富氫水對糖尿病視網膜病變大鼠硫氧還蛋白相互作用蛋白/核苷酸結合寡聚化結構域樣受體蛋白3通路及視網膜血管通透性的影響

馮梅，江霞，王艷麗，王奇峰

作者單位：1武漢大學附屬愛爾眼科醫院屈光科，湖北 武漢 430063；2華中科技大學協和深圳醫院眼科，廣東 深圳 518052

糖尿病性視網膜病（DR）是糖尿病的常見且特定的微血管并發癥，預計到2040年將影響6.42億成年人，DR 會影響三分之一的糖尿病病人，是視力喪失的主要原因之一［1-2］。許多DR 病人對目前的治療方法［如激光光凝、眼內注射類固醇和抗血管內皮生長因子（VEGF）藥物］反應不佳，且這些治療手段無法從發病機制上改善DR，并且必須通過玻璃體內注射頻繁給藥［3-4］。因此，迫切需要開發新的策略以改善DR 的治療。臨床上，無論是否患有糖尿病性黃斑水腫（DME），DR 大致可分為早期非增殖性DR（NPDR）和晚期增殖性DR（PDR）［5］。慢性視網膜炎癥被認為是NPDR 和PDR 發病的主要原因，白細胞浸潤到視網膜，炎性遞質的釋放，可破壞血-視網膜屏障（blood retinal barrier，BRB），使血管滲漏和新血管形成［6］。研究發現DR 小鼠中核苷酸結合寡聚化結構域樣受體蛋白3（NLRP3）的激活會損害視網膜免疫反應，導致BRB 破壞，在DR 晚期觀察到的血管滲漏和視網膜新血管形成［7］。富氫水是一種富含氫氣的水，其可在不同病理狀態下減輕組織的氧化應激和炎性損傷，如心肌損傷［8］、肝炎、腎炎等［9］；還可抑制NLRP3 炎癥小體的激活減輕膿毒癥小鼠肺部炎癥［10-11］；另有研究發現富氫水對糖尿病病人慢性炎癥、氧化應激均有改善作用［12-13］。富氫水對DR 是否具有保護作用還未見相關報道，故本研究以DR 大鼠為對象，探究富氫水對DR 的影響及作用機制，為富氫水的臨床應用及DR的治療提供參考。

1 材料和方法

1.1 材料2020 年6—9 月，8 周齡，雄性Sprague-Dawley 大鼠65 只，體質量范圍180～200 g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，許可證號為SCXK（京）2016-0011，所有動物均嚴格按照動物飼養規則喂養，溫度為（24±2）℃，濕度范圍為50%～60%，自由飲水和攝食。本研究中的所有實驗均符合“視覺和眼科研究協會”關于“動物在眼科和視覺研究中的使用”聲明的要求。

1.2 藥物及試劑鏈脲佐菌素（STZ）（美國Sigma公司，批號S0130）；復方托吡卡胺滴眼液（日本參天制藥株式會社，批號J20180051）；Genteal tears 凝膠滴劑（美國Novartis Pharmaceuticals）；熒光素鈉染料（F8140，Solarbio）；伊文思藍染色液（R3248，南京沃博生物科技有限公司）；異凝集素B4（isolectin GSIB4，美國Vectorlabs，貨號FL-1201）；大鼠血管生成素-1（Ang-1）（ml023339）、VEGF（ml064294）、白細胞介素1β（IL-1β）（ml037361）、白細胞介素6（IL-6）（ml064292）酶聯免疫吸附（ELISA）試劑盒均購自上海酶聯生物公司；兔抗Bcl-2 相關X 蛋白（Bax）（ab32503）、B 淋巴細胞瘤-2（Bcl-2）（ab196495）、硫氧還蛋白相互作用蛋白（TXNIP）（ab188865）、NL?RP3（ab263899）、IL-1β（ab9787）、胱天蛋白酶-1（cas?pase-1）（ab179515）、β-肌動蛋白（β-actin）（ab8227）、山羊抗兔IgG H&L（HRP）（ab205718）、山羊抗兔IgG H&L（Alexa Fluor? 594）（ab1500080）均購自英國abcam 公司；HE 染色試劑（C0105S）、RIPA 裂解液（P0013B）、BCA 試劑盒（P0010）均購自碧云天生物科技公司；Accu-Chek Active 型羅氏活力血糖儀（羅氏血糖健康醫護公司）；多功能酶標儀（iMark680，Bio-Rad 公司）、熒光顯微鏡（日本Olympus 公司）；Hydrogen-500E高純氫氣發生器（英國普拉勒科技有限公司）；小動物視網膜影像系統（Micron Ⅳ，美國Phoenix Research Labs 公司）；三維光學相干斷層掃描儀（OCT-2000 型，日本Topcon 公司）；多功能真彩色細胞圖像分析系統（KH-3000，美國Media Cyber?netics公司）。

1.3 方法

1.3.1富氫水的制備 將氫氣溶于生理鹽水中制備飽和溶液（壓力0.4 MPa，維持6 h），富氫水中氫氣濃度為0.6 mmol/mL，保存于4 ℃冰箱中備用；每周制備新鮮富氫水用于實驗。

1.3.2動物分組及造模 大鼠適應性飼養3 d 后開始實驗，采用隨機數字表法隨機選取15只大鼠為空白組，以普通飼料喂養，參考文獻［14］一次性尾靜脈注射60 mg/kg 鏈脲STZ 造模（注射前大鼠禁食20 h），3 d 后尾尖處取血檢測空腹血糖（FBG），連續3 d的FBG 超過16.7 mmol/L 的大鼠被歸為糖尿病模型。空白組注射等量檸檬酸鹽緩沖液。有2只大鼠在實驗過程中死亡，3 只大鼠不合格，不納入后續實驗。將造模成功的糖尿病大鼠根據FBG 水平分為模型組、富氫水低、高劑量組（5、10 mL/kg），每組15 只。除空白組外，其余大鼠喂養高脂高糖飼料（66.5%基礎飼料+10%豬油+20%蔗糖+2.5%膽固醇+1%膽酸鈉）［15］，喂養8 周后，進行眼底照相和熒光素血管造影（FFA），觀察視網膜是否發生病變。結果均觀察到大鼠視網膜有微血管瘤、血管擴張、迂曲，有明顯的熒光素滲漏和新生血管；表明糖尿病大鼠視網膜發生病變，且處于晚期PDR，建模成功。

1.3.3給藥方法 模型制備完成后，富氫水各劑量組腹腔注射相應劑量的藥物，空白組和模型組給予等量生理鹽水腹腔注射，1次/天，連續給藥28 d。

1.3.4取材及指標檢測

1.3.4.1空腹血糖（FBG） 給藥結束后，大鼠稱重并記錄，采集尾大鼠末梢毛細血管全血，FBG水平。

1.3.4.2眼底熒光素血管造影（FFA） 檢查開始前大鼠眼睛滴入復方托吡卡胺進行擴張，并滴入gen?teal tears 凝膠，以防止角膜干燥。向大鼠腹腔內注射10%熒光素鈉染料（用無菌鹽水稀釋10 倍，劑量為2 mL/kg）。注射后30 s 拍攝FFA 圖像，觀察大鼠右眼熒光素滲漏和新生血管。使用熒光分析軟件計算相對熒光素強度。

1.3.4.3光學相干斷層掃描（OCT）檢測視網膜厚度FFA檢查完成后，OCT測量大鼠視盤周圍視網膜厚度（測量點為距視盤盤沿約1.5 mm位置），在成像之前，先在眼睛上涂抹Genteal tears以保持角膜濕潤。角度每隔30°測量1次，每只大鼠共測量12次，在軟件中計算視網膜厚度取平均值；再進行眼底彩色照相。

1.3.4.4視網膜血管通透性的測量 通過測量視網膜血管的伊文思藍-白蛋白復合物滲漏來分析視網膜血管通透性。每組隨機選取5 只大鼠，將伊文思藍（EB）染料溶解在生理鹽水（45 g/L）中。在深麻醉下，將染料（45 mg/kg）注射到每只大鼠的尾靜脈中。染料循環120 min 后，打開胸腔，并插入左心室。以66 mL/min 向每只大鼠灌注4%多聚甲醛2 min 以清除染料。灌注后，摘除眼睛并分離視網膜。測量每個視網膜的濕重。在70 ℃下將每個視網膜在0.12 mL 甲酰胺中孵育18 h 來提取EB。提取物在4 ℃下以70 000g離心45 min。在620 nm 和720 nm 測量濾液的吸光度。染料濃度由甲酰胺中EB 的標準曲線計算，乘以120μL 即為EB 滲漏量（ng），并標準化為視網膜重量（mg），結果表示為μg/g。

1.3.4.5HE染色 每組隨機選取5只大鼠，左眼行上直肌縫線定位后，取出眼球，立即置于福爾馬林、乙醇、冰醋酸混合固定液中固定12 h，然后去除多余組織（晶狀體、玻璃體）繼續固定12 h。取距視乳頭下方1 mm處的視網膜組織，分級乙醇脫水，常規石蠟包埋，以事先標記好的鼻側視網膜作為包埋面。以約4μm厚度行連續切片，進行HE染色。光鏡下觀察視網膜病理變化；并計算距視盤邊緣100μm處100μm長度內視網膜神經節細胞（RGC）層單位面積RGC數。

1.3.4.6免疫熒光染色 取“1.3.4.5”中石蠟切片，二甲苯脫蠟，0.01 mol/L PBS 清洗3 次，微波修復15 min，PBS 清洗后在室溫下用1%BSA 封閉20 min。滴加一抗isolectin GS-IB4（1∶100）4 ℃孵育過夜，洗去一抗，加Alexa Fluor? 594 標記的二抗室溫下孵育1 h，抗熒光淬滅劑封片。熒光顯微鏡下觀察所有免疫熒光標記切片中新生血管情況。

1.3.4.7TUNEL 染色 將“1.3.4.4”中石蠟切片參照TUNEL 染色試劑盒說明書的步驟進行染色；在顯微鏡下觀察切片并拍照（每個切片選取5個視野）。利用Image-J 軟件分析細胞凋亡率，細胞凋亡率（%）=視野內陽性染色細胞數目/細胞總數×100%。

1.3.4.8視網膜TXNIP/NLRP3 通路相關蛋白的表達 另外5只大鼠的左眼視網膜剪碎后置于干凈試管中，加入RIPA裂解液研磨后提取組織蛋白。BCA法測定其中總蛋白濃度，平衡蛋白濃度為3 g/L，各組取10μL平衡后的蛋白提取液上樣，SDS-PAGE 凝膠電泳，濕轉法轉膜，5%的脫脂奶粉封閉2 h，按照分子量及蛋白marker 標記裁剪目的條帶，加入相應的一抗（β-actin、TXNIP、NLRP3、Bax、Bcl-2、Caspase-1、IL-1β，按1∶1 000的比例稀釋），4 ℃冰箱孵育過夜，漂洗后加入二抗（按1∶5 000 的比例稀釋）室溫孵育2 h，ECL 顯色，將條帶置于凝膠成像儀中拍照，并以Im?age-J軟件分析圖片，得出各蛋白相對表達量。

1.3.4.9視網膜勻漿中Ang-1、VEGF水平 將大鼠右眼視網膜置于干凈試管中，制備勻漿液；ELISA試劑盒測量視網膜勻漿中Ang-1、VEGF、IL-1β、IL-6水平。

1.4 統計學方法使用GraphPad Prism 6.0 和SPSS 20.0軟件進行統計分析，數據表示為±s，使用單向方差分析進行多個組之間的比較，組間有差異進一步采用SNK-q檢驗。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠FBG和體質量與空白組相比，模型組大鼠FBG 水平顯著升高，體質量顯著降低（P<0.05）；與模型組相比，富氫水低、高劑量組大鼠FBG水平明顯降低，體質量明顯增加（P<0.05）。見表1。

表1 富氫水對糖尿病性視網膜病（DR）大鼠空腹血糖（FBG）和體質量的影響/±s

表1 富氫水對糖尿病性視網膜病（DR）大鼠空腹血糖（FBG）和體質量的影響/±s

注：①與空白組比，P<0.05。②與模型組比，P<0.05。

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2.2 各組大鼠視網膜血管滲漏和新生血管情況彩色眼底照片、FFA照片和免疫熒光染色結果顯示，與空白組相比，DR 模型組可觀察到大鼠視網膜新血管形成和血管曲折，血管滲漏嚴重（P<0.05）；與模型組相比，富氫水低、高劑量組大鼠視網膜新血管數量和血管滲漏明顯降低（P<0.05）。見圖1，表2。

圖1 各組大鼠的彩色眼底照片、眼底熒光素造影照片（FFA）和血管Isolectin-GS IB4免疫熒光染色（×40） 圖3 各組視網膜病理變化情況（HE染色×200） 圖4 各組大鼠視網膜神經元凋亡（TUNEL檢測×100）

2.3 各組大鼠視網膜厚度OCT 結果顯示，與空白組相比，模型組大鼠視網膜下有明顯出血，視網膜厚度顯著降低（P<0.05）；與模型組相比，富氫水低、高劑量組大鼠視網膜下出血減輕，視網膜厚度明顯增加（P<0.05）。見圖2，表2。

表2 富氫水對糖尿病性視網膜病（DR）大鼠視網膜新生血管、視網膜厚度的影響/±s

表2 富氫水對糖尿病性視網膜病（DR）大鼠視網膜新生血管、視網膜厚度的影響/±s

注：①與空白組比，P<0.05。②與模型組比，P<0.05。

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圖2 各組大鼠OCT檢查照片（比例尺：50微米）：A為空白組；B為模型組；C為富氫水低劑量組；D為富氫水高劑量組

2.4 各組大鼠BRB 通透性、視網膜病理變化與空白組相比，模型組大鼠的BRB通透性顯著增加（P<0.05）；與模型組相比，富氫水低、高劑量組大鼠的BRB通透性明顯降低（P<0.05）。見表3。

空白組大鼠視網膜整體形態完整，細胞排列緊密。與空白組相比，模型組大鼠視網膜細胞結構遭到破壞，水腫明顯，神經纖維層（NFL）表面大量炎性滲出，內核層（INL）可見細胞數目明顯減少，體積變大，顏色變淺，RGC 數量顯著減少（P<0.05）；與模型組相比，富氫水低、高劑量組大鼠視網膜水腫情況逐漸減輕，損傷得到改善，RGC 數量明顯增加（P<0.05）。見圖3，表3。

表3 富氫水對糖尿病性視網膜病（DR）大鼠伊文思藍（EB）染料滲漏量、視網膜神經節細胞數量的影響/±s

表3 富氫水對糖尿病性視網膜病（DR）大鼠伊文思藍（EB）染料滲漏量、視網膜神經節細胞數量的影響/±s

注：①與空白組比，P<0.05。②與模型組比，P<0.05。

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2.5 各組大鼠視網膜細胞凋亡及相關蛋白的表達情況與空白組相比，模型組大鼠視網膜細胞凋亡率顯著升高（P<0.05）；與模型組相比，富氫水低、高劑量組視網膜細胞凋亡率明顯降低（P<0.05）。

與空白組相比，模型組大鼠視網膜Bax、Bcl-2表達、Bax/Bcl-2比值顯著增加（P<0.05）；與模型組相比，富氫水低、高劑量組視網膜Bax表達、Bax/Bcl-2比值明顯降低，Bcl-2表達明顯增加（P<0.05）。見圖4，5；表4。

表4 富氫水對糖尿病性視網膜病（DR）大鼠凋亡相關蛋白表達的影響/±s

表4 富氫水對糖尿病性視網膜病（DR）大鼠凋亡相關蛋白表達的影響/±s

注：Bax為Bcl-2相關X蛋白，Bcl-2為B淋巴細胞瘤-2，β-actin為β-肌動蛋白。①與空白組比，P<0.05。②與模型組比，P<0.05。

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圖5 各組大鼠視網膜凋亡相關蛋白的表達

2.6 各組大鼠視網膜TXNAIP/NLRP3 通路相關蛋B白的表達與空白組相比，模型組大鼠視網膜TXNIP、NLRP3、IL-1β、Caspase-1 表達顯著增加（P<0.05）；與模型組相比，富氫水低、高劑量組視網膜TXNIP、NLRP3、IL-1β、Caspase-1 表達明顯降低（P<0.05）。見圖6，表5。

表5 富氫水對糖尿病性視網膜病（DR）大鼠視網膜TXNIP、NLRP3通路相關蛋白表達的影響/±s

表5 富氫水對糖尿病性視網膜病（DR）大鼠視網膜TXNIP、NLRP3通路相關蛋白表達的影響/±s

注：TXNIP 為硫氧還蛋白相互作用蛋白，NLRP3 為核苷酸結合寡聚化結構域樣受體蛋白3，IL-1β 為白細胞介素1β，caspase-1 為胱天蛋白酶-1。①與空白組比，P<0.05。②與模型組比，P<0.05。

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圖6 各組大鼠視網膜TXNIP/NA LRP3通路相關蛋白的表達B

2.7 各組大鼠視網膜勻漿中Ang-1、VEGF、IL-1β、IL-6 水平與空白組相比，模型組大鼠視網膜勻漿中Ang-1、VEGF、IL-1β、IL-6 水 平 顯 著 增 加（P<0.05）；與模型組相比，富氫水低、高劑量組視網膜勻漿中Ang-1、VEGF、IL-1β、IL-6 水平明顯降低（P<0.05）。見表6。

表6 富氫水對糖尿病性視網膜病（DR）大鼠視網膜勻漿中血管生成素-1（Ang-1）、血管內皮生長因子（VEGF）、白細胞介素1β（IL-1β）、白細胞介素6（IL-6）水平的影響/±s

表6 富氫水對糖尿病性視網膜病（DR）大鼠視網膜勻漿中血管生成素-1（Ang-1）、血管內皮生長因子（VEGF）、白細胞介素1β（IL-1β）、白細胞介素6（IL-6）水平的影響/±s

注：Ang-1為血管生成素-1，VEGF為血管內皮生長因子，IL-1β為白細胞介素1β，IL-6為白細胞介素6。①與空白組比，P<0.05。②與模型組比，P<0.05。

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3 討論

炎癥與氧化應激在DR 血-視網膜屏障（BRB）通透性中發揮重要作用［16］。在DR 早期，膠質細胞會通過釋放神經營養因子和血管生成因子來保護視網膜免受高血糖引起的損傷，從而使其活動過度，隨著時間的增加，慢性高血糖會引起大量炎性因子釋放，隨后在DR晚期出現明顯的新生血管［7］。研究發現在DR 小鼠視網膜中發現大量小膠質細胞的活化和增殖［17］。小膠質細胞在DR 晚期分泌大量促炎遞質（如IL-1β、IL-6），會損害BRB 并導致視網膜神經元和血管損傷［18］。本研究結果顯示，DR 大鼠視網膜有較多新生血管和血管曲折，血管滲漏嚴重，BRB 通透性顯著增加，且視網膜厚度降低，細胞凋亡增加，視網膜細胞明顯水腫，有大量炎性滲出，神經節細胞層細胞數量減少；說明DR 大鼠視網膜BRB 破壞，神經元和血管出現明顯損傷。研究發現富氫水對代謝綜合征（包括血脂異常，高血糖和肥胖）病人慢性炎癥、氧化應激均有改善作用［12］，并可有效改善多種糖尿病相關標志物水平和全身性DNA 氧化損傷［13］。在本研究中，給予富氫水干預的DR 大鼠，FBG 降低，體質量增加，新血管數量、血管滲漏、BRB 通透性明顯降低，且視網膜厚度增加，細胞凋亡減少，視網膜水腫情況減輕，損傷得到改善；提示富氫水可抑制新生血管形成，降低DR 大鼠視網膜血管通透性，保護BRB和視網膜神經元損傷。

本研究還發現DR 大鼠視網膜中Caspase-1 和IL-1β表達顯著增加。IL-1β可通過自分泌的方式激活Caspase-1放大初始炎癥反應，也會引起視網膜線粒體功能障礙，線粒體DNA 損傷和細胞凋亡。而IL-1β 的成熟及釋放都受到NLRP3 炎癥小體的嚴格調控［19］，而且NLRP3 激活與視網膜細胞損傷和血管通透性顯著相關［20］。在本研究中，與空白組視網膜相比，DR 組視網膜中NLRP3、Caspase-1、IL-1β、IL-6和Bax/Bcl-2 均上調；與以往的研究結果一致，表明NLRP3 炎癥小體在DR 中發揮重要作用。TXNIP/NLRP3 途徑是DR 治療的潛在治療靶標。體外研究發現維生素D3 可通過抑制ROS/TXNIP/NLRP3 炎癥小體途徑發揮對視網膜血管損傷和細胞凋亡的保護作用［21］。Ang-1 和VEGF 是促進血管生成的重要因子，在視網膜血管通透性中起關鍵作用［22］。據報道，TXNIP 增加了糖尿病大鼠視網膜中VEGF 的表達［23］。高糖誘導活性氧的過量產生，導致TXNIP 從其結合蛋白Trx 上解離，然后結合到NLRP3 并引起NLRP3 炎性體的激活［24］。本研究發現，在DR 大鼠視網膜中NLRP3 的上調伴隨著TXNIP 的增加，以及Ang-1 和VEGF 的升高；說明TXNIP/NLRP3 與DR 大鼠視網膜血管通透性密切相關。富氫水可能通過減少TXNIP 的表達抑制NLRP3 活化，增加Bcl-2 表達，抑制Caspase-1、IL-1β、Bax 的表達，并降低Bax/Bcl-2、Ang-1、VEGF 和IL-6 水平；提示富氫水可抑制TXNIP/NLRP3通路的激活。

綜上所述，富氫水可抑制新生血管形成，降低DR 大鼠視網膜血管通透性，減輕視網膜神經元損傷；其作用機制可能與抑制TXNIP/NLRP3 通路的激活有關。而富氫水是通過何種途徑抑制TXNIP/NL?RP3通路的激活有待進一步深入研究。