齊口裂腹魚CDH5基因特性及其對溫和氣單胞菌感染的應答

段薈芹 王利

（1. 西南民族大學 青藏高原研究院，成都 610041；2. 西南民族大學 生命科學與技術(shù)學院，成都 610041）

齊口裂腹魚CDH5基因特性及其對溫和氣單胞菌感染的應答

段薈芹1王利2

（1. 西南民族大學 青藏高原研究院，成都 610041；2. 西南民族大學 生命科學與技術(shù)學院，成都 610041）

探討齊口裂腹魚（Schizothorax prenanti）血管內(nèi)皮黏附分子（Cadherin 5，CDH5）的基因特性。用生物信息學軟件分析齊口裂腹魚CDH5基因序列，用Real-time PCR檢測CDH5基因在齊口裂腹魚感染溫和氣單胞菌后0 h、24 h和 48 h的表達變化。獲得CDH5基因全長cDNA序列，GenBank登錄號為KT329441。該序列長4 825 bp，開放閱讀框長2 313 bp，編碼770個氨基酸。蛋白預測結(jié)果顯示，該蛋白相對分子量為85.19 kD，等電點為5.01。存在信號肽序列，二級結(jié)構(gòu)以隨機卷曲、延伸鏈、α-螺旋為主。齊口裂腹魚CDH5氨基酸序列與斑馬魚同源性達74%，與人的相似性為43%。CDH5在感染溫和氣單胞菌后在各組織中均有表達。脾臟中CDH5基因在24 h表達量顯著高于0 h和48 h（P＜0.05）。肝臟、腎臟和肌肉中CDH5在48 h的表達量均顯著高于24 h（P＜0.05）。心臟和腸道中CDH5基因在48 h的表達量顯著高于0 h（P＜0.05）。CDH5基因在可能參與了齊口裂腹魚抗溫和氣單胞菌感染的免疫應答，為深入研究CDH5在齊口裂腹魚中的功能奠定基礎(chǔ)。

CDH5；齊口裂腹魚；組織表達；溫和氣單胞菌

血管內(nèi)皮黏附分子（Cadherin 5，CDH5）是血管內(nèi)皮細胞中的特異性的黏附分子，為黏附分子家族中的成員。其作用主要表現(xiàn)在能夠介導細胞之間的黏附、調(diào)控細胞信號轉(zhuǎn)導（如MAPK信號通路）、調(diào)節(jié)細胞周期和凋亡來調(diào)控細胞增殖、存活和分化等［1-3］。目前，CDH5已在斑馬魚（Danio rerio）、人血管內(nèi)皮、小鼠、豬中被發(fā)現(xiàn)［3，4］。關(guān)于CDH5基因的報道主要集中在克隆、鑒定、啟動子調(diào)控和免疫調(diào)控等方面［5-12］。齊口裂腹魚（Schizothorax prenanti），又稱雅魚，屬鯉科（Cyprinidae）、裂腹魚亞科、裂腹魚屬，主要分布在我國長江上游的岷江、金沙江、青衣江、大渡河等水域，是我國特有的冷水性經(jīng)濟魚類［13，14］，具有極高的營養(yǎng)價值和經(jīng)濟價值。近年來，隨著養(yǎng)殖戶養(yǎng)殖面積的擴大，細菌性疾病逐年發(fā)生，而溫和氣單胞菌（Aeromomas sobria）是一種常見的人魚共患的致病菌，養(yǎng)殖實踐表明該菌已經(jīng)對漁業(yè)生產(chǎn)造成了較大的經(jīng)濟損失。因此，需要從基礎(chǔ)研究的角度發(fā)掘魚的免疫相關(guān)基因，探討其抗細菌免疫機制，從而為漁業(yè)生產(chǎn)的疾病控制服務。目前，有關(guān)齊口裂腹魚免疫相關(guān)基因的研究主要有過氧化物酶體增殖物激活受體γ輔助活化因子1α（peroxisome proliferator-activated receptor γ coactivator-1α，PGC-1α）［15］、MyD88［16］、心 型 脂 肪 酸 結(jié) 合 蛋 白（heart fatty acid binding protein，H-FABP）［17］、同種移植炎癥因子（allograft inflammatory factor- 1，AIF- 1）［18］等，尚未見CDH5基因的報道。因此，本實驗從課題組已經(jīng)構(gòu)建的齊口裂腹魚脾臟的轉(zhuǎn)錄組中獲得CDH5基因的全長cDNA序列，采用Real-time PCR分析齊口裂腹魚感染溫和氣單胞菌后CDH5基因的表達量變化，旨在為研究CDH5基因在魚類中的作用積累科學資料。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 健康的齊口裂腹魚來源于四川雅安某養(yǎng)殖場，共20尾，體長35-40 cm，體重390-410 g。

1.1.2 實驗試劑 溫和氣單胞菌株（WS6202）由本實驗室留存，Trizol試劑購于Invitrogen公司，異丙醇、DEPC溶液、氯仿、RocketScriptTMRT PreMix購于BIONEER公司，IQTMSYBR Green Supermix購于BIO-RAD公司。

1.2 方法

1.2.1 齊口裂腹魚感染實驗 將實驗室保存的溫和氣單胞菌株常溫復蘇，參照麥氏比濁法制成濃度為2.0×108CFU/mL的菌懸液，取1 mL菌液注射魚腹腔內(nèi)，保持28℃水溫，用充氧泵間歇供氧。分別在0 h、24 h和48 h隨機采3尾，記為0 h組、24 h組和48 h組并收集不同組魚脾臟、心臟、腎臟、肝臟、肌肉、腸道6種組織于液氮快速冷凍后，-80℃保存。

1.2.2 RNA提取及cDNA合成 將各組魚的脾臟、心臟、肝臟、腎臟、肌肉、腸道組織從-80℃冰箱中取出，用Trizol提RNA，用1%瓊脂糖凝膠電泳及分光光度計檢測RNA提取質(zhì)量和完整性。按照TaKaRa公司的PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser（Perfect Real Time）試劑盒說明書進行cDNA的合成。合成的各組組織cDNA放于-20℃冰箱保存。

1.2.3 CDH5基因的生物信息學分析 用DNAStar軟件分析該序列，用NCBI數(shù)據(jù)庫中的Blastp進行序列比對，用ORF Finder 對開放性閱讀框進行分析，齊口裂腹魚CDH5基因氨基酸序列分析應用DNAMAN軟件，用ExPASy程序中的Interproscan、SOPMA、TMpred、SignalP、Smart、NetPhos 2.0、NetNGlyc 1.0分別對蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)、二級結(jié)構(gòu)、跨膜螺旋特征、信號肽、結(jié)構(gòu)域、磷酸化位點和糖基化位點進行預測分析。系統(tǒng)進化樹的構(gòu)建應用Clustalx1.83和Mega5.0軟件。

1.2.4 引物設(shè)計 參照轉(zhuǎn)錄組中CDH5基因序列，用Primer Premier 5.0設(shè)計定量引物，CDH5引物序列Primer A：5'-CCGAGAGAAACAGAGTCAGTAT-3'，Primer B：5'-AGTCACAATCGTAGTAGCAGAAT-3 '，齊口裂腹魚18S rRNA內(nèi)參基因引物序列Primer F：5'-GGAATGAGCGTATCCTAAACCC- 3'，Primer R：5'-CTCCCGAGATCCAACTACAAGC- 3'，引物由生工生物工程（上海）有限公司合成。

1.2.5 CDH5基因定量分析 分別以不同組6種組織的cDNA為模板，每個樣品3個平行。以齊口裂腹魚18S rRNA基因作內(nèi)參，進行CDH5定量檢測。10 μL 反應體系：ddH2O 1.2 μL，Primer F 0.4 μL，Primer R 0.4 μL，SYBR Green? Supermix 6 μL，模板2 μL。反應程序：95℃ 5 min；95℃ 10 s，59℃ 20 s，72℃ 30 s，39個循環(huán)；65℃ 5 s；95℃ 10 s。對溶解曲線分析后，所得實驗數(shù)據(jù)用-2ΔΔCt法計算，并利用SPSS 17.0軟件中的單因素方差分析（One-way ANOVA）對CDH5基因進行顯著性分析。

2 結(jié)果

2.1 CDH5基因序列分析

從轉(zhuǎn)錄組獲得CDH5基因的全長cDNA序列（GenBank登錄號為：KT329441），該序列長4 825 bp，5'-UTR長346 bp，3'-UTR長2 165 bp，有典型的加尾信號AATAAA及PloyA尾。開放閱讀框長2 313 bp，編碼770個氨基酸（圖1）。在線軟件預測顯示，該蛋白相對分子量為85.19 kD，等電點5.01。帶負電荷殘基數(shù)（Asp+Glu）為111，帶正電荷殘基數(shù)（Arg+Lys）為83。脂肪系數(shù)為81.38。不穩(wěn)定系數(shù)為38.71，為穩(wěn)定蛋白。CDH5蛋白出現(xiàn)頻率較高的氨基酸有Ser（9.1%）、Asp（8.6%）、Leu（7.4%）、Ile（7.1%）。總平均親水性為-0.421。TMpred跨膜螺旋分析CDH5蛋白跨膜特征，參照跨膜拓撲學分析模型，要求當分值大于500時該蛋白有跨膜螺旋推測，CDH5蛋白有2個明顯的跨膜螺旋區(qū)。

SigalP信號肽分析表明，該蛋白存在一個由29個氨基酸組成的信號肽序列。該序列位于第1-29位，切割位點在29-30位氨基酸之間，表明該蛋白為分泌型蛋白。CDH5蛋白二級結(jié)構(gòu)預測（圖2）顯示，該蛋白隨機卷曲占41.17%、延伸鏈占26.75%，α-螺旋占22.73%，β-轉(zhuǎn)角占9.35%。Smart預測CDH5蛋白結(jié)構(gòu)域顯示，該蛋白包括5個重復鈣黏蛋白結(jié)構(gòu)域（CA domain，黃色部分）、2個跨膜域（Transmembrane region，藍色部分）和4個低組分復雜性區(qū)域（Low complexity，紫色部分）（圖3）。NetPhos 2.0蛋白磷酸化位點預測顯示，CDH5蛋白氨基酸序列有57個磷酸化位點，分別位于絲氨酸（Ser）、酪氨酸（Tyr）和蘇氨酸（Thr）殘基上，即有42個絲氨酸磷酸化位點，6個酪氨酸磷酸化位點和9個蘇氨酸磷酸化位點。NetNGlyc 1.0糖基化位點預測顯示，該蛋白有6個N-糖基化位點，分 別 為（121NLTA124）、（138NDTF141）、（197NGTD200）、（480NRSH483）、（521NFTL524）和（529NNTA532）。

2.2 CDH5同源性及系統(tǒng)進化樹分析

用NCBI中的Blastp程序進行比對分析顯示，齊口裂腹魚CDH5氨基酸序列與其它物種的相似性大約為41%-74%，其中與斑馬魚（D. rerio）相似性最高，達74%，與白斑狗魚（Esox lucius）相似性為53%，與人（Homo sapiens）的相似性為43%。用DNAMAN軟件對不同物種CDH5氨基酸序列進行同源性比對（圖4）顯示，齊口裂腹魚CDH5氨基酸序列在不同物種中比較保守。用Mage 5.0軟件，選取相似性較高的序列構(gòu)建系統(tǒng)進化樹（圖5）。在系統(tǒng)進化樹上，齊口裂腹魚CDH5氨基酸序列與斑馬魚CDH5親緣關(guān)系最密切，其最先與斑馬魚聚為一類，隨后與白斑狗魚聚為一類，最后再與其他哺乳類動物聚為一類。

2.3 齊口裂腹魚CDH5對溫和氣單胞菌感染的應答

以18S rRNA基因作為內(nèi)參進行Real-time PCR反應，結(jié)果（圖6）顯示，CDH5基因在健康齊口裂腹魚各組織中均有不同程度的表達。在0 h各組織的表達量大小順序為肝臟＞脾臟＞肌肉＞心臟＞腎臟＞腸道。在溫和氣單胞菌感染后，脾臟中CDH5基因在24 h表達量顯著高于0 h和48 h（P＜0.05）。肝臟、腎臟和肌肉中CDH5在48 h的表達量均顯著高于24 h（P＜0.05）。心臟和腸道中CDH5基因在48 h的表達量顯著高于0 h（P＜0.05）。

3 討論

鈣黏素（Cadherin，CDH）是一種重要的黏附分子，最初被定義為依賴Ca2+的細胞黏附分子，其作為鈣黏素家族成員之一，主要作用為介導上皮細胞之間的粘附，參與細胞分化等過程［19］。Dejana等［6］體外研究顯示，CDH5在內(nèi)皮細胞生物學功能研究方面具有重要作用，主要表現(xiàn)在調(diào)節(jié)細胞黏附，細胞增殖、存活，細胞形狀，細胞運動性，調(diào)節(jié)信號傳導途徑及調(diào)控轉(zhuǎn)錄基因等方面。Schubert等［20］研究顯示，CDH5基因是由糖皮質(zhì)激素所調(diào)節(jié)，且與中心性漿液性脈絡(luò)膜視網(wǎng)膜病變有關(guān)，可以增加脈絡(luò)膜血管的滲透性。Vestweber 等［21］研究表明CDH可通過多種途徑調(diào)節(jié)細胞增殖及凋亡，對胚胎發(fā)育過程也起重要作用。

圖1 CDH5基因CDS區(qū)核苷酸及氨基酸序列（星號代表終止密碼子）

圖2 CDH5蛋白二級結(jié)構(gòu)預測

圖3 CDH5蛋白結(jié)構(gòu)域預測

迄今為止，CDH5基因在魚類中僅見在斑馬魚和白斑狗魚中的報道。吳西軍等［4］從斑馬魚胚胎中克隆出CDH5全長序列為3 061 bp，編碼區(qū)長2 301 bp，本實驗獲得齊口裂腹魚CDH5基因全長為4 825 bp，編碼區(qū)長2 313 bp，造成此差異的原因可能是由于不同品種的CDH5基因的片段大小存在一定的差異，或是不同的環(huán)境壓力下變異程度可能出現(xiàn)差異有關(guān)。生物信息學分析顯示，CDH5蛋白不穩(wěn)定系數(shù)為38.71，而穩(wěn)定蛋白標準為不穩(wěn)定系數(shù)小于40，由此可知，CDH5蛋白為穩(wěn)定蛋白［23］。CDH5蛋白存在1個信號肽序列和2個明顯的跨膜螺旋區(qū)，表明此蛋白可能在細胞質(zhì)中合成，分泌過程后將信號肽切除，從而形成具生物學功能的蛋白，為分泌型蛋白［24］。Smart預測CDH5蛋白結(jié)構(gòu)域顯示，CDH5包括一個保守的由5個串聯(lián)重復的胞外鈣黏蛋白結(jié)構(gòu)域、2個跨膜域和4個低組分復雜性區(qū)域。這和王賓等［22］報道的在胞外域，經(jīng)典鈣黏蛋白有5個同源染色體重復序列片段相一致，但有1個跨膜域有所不同，原因可能是由于物種不同所造成。系統(tǒng)進化樹分析顯示，齊口裂腹魚與斑馬魚聚為一簇，表明彼此親緣關(guān)系較為密切。基因在不同組織中不同時間點的表達特征可能是其功能的一種表現(xiàn)，實時熒光定量PCR顯示，CDH5基因在健康齊口裂腹魚各組織中均有表達，也提示CDH5可能具有多種生物學功能。雖然CDH5基因廣泛分布，但其表達量存在一定差異。在溫和氣單胞菌感染后，CDH5基因在脾臟中24 h表達量最高，這表明該基因在此時間參與了對溫和氣單胞菌的應答，而在48 h表達量降低，但與0 h相比，也有一定程度的增加。這說明CDH5基因在48 h也可能參與了機體抵抗細菌侵染的免疫反應。

圖4 CDH5蛋白氨基酸序列多重比對（部分）

圖5 CDH5氨基酸序列與其他動物進化樹分析

圖6 CDH5基因在不同組織中的表達量

4 結(jié)論

本實驗獲得齊口裂腹魚CDH5基因的cDNA全長序列，通過生物信息學分析，結(jié)合其在健康齊口裂腹魚各組織的表達情況以及溫和氣單胞菌刺激下的表達變化，初步揭示其在齊口裂腹魚的免疫防御反應中發(fā)揮的一定作用。

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（責任編輯 狄艷紅）

Characteristics of Gene CDH5 in Schizothorax prenanti and Its Response to Aeromomas sobria Infection

DUAN Hui-qin1WANG Li2
（1. Institute of Qinghai-Tibet Plateau，Southwest University for Nationalities，Chengdu 610041；2.College of Life Science and Technology，Southwest University for Nationalities，Chengdu 610041）

This work is to characterize cadherin 5（CDH5）gene of Schizothorax prenanti. Bioinformatics tools were used to analyze the gene sequence of CDH5，and real-time PCR to detect the expression variation of CDH5 gene at 0 h，24 h，and 48 h of S. prenanti infected with Aeromomas sobria. The full-length cDNA of CDH5 was 4 825 bp，ORF was 2 313 bp，and encoded 770 amino acids. Its molecular weight was 85.19 kD and pI was 5.01. The CDH5 protein had a signal peptide sequence，and its secondary structure was mainly composed of random coil，extend strand，and α-helix. Multiple alignment analysis revealed that CDH5 shared 74% homology with Danio rerio，low similarity with Homo sapiens（43%）. CDH5 were expressed in all detected tissues after A. sobria infection，the expression of CDH5 in spleen at 24 h was significantly higher than at 0 h and 48 h（P ＜ 0.05），also the expression of CDH5 in the liver，kidney，and muscle at 48 h higher than at 24 h（P ＜ 0.05），and significantly higher expression of CDH5 at 48 h in heart and intestines than at 0 h（P ＜ 0.05）. It indicated that CDH5 of S. prenanti might be involved in immune response to A. sobria infection，laying a foundation for the further study on the functions of S. prenanti.

CDH5；Schizothorax prenanti；tissue expression；Aeromomas sobria

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017.03.023

2016-07-10

四川省科技支撐項目（2016NZ0044），西南民族大學研究生學位點建設(shè)項目（2016XWD-SO71007）

段薈芹，女，碩士研究生，研究方向：動物遺傳學；E-mail：917077886@qq.com

王利，女，副教授，研究方向：動物免疫學；E-mail：qinxin916@aliyun.com