高效液相色譜法測(cè)定左旋四氫巴馬汀自微乳中左旋四氫巴馬汀含量

梁淑貞，丁少波，鐘李青，何瑞榮

（廣東省東莞市人民醫(yī)院藥學(xué)部，廣東東莞 523000）

高效液相色譜法測(cè)定左旋四氫巴馬汀自微乳中左旋四氫巴馬汀含量

梁淑貞，丁少波，鐘李青，何瑞榮

（廣東省東莞市人民醫(yī)院藥學(xué)部，廣東東莞 523000）

目的建立測(cè)定左旋四氫巴馬汀自微乳含量的高效液相色譜法。方法色譜柱采用Phenomenex Desc Gemini－NX 5 C18柱(250 mm×4.6 mm，5 m，110?)，流動(dòng)相為0.1%磷酸溶液（三乙胺調(diào)pH至6.32）－甲醇（35∶65），檢測(cè)波長(zhǎng)為280 nm，進(jìn)樣量為10 L，流速為1.0 mL／min，柱溫為30℃。結(jié)果左旋四氫巴馬汀質(zhì)量濃度在0.1～1.0 g／L范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好（r＝0.999 9)；精密度試驗(yàn)RSD為0.38%；穩(wěn)定性試驗(yàn)RSD為0.96%；重復(fù)性試驗(yàn)左旋四氫巴馬汀的含量為91.81%，RSD為0.58%；回收試驗(yàn)平均回收率為99.97%，RSD為0.60%（n＝9)。結(jié)論該方法簡(jiǎn)便、靈敏、重復(fù)性好，結(jié)果準(zhǔn)確、可靠，可作為左旋四氫巴馬汀自微乳的質(zhì)量控制方法。

高效液相色譜法；左旋四氫巴馬汀自微乳；含量測(cè)定

左旋四氫巴馬汀是常用的鎮(zhèn)靜、止痛藥，其還對(duì)心肌損傷、腦損傷有保護(hù)作用，具有抗心律失常的功效。也有研究表明，左旋四氫巴馬汀能提高海洛因成癮者的戒毒率[1－2]。但由于其水溶性極差，口服生物利用度極低，故其口服制劑應(yīng)用受到限制[3]。自微乳化藥物傳遞系統(tǒng)(self－emulsifying drug delivery system，SEDDS)是一種新型藥物傳遞系統(tǒng)，藥物溶解于載體中，口服給藥后在胃腸道的蠕動(dòng)下自發(fā)形成O／W型微劑，粒徑10～100 nm。SEDDS能提高難溶性藥物的溶解度，增加細(xì)胞膜的流動(dòng)性，促進(jìn)藥物淋巴吸收，從而提高藥物的生物利用度[4]。為了控制左旋四氫巴馬汀自微乳的質(zhì)量，本研究中建立了左旋四氫巴馬汀自微乳的含量測(cè)定方法，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

LC－20A型高效液相色譜儀(日本島津公司)； SHB－Ⅲ型循環(huán)水式真空泵（鞏義市予華儀器有限公司）；SHA－CA型數(shù)顯水浴恒溫振蕩器（金壇市易辰儀器制造有限公司）；FA2004型電子分析天平；TDL－5A型高速離心機(jī)（上海菲恰爾分析儀器有限公司）；KQ－500DB型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

1.2 試藥

左旋四氫巴馬汀對(duì)照品（中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)為100452－200301）；左旋四氫巴馬汀原料藥（西安開(kāi)來(lái)生物工程有限公司，純度≥98%，批號(hào)為K120105，K120106）；聚乙二醇400(PEG400，西隴化工股份有限公司，批號(hào)為130115）；甲醇為色譜純，其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 自微乳制備

稱(chēng)取左旋四氫巴馬汀原料藥200 mg(主藥)，乙酸異丙酯10 g(輔料)，OP乳化劑10 g(輔料)，PEG400 1 g (輔料)，精密稱(chēng)定，置具塞錐形瓶中，于（37±0.5）℃恒溫水浴振蕩至原料藥完全溶解，制成自微乳，稱(chēng)重。平行制備3批左旋四氫巴馬汀自微乳。

2.2 含量測(cè)定

2.2.1 色譜條件[5－16]

色譜柱：Phenomenex Desc Gemini－NX 5 μ C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm，100?)；流動(dòng)相：0.1%磷酸溶液（三乙胺調(diào)pH至6.32）－甲醇（35∶65）；檢測(cè)波長(zhǎng)：280 nm；進(jìn)樣量：10 μL；流速：1.0 mL／min；柱溫：30℃。

2.2.2 溶液制備

對(duì)照品溶液：取左旋四氫巴馬汀對(duì)照品50 mg，精密稱(chēng)定，置50 mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，制成質(zhì)量濃度為1 g／L的對(duì)照品貯備液。

供試品溶液：取2.1項(xiàng)下左旋四氫巴馬汀自微乳2 g，精密稱(chēng)定，置50 mL容量瓶中，用流動(dòng)相溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得。

空白自微乳溶液：取2.1項(xiàng)下左旋四氫巴馬汀自微乳處方量輔料，置具塞錐形瓶，于37℃恒溫水浴振蕩2 h，取2 g，精密稱(chēng)定，置50 mL容量瓶中，用流動(dòng)相溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.2.3 方法學(xué)考察

系統(tǒng)適用性試驗(yàn)：取2.2.2項(xiàng)下3種溶液，按擬訂色譜條件分別進(jìn)樣測(cè)定，色譜圖見(jiàn)圖1。結(jié)果表明，左旋四氫巴馬汀自微乳對(duì)照品溶液與供試品溶液的保留時(shí)間一致，空白自微乳溶液在相應(yīng)位置無(wú)干擾峰出現(xiàn)，同時(shí)主峰與其他組分分離完全，拖尾因子在0.95～1.05，分離度大于1.5，理論板數(shù)計(jì)算不低于3 000。

線性關(guān)系考察：精密吸取對(duì)照品溶液1.0，2.0，4.0，6.0，8.0，10.0 mL，分別置10 mL容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，制成質(zhì)量濃度分別為0.1，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 g／L的系列對(duì)照品溶液。按擬訂色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，以進(jìn)樣質(zhì)量濃度（X，g／L)為橫坐標(biāo)、峰面積（Y）為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程Y＝436.58X＋0.947 2，r＝0.999 9(n＝6)。結(jié)果表明，左旋四氫巴馬汀質(zhì)量濃度在0.1～1.0 g／L范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

精密度試驗(yàn)：取線性關(guān)系考察項(xiàng)下質(zhì)量濃度為0.4 g／L的對(duì)照品溶液，按擬訂色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積。結(jié)果峰面積分別為176.7，177.0，176.5，176.1，176.9，178.1，平均176.9，RSD為0.38%（n＝6），表明儀器精密度良好。

圖1 高效液相色譜圖

重復(fù)性試驗(yàn)：取同一批（批號(hào)為160404）左旋四氫巴馬汀自微乳，按供試品溶液制備方法制備溶液，按擬訂色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果左旋四氫巴馬汀的含量分別為90.97%，91.92%，92.56%，92.11%，91.64%，91.74%，平均91.81%，RSD為0.58%（n＝6），表明方法重復(fù)性良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：取同一供試品溶液于室溫放置，分別于0，2，4，6，8，10，12 h時(shí)按擬訂色譜條件進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果左旋四氫巴馬汀峰面積分別為164.8，166.9，165.9，167.2，168.8，168.9，平均167.1，RSD為0.96%（n＝6），表明供試品溶液在室溫下12 h內(nèi)穩(wěn)定。

加樣回收試驗(yàn)：取同一批（批號(hào)為160404）左旋四氫巴馬汀自微乳1 g，共9份，精密稱(chēng)定，置50 mL容量瓶中，并分別精密加入左旋四氫巴馬汀對(duì)照品6，8，10 mg，按擬訂色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算回收率。結(jié)果見(jiàn)表1。

2.2.4 樣品含量測(cè)定

取3批（批號(hào)為160404，160405，160406）左旋四氫巴馬汀自微乳，依法制備供試品溶液，進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算含量。結(jié)果見(jiàn)表2。

3 討論

3.1 流動(dòng)相選擇

左旋四氫巴馬汀不溶于水，可溶于甲醇，故用含65%甲醇的流動(dòng)相溶解，流動(dòng)相中加入三乙胺可改善主峰的拖尾現(xiàn)象。該制劑是O／W型乳劑，在流動(dòng)相中溶解性能很好，且不影響左旋四氫巴馬汀的含量測(cè)定。曾考察甲醇－磷酸鹽溶液、甲醇－水溶液、甲醇－磷酸溶液、乙腈－磷酸溶液，有機(jī)相占60%以上，大部分用了三乙胺等掃尾劑。甲醇與水的流動(dòng)相組合預(yù)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，峰形不佳；甲醇－磷酸鹽流動(dòng)相系統(tǒng)峰形較好，樣品測(cè)定也未見(jiàn)有干擾，但流動(dòng)相對(duì)于樣品的溶解效果不是很好，需要超聲處理；甲醇－磷酸溶液流動(dòng)相系統(tǒng)未加三乙胺時(shí)峰形不好，考慮加入掃尾劑。采用單因素對(duì)照試驗(yàn)優(yōu)選加入三乙胺的量，最終流動(dòng)相pH為6.3時(shí)，峰形最佳，且流動(dòng)相對(duì)供試品的溶解較好。

表1 左旋四氫巴馬汀加樣回收試驗(yàn)結(jié)果（n＝9）

表2 樣品含量測(cè)定結(jié)果(n＝3，%)

3.2 處方篩選

通過(guò)溶解度試驗(yàn)篩選油相、乳化劑和助乳化劑，并以乳化時(shí)間、色澤和乳化顆粒形態(tài)為指標(biāo)，通過(guò)偽三相圖的繪制，篩選最佳處方及配比，制備空白自微乳及左旋四氫巴馬汀自微乳。

3.3 波長(zhǎng)選擇

有文獻(xiàn)顯示，通過(guò)全波長(zhǎng)掃描試驗(yàn)，結(jié)果281 nm波長(zhǎng)處有最大吸收峰。故選擇280 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)，且無(wú)干擾峰出現(xiàn)，方法學(xué)考察結(jié)果較好。

左旋四氫巴馬汀屬生物堿類(lèi)，難溶于水，口服生物利用度較低，受光熱極易氧化為巴馬汀，故含量測(cè)定時(shí)對(duì)樣品的處理不能采用加熱溶解的方式。高效液相色譜法測(cè)定含量快速、準(zhǔn)確，樣品的處理經(jīng)過(guò)溶解即可。方法學(xué)考察各項(xiàng)指標(biāo)符合規(guī)定，精密度、穩(wěn)定性、準(zhǔn)確度都符合要求，可作為乳劑生產(chǎn)過(guò)程的質(zhì)量控制和檢測(cè)方法，也可作為自微乳成品的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。

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Content Determination of L－Tetrahydropalmatine in L－Tetrahydaopalmatine Self－Microemulsion by HPLC

Liang Shuzhen,Ding Shaobo,Zhong Liqing,He Ruirong
(Department of Pharmacy,Dongguan People′s Hospital,Dongguan,Guangdong,China523000)

Objective To establish a content determination method of L－tetrahydropalmatine in L－tetrahydaopalmatine Self－Microemulsion by HPLC.MethodsThe column was Phenomenex Desc Gemini－NX 5 μ C18column(250 mm×4.6 mm,5 μm,110?);the mobile phase consisted of 0.1%phosphoric acid solution(pH adjusted to 6.32 with triethylamine)and methanol(35∶65);the detection wavelength was set at 280 nm;the injection volume was 10 μL;the flow rate was 1.0 mL／min and the column temperature was 30℃.ResultsThe calibration curve was linear in the range of 0.1 to 1.0 g／L(r＝0.999 9);RSD of accuracy was 0.38%,and the RSD of stability was 0.96%.The content of L－tetrahydropalmatine was 91.81%and the RSD was 0.58%in the repeatability test.The recovery rate of L－tetrahydropalmatine was 99.97%and the RSD was 0.60%(n＝9)in the recovery test.ConclusionThe method is simple,sensitive,reproducible,accurate and reliable,which can be used as a quality control method for L－tetrahydropalmatine self－microemulsion.

HPLC;L－tetrahydropalmatine Self－Microemulsion;content determination

R927.2；R971＋.3

A

1006－4931(2017)01－0028－03

10.3969／j.issn.1006－4931.2017.01.009

2016－10－01；

2016－11－21)

梁淑貞，大學(xué)本科，主管藥師，主要從事醫(yī)院藥學(xué)工作，（電子信箱）120714659＠qq.com。