定容至20 mL。加入10 mL正己烷劇烈振搖2 min，于-10 ℃，10 000 r/min高速離心8 min，吸出下層提取液10.0 mL待凈化。1.3.3 凈 化 將Waters Oasis MCX固相萃取柱連接固相萃取儀中，移取10 mL提取液過柱，棄去流出液。依次用0.7 mol/L 鹽酸溶液3.0 mL、80%甲醇溶液5.0 mL淋洗，用5%氨化甲醇4.0 mL洗脫，收集洗脫液。于40 ℃水浴氮吹至近干，加入流動相定容至1.0 mL，渦旋混合1 min，緩慢過0.22 μm濾膜，濾液待上機測定。

1.4 基質工作曲線配制

依次吸取不同體積的標準使用液加入相同取樣量的3種空白基質樣品中(牛肉、羊肉、豬肉)，樣品按“1.3”前處理方法處理后得到3種基質工作曲線，分別對3種樣品進行定量校正。16種鎮靜劑的基質標準工作曲線范圍為0.10～10 ng/mL。

1.5 LC-MS/MS測定

1.5.1 色譜條件 Waters BEH C18(2.1 mm×100 mm,1.7 μm)色譜柱；柱溫：35 ℃；流速：0.4 mL/min；進樣量：5.0 μL；流動相：A為乙腈-0.1%甲酸，B為0.1%甲酸；梯度洗脫程序：0～4.0 min，5%～28% A；4.0～5.5 min，28% A；5.5～8.5 min，28%～30% A；8.5～12 min，30%～68% A；12～16 min，68%～5% A。

1.5.2 質譜條件 電噴霧電離源(ESI+)；MRM檢測方式；毛細管電壓：1.8 kV；脫溶劑氣溫度：450 ℃；脫溶劑氣流量：800 L/h；錐孔氣流量：10 L/h；源溫度：150 ℃；電離方式、監測離子對、碰撞條件見表1。

表1 16種待測物質的質譜采集參數Table 1 Mass spectrometric acquisition parameters of 16 compounds

*quantitative ion

1.5.3 樣品測定 取基質標準工作曲線分析液和已制備好的樣品分析液5 μL分別進樣，以峰面積為縱坐標，基質標準工作曲線濃度為橫坐標，繪制標準曲線(每個標準點平行測定3次，取峰面積的平均值)。以基質工作曲線標準峰的保留時間和2對離子對作為定性依據，以基質標準工作曲線對樣品進行定量。

2 結果與討論

2.1 色譜條件的優化

本文選擇的16種鎮靜劑多為堿性弱極性化合物[17]，對于色譜分離體系中固定相的選擇側重于對弱極性化合物的保留且對流動相pH值有較寬的耐受范圍。本方法選擇了超高效液相色譜中常用的3種色譜柱(ACQUITY UPLC HSS T3，ACQUITY CSH C18，ACQUITY UPLC BEH C18)進行比較。在使用HSS T3色譜柱時待測物色譜峰有明顯的滯后現象，整體時間延長，個別色譜峰展寬明顯。分析原因主要是鎮靜劑類化合物呈堿性，洗脫液加入酸性流動相后弱極性特征發生轉變，色譜柱對其保留增強所致。在使用CSH C18色譜柱時色譜峰形尖銳，展寬情況好轉且靈敏度提高，但16種鎮靜劑的色譜峰距離較遠，分布不對稱。因此，本實驗最終選用極性適中的ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱，在此條件下各目標化合物的峰形尖銳且基本實現基線分離，具有較好的分離效果和靈敏度。

采用梯度洗脫程序，對超高效液相色譜-質譜系統常用的乙腈-水和甲醇-水流動相體系進行了考察。在使用甲醇-水作為流動相時，柱壓明顯升高，各組分的保留時間明顯滯后。在乙腈-水體系中洗脫性明顯增強，各化合物的保留時間縮短，峰形更尖銳且分離度提高。考慮到16種鎮靜劑的質譜電離方式均為正離子模式，在流動相體系中加入0.1%甲酸溶液后，多個目標化合物的離子強度得到提高，具有較好的洗脫效果和分離度。因此，本實驗最終選用0.1%甲酸乙腈-0.1%甲酸水溶液作為流動相，在優化條件下16種鎮靜劑的總離子流圖見圖1。

圖1 16種化合物混合標準溶液的總離子流圖Fig.1 TIC chromatogram of 16 mixed analytes standard solution

2.2 質譜條件的優化

16種待測物的化學結構多為含有氮原子的環狀結構，表現出堿性化合物的特性，更適合在質譜ESI源的正電離模式下運行。本實驗采用將16種化合物單標液分別進樣的方式，在選定的離子化模式基礎上，通過全掃描和子離子掃描并調節毛細管電壓、錐孔電壓、源溫度等質譜參數以進一步提高各母離子和子離子的信號水平。根據歐盟2002/657/EC對禁用獸藥殘留檢測確證方法的要求，確證檢測需要4個鑒別點。本實驗通過上述質譜參數的優化和篩選，每種待測物最終確定2個監測離子對，以滿足歐盟獸殘檢測確證的要求。

2.3 樣品前處理條件的優化

為保證樣品水解過程的充分性和均勻性，本實驗考察了在不同堿液體積，不同水解溫度條件下對水解產物最終狀態的影響：在80 ℃水浴環境下，分別將0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 mL的5 mol/L氫氧化鈉溶液加入樣品中進行比較。結果顯示，加入0.4，0.6，0.8，1.0 mL堿液的樣品在50 min內先后全部液化，但加入0.8，1.0mL堿液的樣品中出現棕色泡沫，因此確定加入堿液的最佳體積為0.4 mL；同時比較了55，60，65，70，75 ℃水浴溫度的影響，結果表明65，70，75 ℃的水浴環境下樣品水解完全，液態均勻且顏色透明。因此，最終采用加入5 mol/L氫氧化鈉溶液0.4 mL，65 ℃水浴溫度作為水解條件。

表2 兩種提取方式對基質工作曲線斜率的影響Table 2 Influence of two extractive methods on slopes of the calibration curve with matrix

a：K1is the slope of calibration curve with base；b：K2is the slope of calibration curve with enzyme

2.3.2 凈化條件的優化 由于肉類樣品基質中脂肪蛋白含量較高，經堿溶液水解后仍殘留部分脂肪蛋白干擾。本方法在樣品水解液中加入鹽酸溶液，使溶液pH值降至蛋白質的等電點以下使蛋白變性后離心沉淀，以達到消除蛋白類的干擾。本實驗考察了乙酸乙酯、正己烷、石油醚的去除效果。由于16種待測物中部分呈中等偏弱極性，經實驗發現采用乙酸乙酯時待測目標物損失較多，回收率偏低；采用石油醚時，對油脂類和弱極性干擾物的去除效果較好，但樣品凈化液冷凍離心后，脂肪層出現片狀結構且分布不均勻，無法進行萃取操作；而采用正己烷溶劑時，處理液經高速冷凍離心后脂肪層分布均勻且界面清晰，蛋白顆粒全部形成沉淀，待測物損失較少。因此，本方法最終采用正己烷作為凈化試劑并結合高速冷凍離心方式，取得了較好的凈化效果。由于16種鎮靜劑多為弱堿性化合物，MCX固相萃取柱對其有較強的吸附作用，因此，本文采用Oasis MCX離子交換固相萃取柱進行凈化，通過后續的淋洗和洗脫步驟后，最終獲得較為澄清且雜質含量少的樣品處理液。

2.4 基質效應的評價及消除

在液相色譜-串聯質譜儀的ESI源中，基質效應會影響儀器的靈敏度和重現性。對于肉制品這種富含蛋白、脂肪等復雜基質的樣品，其基質效應會更加明顯并嚴重影響檢測結果的準確性和重現性。因此在建立本方法的同時對基質效應進行評價，并采取有效措施消除或減弱其影響是非常必要的。本方法采用空白樣品處理液加標曲線法(基質匹配標準曲線)評價基質效應(Matrix Effect，ME)：ME=(基質匹配標準溶液曲線斜率/無基質標準溶液曲線斜率-1)×100%。基質效應為負值表示存在基質抑制效應；基質效應為正值表示存在基質增強效應；基質效應為0表示無基質效應；絕對值越大表明基質效應越強。本實驗在16種鎮靜劑類待測物曲線范圍濃度內進行評價(見表3)，可以看出16種鎮靜劑有不同程度的基質效應，且抑制效應多于增強效應。

表3 16種待測物質的基質效應Table 3 Matrix effects of 16 compounds

a:Ssis the slope of the calibration curve with matrix;b：Smis the slope of the calibration curve without matrix

為消除基質效應對檢測結果的影響，提高檢測方法的準確性與重現性，本實驗采用基質匹配工作曲線法對各目標物進行定量分析。

2.5 線性范圍、檢出限與定量下限

本方法采用基質工作曲線作為定量曲線：選取未檢出鎮靜劑的3種陰性畜肉樣品(牛肉、羊肉、豬肉)，吸取不同量的標準使用液加入3種空白樣品中，按照“1.3”步驟處理后經液相色譜-質譜檢測，以待測物的峰面積(Y)作為縱坐標，對應的質量濃度(X，μg/L)為橫坐標，得到 3種基質的工作曲線。結果顯示，16種鎮靜劑的線性關系良好，相關系數(r2)分別不低于0.996 8。基于基質工作曲線中最低響應的MRM色譜圖，確定該方法的檢出限LOD(S/N>3)和定量下限LOQ(S/N>10)分別不大于0.05 μg/kg和0.5 μg/kg(結果見表4)。

表4 16種鎮靜劑類化合物的線性范圍、線性關系、檢出限與定量下限Table 4 Linear ranges，linear equations，LODs and LOQs of 16 compounds

2.6 方法的準確度與精密度

本方法采用加標回收試驗進行準確度和精密度的評價。選取不含待測物且充分粉碎混勻的3種畜肉作為空白基質樣品，分別按照低(LOQ)、中、高3個濃度水平進行加標回收率測定，每個水平在相同條件下平行測定6個樣品，各化合物的回收率和精密度見表5。結果表明，16種鎮靜劑的平均回收率為71.6%～112%，相對標準偏差(RSD)為2.9%～15.8%。本方法的準確度和精密度均符合有關標準和法規的要求。

表5 16種鎮靜劑類化合物的加標回收率及相對標準偏差(n=6)Table 5 Spiked recoveries and RSDs of 16 compounds in blank samples(n=6)

(續表5)

CompoundSpikedw/(μg·kg-1)BovinemuscleOvinemusclePorcinemuscleRecoveryR/%RSDsr/%RecoveryR/%RSDsr/%RecoveryR/%RSDsr/%Haloperidol0.1,1,584.0,102,1106.6,3.8,8.685.2,91.6,1039.7,7.6,8.286.0,94.2,96.19.4,3.4,11.3Droperidol0.1,1,591.2,106,97.76.5,8.8,4.184.2,99.6,10311.5,3.5,8.485.0,102,95.99.9,3.7,8.6Perphenazine0.5,1,597.3,107,1025.6,3.8,8.596.5,106,98.44.8,9.5,4.1102,97.5,1002.9,7.4,5.2

2.7 實際樣品的測定

利用本方法對大中型超市、農貿市場、早市的10份畜肉及畜肉制品樣品進行檢測，均未檢出以上16種鎮靜劑類獸藥殘留。

3 結 論

本文采用固相萃取的凈化方式，建立了超高效液相色譜-串聯四極桿質譜測定畜肉及其制品中16種鎮靜劑類獸藥殘留的檢測方法，該方法采用外標基質工作曲線法定量。在保證樣品凈化效率的同時有效補償了基質效應帶來的干擾，提高了測定結果的準確性和重現性，通過方法學驗證數據和實際抽樣檢測，證明該方法具有靈敏度高、快速準確、安全經濟、適于多組分分析等特點，適用于畜肉及其制品中鎮靜劑類獸藥殘留的快速測定。

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Simultaneous Determination of 16 Sedative Residues in Livestock Products by Solid Phase Extraction/Ultra Performance Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry

LIU Jia-yang1，HUANG Xu2，JIA Hong-xin3*

(Liaoning Institute for Food Control,Shenyang 110015,China)

A multi-residue method was established for the simultaneous determination of 16 sedative residues(e.g.xylaznie，methaqualone，diazepan，promethazine，oxazepam，carazolol，chlordiazepoxide，zolpidem，chlorpromazine，acetopromaizine，azaperone，azaperol，propionylpromazin，haloperidol，droperidol，perphenazine) in pork using solid phase extraction/ultra performance liquid chromaography-tandem mass spectrometry(LC-MS/MS).The homogenized samples were hydrolyzed with NaOH,then the analytes were extracted with HCl and cleaned up with an Oasis MCX SPE column.After evaporated to dryness under nitrogen and reconsituted，the reconstituted solution was filtrated through a 0.22 μm syringe filter.Chromatographic separation was performed on a Waters ACQUITY UPLC BEH C18(2.1 mm×100 mm,1.7 μm) column.The qualitative and quantitative detections of 16 analytes were operated by electrospray ionization-tandem mass spectrometry under the positive mode using multiple reaction monitoring(MRM)mode，with the external standard method.The matrix matching external standard method was used for quantitation analysis.All sedative residues have good linear relationship in the certain concentration range with correlation coefficients(r2) not less than 0.996 8.The limits of detection(LOD) and quantitation(LOQ) for 16 sedative residues were in the range of 0.01-0.05 μg/kg and 0.1-0.5 μg/kg，reapectively.The average recoveries at three spiked concentration levels varied from 71.6% to 112%，and the relative standard deviations(RSD) were 2.9%-15.8%.The method was of high sensitivity，simplicity，reliability and low cost,and was suitable for the simultaneous determination of 16 sedative residues in livestock products.

solid phase extraction；ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry；sedative；livestock products

10.3969/j.issn.1004-4957.2017.03.002

2016-09-21；

2016-10-12

遼寧省科學事業公益研究基金項目(2014004028)

O657.63;TQ460.72

A

1004-4957(2017)03-0305-07

*通訊作者：賈宏新，博士，主任技師，研究方向：食品安全檢驗檢測，Tel：024-31620803，E-mail：1094888124@qq.com