葛根異黃酮聯合維生素D對去勢大鼠骨質疏松的防治效果

何正言，梅浩，鐘志年

（廣東省韶關市第一人民醫院，廣東韶關 512000）

葛根異黃酮聯合維生素D對去勢大鼠骨質疏松的防治效果

何正言，梅浩，鐘志年

（廣東省韶關市第一人民醫院，廣東韶關 512000）

目的探討葛根異黃酮聯合維生素D對去勢大鼠骨質疏松的防治效果及最佳劑量。方法選擇3月齡清潔級Wistar雄性大鼠60只，按治療方法的不同分為對照組、維生素D組、低劑量聯合組、中劑量聯合組和高劑量聯合組，各12只。去勢造模成功3個月后開始灌胃給藥，其中對照組不用藥，維生素D組予維生素D 0.2 mg／kg，低劑量聯合組予葛根異黃酮25 mg／kg＋維生素D 0.2 mg／kg，中劑量聯合組予葛根異黃酮50 mg／kg＋維生素D 0.2 mg／kg，高劑量聯合組予葛根異黃酮100 mg／kg＋維生素D 0.2 mg／kg。各組大鼠均每周二和每周四灌藥1次，總給藥時間為6個月。實驗期末斷頭處死大鼠，測量股骨長度及質量，并檢測骨鈣含量和股骨骨密度。結果股骨長度，中、高劑量聯合組均顯著高于對照組、維生素D組及低劑量聯合組（P＜0.05），低劑量聯合組與對照組、維生素D組比較均無顯著性差異（P＞0.05）；骨質量和骨鈣含量，低、中、高劑量聯合組均顯著高于對照組、維生素D組（P＜0.05），中、高劑量聯合組顯著高于低劑量聯合組（P＜0.05）；中、高劑量聯合組股骨長度、骨質量、骨鈣含量比較均無顯著性差異（P＞0.05）。結論中、低劑量葛根異黃酮聯合維生素D對去勢大鼠骨質疏松的防治效果較理想。

骨質疏松癥；葛根異黃酮；維生素D；去勢大鼠；防治效果

骨質疏松癥為老年人高發的骨代謝性疾病，以骨量流失和骨組織結構破壞為主要特征，隨著骨質病理改變的逐漸加重，患者骨骼脆性增加，極易發生骨折且不易愈合，影響患者生活質量[1]。當前，骨質疏松癥治療以服用鈣劑、維生素D及防骨量流失藥物為主，但療效欠佳[2]。中醫在補腎健骨方面的研究中，發現了較多健骨壯骨中藥材及經典方劑，在骨質疏松癥防治方面取得了較好的療效。葛根是中醫治療項背僵痛的一味良藥，現代藥理學研究發現其提取物葛根異黃酮具有雌激素樣作用，可有效減少骨鈣流失[3－4]。為此，本研究中選擇60只3月齡清潔級Wistar雄性大鼠作為受試對象，對不同劑量葛根異黃酮聯合維生素D灌藥后的股骨長度、骨質量、骨鈣含量和骨密度進行了對比分析?，F報道如下。

1 資料與方法

1.1 動物、儀器與試藥

1.1.1 動物

選擇3月齡清潔級Wistar雄性大鼠60只，體質量180～220 g，廣東省實驗動物研究中心，合格證號為SCXK（粵）2006－0005。所有動物飼養于實驗中心動物室，環境溫度為20～25℃，所有大鼠購入后先適應性飼養2周，去勢手術前后均自由飲水、攝食。本研究經實驗動物倫理委員會批準。

1.1.2 儀器

MNT－150型游標卡尺（德國美耐特公司）；JJ200型電子分析天平（美國雙杰電子有限公司）；原子吸收分光光度計（上海精密科學儀器有限公司）；SD－1000 C型骨礦物儀。

1.1.3 試藥

葛根異黃酮（純度95.0%，杭州東岸醫藥科技有限公司，批號為20150618）；維生素D滴劑（青島雙鯨藥業有限公司，國藥準字H20113033，批號為20151012，規格為每粒含維生素D 400 U）。

1.2 處理方法

60只大鼠按治療方式的不同分為對照組，維生素D組，低、中、高劑量聯合組，各12只。常規腹腔麻醉后，無菌條件下完成去勢手術，術后5 d內常規抗感染，自由飲水、攝食。待大鼠去勢造模成功，恢復飼養3個月后開始灌胃給藥。其中，對照組不用藥，維生素D組予維生素D 0.2 mg／kg，低劑量聯合組予葛根異黃酮25 mg／kg＋維生素D 0.2 mg／kg，中劑量聯合組予葛根異黃酮50 mg／kg＋維生素D 0.2 mg／kg，高劑量聯合組予葛根異黃酮100 mg／kg＋維生素D 0.2 mg／kg。各組大鼠均于每周二和每周四灌藥1次，總給藥時間為6個月。除對照組外，維生素D組及低、中、高劑量聯合組均將葛根異黃酮＋生理鹽水稀釋至0.5%的溶液灌胃，維生素D直接灌胃，無需稀釋，試驗期間各組大鼠均在相同飼養條件下喂養普通飼料。

1.3 觀察指標及檢測方法

試驗期末斷頭處死大鼠，取左側股骨，用游標卡尺測量股骨長度，用電子分析天平稱定質量；用原子吸收分光光度計測定骨鈣含量。股骨骨密度（BMD）用SD－1000C骨礦物儀和Micro－CT測量，分別測定股骨中心和遠心骨密度。

1.4 統計學處理

2 結果

2.1 股骨長度

結果見表1。中、高劑量聯合組股骨長度均顯著高于對照組、維生素D組及低劑量聯合組，差異有統計學意義（P＜0.05）；低劑量聯合組與對照組、維生素D組比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。

2.2 股骨骨質量和骨鈣含量

結果見表1。低、中、高劑量聯合組股骨骨質和骨鈣含量均顯著高于對照組、維生素D組，中、高劑量聯合組均顯著高于低劑量聯合組，差異均有統計學意義（P＜0.05）。中、高劑量聯合組股骨長度、骨質量、骨鈣含量比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）。

表1 各組大鼠股骨長度、骨質量、骨鈣含量比較（±s，n＝12）

表1 各組大鼠股骨長度、骨質量、骨鈣含量比較（±s，n＝12）

注：與對照組或維生素D組比較， P＜0.05；與低劑量聯合組比較，＃P＜0.05。表2同。

組別對照組維生素D組低劑量聯合組中劑量聯合組高劑量聯合組股骨長度（cm）3.29±0.24 3.33±0.19 3.32±0.21 4.18±0.26 4.20±0.19骨質量（g）0.49±0.06 0.60±0.05 0.71±0.03 0.73±0.03＃0.73±0.04＃骨鈣含量（mg／g）140.25±12.14 178.69±10.36 231.04±12.17 250.36±11.26＃252.14±13.14＃

2.3 股骨中心和遠心骨密度

結果見表2。低、中、高劑量聯合組股骨中心和遠心骨密度均顯著高于對照組和維生素D組，中、高劑量聯合組均顯著高于低劑量聯合組，差異均有統計學意義（P＜0.05）；中、高劑量聯合組比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。

表2 各組大鼠股骨中心和遠心的骨密度比較（±s，g／cm2，n＝12）

表2 各組大鼠股骨中心和遠心的骨密度比較（±s，g／cm2，n＝12）

組別對照組維生素D組低劑量聯合組中劑量聯合組高劑量聯合組中心骨密度0.18±0.02 0.21±0.01 0.24±0.03 0.28±0.02＃0.29±0.03＃遠心骨密度0.19±0.02 0.21±0.03 0.26±0.02 0.31±0.03＃0.32±0.04＃

3 討論

葛根異黃酮是用于女性產后、更年期時補充雌激素的一類中藥提取物，現代藥理學研究發現，其可調節破骨細胞和成骨細胞活性，并促進其增殖，進而維持骨量的穩定[3－4]；還可激活骨細胞骨形態發生蛋白－2 （BMP－2）的活性，維持骨細胞鈣質和蛋白質的動態平衡，防治骨質流失效果較好。目前，關于葛根異黃酮聯合維生素D治療骨質疏松療效的研究相對不足，尤其是其對去勢大鼠骨質疏松的防治效果尚有待探討[5－6]。

本研究結果顯示，中、高劑量聯合組股骨長度均顯著高于對照組、維生素D組及低劑量聯合組（P＜0.05），而低劑量聯合組與對照組、維生素D組比較均無顯著性差異（P＞0.05）；而骨質量和骨鈣含量方面，低、中、高劑量聯合組均顯著高于對照組和維生素D組（P＜0.05），且中、高劑量聯合組均顯著高于低劑量聯合組，但中、高劑量聯合組股骨長度、骨質量、骨鈣含量比較均無顯著性差異（P＞0.05）?？梢姡?、高劑量葛根異黃酮改善股骨長度、骨質量、骨鈣含量的效果均較好，且顯著優于低劑量聯合組，更有利于改善骨質疏松癥。動物試驗報道顯示，葛根異黃酮中、高劑量（25 mg／kg 或50 mg／kg）聯合維生素D 0.2 mg／kg對去勢大鼠股骨長度、骨質量、骨鈣含量的促增長效果較明顯，與本研究中低劑量聯合組試驗效果較為相似，提示葛根異黃酮中、高劑量（25 mg／kg或50 mg／kg）聯合維生素D較合理[7－8]。低、中、高劑量聯合組骨中心骨密度和遠心骨密度均顯著高于對照組及維生素D組（P＜0.05）；且中、高劑量聯合組骨中心骨密度和遠心骨密度均顯著高于低劑量聯合組（P＜0.05），但中、高劑量聯合組比較均無顯著性差異（P＞0.05）。可見，中劑量葛根異黃酮改善骨密度效果更理想。

相關研究顯示，葛根異黃酮可介導內分泌、自分泌和旁分泌性的單鏈多肽等雌激素引起的骨生成反應，同時還可促進大鼠成骨細胞合成和分泌胰島素樣生長因子1（IGF－1），而IGF－1可刺激骨細胞及成軟骨細胞的分化和增殖，進而促進骨生成，修復骨質疏松癥骨量流失，同時可促進骨生長，糾正骨代謝失衡，對于骨質疏松的發生與發展有良好的抑制作用[9－10]。

目前，骨質疏松癥治療藥物中以補充鈣質、減少骨質流失、促進鈣沉積藥物為主，這類藥物僅能補充骨質，促進鈣沉積，但骨細胞形成的關鍵因素——Ⅰ型膠原仍然缺乏，骨質較難以形成，骨骼脆性較強，仍易發生骨折，骨代謝平衡與骨量維持仍然較差[11－12]。

近年來，有文獻報道顯示，葛根異黃酮可促進Ⅰ型膠原的合成，還可促進20余種膠原／非膠原蛋白質、骨代謝局部調節因子等成骨細胞促生物質生成，該作用機制與IGF－1生成、成骨細胞內BMP－2表達增高等密切相關。目前已知葛根異黃酮可促進Ⅰ型膠原的合成，增強堿性磷酸酶的活性，刺激骨細胞產生骨鈣素，抑制膠原蛋白酶的活性，從而促進鈣沉積，并與Ⅰ型膠原結合，完成了成骨細胞的高效轉化，更好地修補破骨細胞骨吸收形成陷窩，損傷修復作用較強，真正實現了骨代謝平衡與骨量維持[13－14]。

本研究中，去勢大鼠應用葛根異黃酮聯合維生素D治療后，股骨中心骨密度和遠心骨密度大幅提升，與葛根異黃酮可促進Ⅰ型膠原合成、非膠原蛋白質合成、骨代謝局部調節因子激活，增強堿性磷酸酶的活性、抑制膠原蛋白酶的活性等藥理作用機制密切相關，且中、低劑量即可較好地改善骨密度，生物利用度良好，臨床應用前景可期。但不同劑量葛根異黃酮改善骨密度效果尚存在一定爭議，主要集中在中、高劑量方面，較多文獻研究認為，高劑量改善骨密度效果較理想，但從本研究來看，中、高劑量葛根異黃酮聯合維生素D改善骨密度差異性較小，尚有待進一步深入研究[15－16]。

綜上所述，中、低劑量葛根異黃酮聯合維生素D對去勢大鼠骨質疏松的防治效果較理想，為老年男性骨質疏松癥防治帶來了新的希望。

[1]賀印旎，朱新英，李東陽.葛根異黃酮聯合維生素D對去勢大鼠T淋巴細胞亞群的影響[J].南華大學學報：醫學版，2009，37（2）：153－155.

[2]周艷，扶曉明，賀棟梁，等.不同劑量葛根異黃酮聯合維生素D對去勢大鼠骨質疏松的防治[J].實用醫學雜志，2009，25（23）：3944－3946.

[3]扶曉明，周艷，李梓民，等.葛根異黃酮聯合維生素D防治骨質疏松的協同效應（英文）[J].中國組織工程研究與臨床康復，2011，15（11）：2083－2086.

[4]鄭紅星，祁珊珊，曾海濤.葛根異黃酮聯合VitD3對去卵巢骨質疏松大鼠骨組織構造的影響[J].中國骨質疏松雜志，2016，22（7）：832－836.

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[6]孔蓓蓓，劉連起，王新祥.近十年葛根防治骨質疏松癥的研究進展[J].環球中醫藥，2012，5（3）：226－230.

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Effect of Puerarin Combined with Vitamin D on Osteoporosis in Ovariectomized Rats

He Zhengyan，Mei Hao，Zhong Zhinian

（The First People′s Hospital of Shaoguan，Shaoguan，Guangdong，China512000）

ObjectiveTo investigate the effect of puerarin combined with vitamin D on the prevention and treatment of osteoporosis in ovariectomized rats.M ethods60 male rats of clean grade Wister in March were divided into control group，vitamin D group，low dose group，middle dose group and high dose combination group，12 rats in each group.60 cases of ovariectomized rat model were successfully made.3 months after，the rats in control group were not given any drugs；the vitamin D group was given vitamin D 0.2 mg／kg；the low dose combination group was treated with puerarin isoflavone 25 mg／kg＋vitamin D 0.2 mg／kg；the middle dose combination group was givenpuerariaisoflavone 50mg／kg＋vitaminD 0.2mg／kg；thehigh dosecombinationgroup wasgiven puerariaisoflavone 100 mg／kg＋vitamin D 0.2 mg／kg.The rats in each group were given once every Tuesday and Thursday，the total administration time was 6 months.The rats were sacrificed at the end of the experiment.The femur length and mass were measured.The bone calcium content and bone mineral density were measured.ResultsThe femur length in the middle an high－dose combination group were both obviously longer than the control group and vitamin D group and the low dose group（P＜0.05），but there was no significant difference between the low dose group，the vitamin D group，and the control group（P＞0.05）.The bone mass and bone calcium content in the low，middle and high dose combination groups were obviously higher than the control group and the vitamin D group（P＜0.05）；and the middle and high dose combination group were significantly higher than the low dose group（P＜0.05）.There was no significant differenceinfemurlength，bonemassandbonecalciumcontentbetweenthemiddleandhighdosegroups（P＞0.05）.ConclusionThe effect of middle and low dose of isoflavones combined with vitamin D on osteoporosis in ovariectomized rats is more ideal.

osteoporosis；puerarin；vitamin D；ovariectomized rats；prevention and cure effect

R285.5；R282.71

A

1006－4931(2017)02－0024－03

10.3969／j.issn.1006－4931.2017.02.007

2016－10－07；

2016－11－28)

何正言（1977－），男，碩士研究生，主治醫師，主要從事骨科疾病的診療工作，（電子信箱）69070496＠qq.com。