橡膠樹半胱氨酸蛋白酶抑制劑HbCYS2的克隆與表達分析

龍翔宇 梁啟福 戚繼艷 方永軍 唐朝榮

（中國熱帶農業科學院橡膠研究所，儋州 571737）

橡膠樹半胱氨酸蛋白酶抑制劑HbCYS2的克隆與表達分析

龍翔宇 梁啟福 戚繼艷 方永軍 唐朝榮

（中國熱帶農業科學院橡膠研究所，儋州 571737）

半胱氨酸蛋白酶抑制劑（Cystatin，CYS）廣泛參與植物的生長發育調控、生物與非生物脅迫應答過程。從橡膠樹中獲得1個CYS基因，ORF長度為687 bp，編碼1個由228個氨基酸殘基組成的蛋白，生物信息學分析發現該蛋白含有2個CYS結構域，以及1個含有30個氨基酸殘基的信號肽，為分泌蛋白，推測屬于植物CYS II型，命名為HbCYS2（GenBank：KX161925）。表達分析發現HbCYS2在膠乳中高表達，并且受割膠和產量調節劑ET調控；在葉片組織中，HbCYS2對多主棒孢侵染表現出明顯應答。由此推測，膠乳中HbCYS2在橡膠樹膠乳再生、以及割膠傷害應答中發揮一定的調控作用，葉片中HbCYS2參與橡膠樹棒孢落葉病的防御或抵抗。

橡膠樹；半胱氨酸蛋白酶抑制劑；膠乳再生；脅迫應答

半胱氨酸蛋白酶抑制劑（Cystatin，CYS），是一類可逆抑制半胱氨酸蛋白酶的超家族蛋白，廣泛存在于動植物體內，其主要功能是與蛋白酶相互制約控制生物體內的多種生理過程，防止體內功能蛋白被外源蛋白酶降解［1，2］。半胱氨酸蛋白酶抑制劑超家族根據氨基酸序列可分三大家族（Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ），其分泌模式、糖基化、磷酸化、結構域、分子量等存在明顯差異，但所有半胱氨酸蛋白酶抑制劑都具有QxVxG的基序，這一基序通常位于蛋白序列的中心區域［3-5］。

研究表明，植物半胱氨酸蛋白酶抑制劑在抗蟲方面起重要作用，昆蟲攝食抑制劑后，消化道蛋白水解酶受到抑制，導致昆蟲的非正常發育或死亡［6-10］。除此之外，植物半胱氨酸蛋白酶抑制劑還參與植物生長發育，如種子萌發、幼苗生長、果實成熟以及細胞程序性死亡等［11-14］，并在提高植物生物與非生物脅迫抗性方面均發揮重要作用［15-17］。目前，已從多種植物中克隆獲得半胱氨酸蛋白酶抑制劑，如擬南芥［6］、水稻［18］、棉花［19］、大豆［20］、煙草［21］和荔枝［22］等，然而在橡膠樹中對其研究相對較少。本研究根據已建立的橡膠樹轉錄組及基因組數據庫，獲得橡膠樹半胱氨酸蛋白酶抑制劑cDNA全序列，對基因結構及蛋白理化性質進行生物信息學分析，并運用Q-PCR分析該基因的表達模式，以期為橡膠樹半胱氨酸蛋白酶抑制劑基因功能的研究提供理論依據及參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 材料與試劑 在本研究中，多主棒孢霉菌侵染實驗所用材料為熱研7-33-97組培苗，其他處理實驗所用材料為熱研7-33-97成齡大樹；中國熱帶農業科學院環境與植物保護研究所為本研究提供多主棒孢菌HccYN57菌種。E.coli JM109菌株由橡膠所膠乳代謝課題組保存。

克隆載體、普通PCR和實時熒光定量PCR試劑，DNA凝膠回收試劑盒，以及限制性內切酶與連接酶、反轉錄試劑分別購自于大連寶生物公司，愛思進生物技術（杭州）有限公司（AxyGen）及Fermentas公司；英駿生物技術有限公司（Introvigen）完成各類引物合成及克隆測序；其它生化試劑均為進口或國產分析純試劑。

1.1.2 材料處理 橡膠樹不同處理（割膠、傷害及激素），以及不同組織（葉片、雄花、雌花、樹皮、種子、芽及膠乳）的采集均按照文獻［23-26］進行；多主棒孢菌HccYN57侵染參照梁啟福等［27］的方法進行。

1.2 方法

1.2.1 HbCYS2基因的分離克隆 橡膠樹組織總RNA及DNA的提取參照文獻［26，28，29］。采用Fementas公司反轉錄試劑盒合成橡膠樹cDNA第一鏈，操作步驟按照公司說明書進行。基因克隆所用引物見表1。

表1 基因克隆和表達分析所用引物

1.2.2 實時熒光定量分析 實時熒光定量PCR技術分析不同組織，以及割膠、傷害、激素、多主棒孢菌等處理下的HbCYS2表達模式，為了提高表達數據的準確性，采用3種不同的內參基因RH2b（DEAD/DEAH box helicase，RH2b）、RH8（DEAD/ DEAH box helicase，RH8） 及YLS8（mitosis protein YLS8）對樣品進行均一化處理，目的基因及內參基因的熒光定量引物見表1。熒光定量PCR采用羅氏公司LightCycler 2.0系統，采用系統自帶軟件進行數據處理及分析。

1.2.3 HbCYS2生物信息學分析 HbCYS2基因序列分析和比對采用ProtParam tool和DNAMAN5.22軟件；利用NCBI蛋白保守數據庫（conserved domain database，CDD）分析保守結構域；采用在線軟件（Http://web.expasy.org/protparam/）分析氨基酸成分、蛋白分子量、等電點；采用在線軟件（Http://ipsort. hgc.jp/和Http://www.cbs.dtu.dk/services/TargetP/） 進行信號肽預測和亞細胞定位；采用在線軟件（Http:// www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）進行蛋白質跨膜區預測；基因結構分析采用網址Http://gsds.cbi.pku. edu.cn/。

2 結果

2.1 HbCYS2基因克隆與序列分析

在前期橡膠樹膠乳再生的研究中篩選到一個差異蛋白點，根據質譜后的氨基酸序列，搜索橡膠樹轉錄組數據庫，拼接獲得1條1 000 bp的核苷酸序列。以橡膠樹cDNA為模板進行擴增測序，最終獲得1條核苷酸序列949 bp，使用ORF Finder軟件分析結果顯示，該序列含有長度為687 bp的開放閱讀框，以及29 bp的5'端非編碼區（5' UTR）和233 bp的3'端非編碼區（3' UTR）；以橡膠樹DNA為模板，獲得1條5 240 bp的核苷酸序列，經GSDS軟件比對cDNA及DNA序列，結果（圖1）顯示該基因包含4個外顯子和3個內含子。

圖1 HbCYS2基因結構圖

2.2 HbCYS2生物信息學分析

HbCYS2基因編碼一個由228個氨基酸殘基組成的蛋白，分子量約為26.15 kD，理論等電點（pI）為8.87；氨基酸組成分析結果顯示，HbCYS2編碼蛋白富含亮氨酸Leu（10.1%）和賴氨酸Lys（10.1%），色氨酸Trp（1.8%）和半胱氨酸Cys（0.9%）含量較低。

HbCYS2編碼蛋白擁有典型植物半胱氨酸蛋白酶抑制劑的保守N末端，以及由基因復制而引起的重復C末端，共2個CYS結構域：在N端含有3個保守的氨基酸結構域或活性中心元件，第56-65位F-A-R-F-A-V-Q-E-H-N，第73-77位Q-V-V-A-G，第105-114位Y-E-A-K-V-W-V-K-P-W；在C端保守氨基酸結構域第55-66位D-P-E-V-Q-D-A-A-N-HA-V（圖2）。Blast比對結果表明，該蛋白的氨基酸序列與胡楊（Populus euphratica，XP_011041371），蓖麻（Ricinus communis，EEF36180），甜橙（Citrus sinensis，XP_006482025） 和 葡 萄（Vitis vinifera，XP_002283400）半胱氨酸蛋白酶抑制劑序列一致性分別為67.97%、62.45%、61.40%和60.43%，除此之外，該蛋白序列與前期研究的橡膠樹半胱氨酸蛋白酶抑制劑HbCYS1（Hevea brasiliensis）的一致性為50.41%。表明該蛋白為橡膠樹半胱氨酸蛋白酶抑制劑家族中的一員，命名為HbCYS2（GenBank： KX161925）。

HbCYS2蛋白N端存在1個由30個氨基酸殘基組成的信號肽，肽段分子量約為3.6 kD，TMHMM軟件預測HbCYS2第1-6位氨基酸殘基為胞內，7-26位為膜上，而27-288位為胞外，根據信號肽類型預測HbCYS2蛋白為分泌型蛋白。

2.3 HbCYS2表達分析

橡膠樹不同組織表達分析結果（圖3）表明，HbCYS2基因在橡膠樹8種組織（芽、葉、種子、老皮、雌花、幼皮、雄花和膠乳）中均被檢測到，沒有呈現組織表達特異性，在膠乳中的表達豐度最高，雄花和幼皮次之，芽中表達量最低。

未開割樹割膠處理，膠乳中HbCYS2基因受割膠調控明顯，前3刀中HbCYS2基因表達豐度明顯下將，第3刀降至最低點，第4、5刀中表達水平略有回升；傷害處理下，膠乳中HbCYS2基因表達豐度無明顯變化，24 h處理后表達量有所下降（圖4）。

在6種植物激素或激素類似物處理下，膠乳中HbCYS2基因受ET、GA及2，4-D刺激后呈先下降再上升的趨勢，ET及2，4-D處理下3 h表達豐度最低，GA處理下12 h表達豐度最低；相反，JA刺激下該基因在前12 h呈上升趨勢并達到峰值，隨后在24 h恢復到初始值；ABA及SA刺激下該基因呈下降趨勢，均在24 h表達豐度降至最低（圖5）。

圖2 HbCYS2核苷酸及蛋白序列

圖3 HbCYS2基因在橡膠樹8種不同組織中的表達豐度

除此之外，葉片中HbCYS2基因對多主棒孢霉HccYN57侵染應答明顯，侵染12 h后表達量明顯下降，24 h降至最低值，此后隨侵染時間的增加表達水平持續回升（圖6）。

3 討論

巴西橡膠樹（Hevea brasiliensis）為多年生的熱帶高大喬木，是天然橡膠的主要來源，具有重要的經濟價值。在生產中，橡膠樹面臨多種生物與非生物逆境脅迫，如病害、蟲害、風害、寒害及旱害，直接影響橡膠樹膠乳產量［30］。植物半胱氨酸蛋白酶抑制劑是重要的組織防御應激蛋白，同時參與植物生長發育的相關調節［31］。本研究通過橡膠樹轉錄組及基因組數據庫分離得到HbCYS2，利用生物信息學分析其核苷酸序列，推論該蛋白含有228個氨基酸殘基，分子量約為26.15 kD，含有2個CYS結構域，在N端存在典型的保守序列基序（F-A-R-F-A-V-Q-EH-N，Q-V-V-A-G，Y-E-A-K-V-W-V-K-P-W），C端典型的保守序列基（D-P-E-V-Q-D-A-A-N-H-A-V），除此之外，該蛋白還具有30個氨基酸殘基組成的信號肽，且為分泌蛋白，根據上述特征推論HbCYS2屬于植物半胱氨酸蛋白酶抑制劑II型。II型半胱氨基酸蛋白酶抑制劑分子量大約23 kD左右，擁有和I型相似的保守N末端以及由基因復制而引起的重復C末端，為二結構域（CYS）分泌蛋白，與前期研究的HbCYS1屬于同類型蛋白［32，33］。對HbCYS1與 HbCYS2序列進行比較發現，盡管他們的氨基酸序列一致性不高，但仍可以清晰的辨認出N端的3個保守序列基序，特別是活性中心元件Q-x-V-x-G，進一步說明這些保守結構域可以直接與半胱氨酸蛋白酶的活性中心進行連接，使其催化活性受到破壞［34］。

圖4 HbCYS2基因在割膠及傷害處理下的表達模式

圖5 HbCYS2基因表達對不同激素的響應

圖6 多主棒孢菌侵染后HbCYS2基因的表達模式

在橡膠樹中，乳管細胞是天然橡膠的合成場所，其胞質（膠乳）是橡膠樹生產中的中重要防御組織。橡膠樹割膠是一種典型的傷害處理，同時也可以促進膠乳再生與排膠，割膠應答也是橡膠樹產膠潛力的重要評價指標［33］。本研究表達分析結果顯示，HbCYS2在膠乳中高表達，受割膠調控明顯，對傷害處理也產生一定的應答。另外，膠乳中HbCYS2受多種激素調控，特別是橡膠樹產量調節劑ET，與割膠應答模式相似。由此推測，膠乳高表達HbCYS2在膠乳再生，以及割膠傷害刺激中發揮一定的應答調控作用。除此之外，葉片中HbCYS2對多主棒孢侵染產生明顯應答，參與橡膠樹棒孢霉落葉病的防御或抵抗。

4 結論

本研究成功分離了橡膠樹半胱氨酸蛋白酶抑制劑HbCYS2，具有CYSII型的典型特征，該基因參與橡膠樹的膠乳再生調控和病害脅迫應答過程，豐富了橡膠樹半胱氨酸蛋白酶抑制劑基因家族，為揭示蛋白酶抑制劑基因家族在橡膠樹生長發育、生物與非生物脅迫中的作用提供相關信息。

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（責任編輯 馬鑫）

關于召開“2017中國農業展望大會”的通知

為深入推進農業供給側結構性改革，加強信息引領現代農業發展的能力，促進農業轉型升級，茲定于2017年4月20—21日在北京召開“2017中國農業展望大會”。大會由農業部市場預警專家委員會支持，中國農業科學院農業信息研究所主辦，農業部信息中心、農業部農村經濟研究中心、農業部農業貿易促進中心等協辦。

一、大會主題

深入推進農業供給側結構性改革，促進農業轉型升級。

二、大會內容

主要內容包括三個方面：一是發布未來10年中國農業展望報告（2017—2026年），分析當前市場形勢，展望未來市場走勢。二是開展水稻、小麥、玉米、大豆、油料、糖料、棉花、肉類、禽蛋、奶制品、蔬菜、水果、飼料等18個農產品品種的專題交流。三是進行“三農”熱點專題研討，就農業供給側結構性改革、“互聯網+”現代農業、大數據與農業監測預警、農業資源環境、農村金融與保險、國際農產品貿易等主題進行專題報告。

三、參會人員

農業部等國家部委相關部門領導，各省（直轄市、自治區）農業主管部門領導；農業市場全產業鏈信息分析人員；相關科研機構及高等院校從事農業監測預警、農業展望、經濟分析和信息分析的相關專家與學者；家庭農場、農業合作社、農業產業化龍頭企業等新型農業經營主體代表，行業協會、涉農企業、咨詢機構人員；涉農金融證券、期貨從業人員；國際組織及相關國家的農業專家、駐華機構代表等。

四、大會時間與地點

大會時間：2017年4月20（星期四）—21日（星期五），會期2天。

大會地點：北京國際會議中心（北京市朝陽區北辰東路8號）

報到地點： 4月19日（星期三）全天，在北京五洲大酒店住宿的代表在該酒店一層大廳報到（北京市朝陽區北辰東路 8號），在亞運村賓館住宿的代表在該賓館一層大廳報到（北京市朝陽區北辰東路 8號）；4月20日（星期四）上午7:00-9:00，在北京國際會議中心一層大廳報到。

五、食宿安排及大會注冊

會議代表可由大會統一安排食宿（北京五洲大酒店和亞運村賓館），費用自理。會議收取注冊費，每人1600元。本次大會實行會議注冊制度，參會人員可通過電子郵箱、傳真、網站在線注冊、手機注冊等方式進行報名，注冊截止日期2017年3月24日。會議信息敬請關注大會網站。

六、聯系方式

聯 系 人： 李干瓊，010-82109762，13718689362王盛威，010-82105200，15811088766

傳 真：010-82109660

電子郵箱：aoc@caas.cn

會議網站：http://aii.caas.net.cn/aoc/index.html

會議微信公眾號：中國農業監測預警

中國農業科學院農業信息研究所

二○一七年二月二十四日

Cloning and Expression Analysis of Cystatin（HbCYS2）from Para Rubber Tree（Hevea brasiliensis）

LONG Xiang-yu LIANG Qi-fu QI Ji-yan Fang Yong-jun TANG Chao-rong
（Rubber Research Institute，CATAS，Danzhou 571737）

In plant，the cystatin（CYS）is widely involved in growth and development，and responses to biotic and abiotic stresses. In this study，the HbCYS2 is isolated from rubber tree，and has open reading frame（687 bp）encoding a protein of 288 aa. The HbCYS2 is a secreted protein with signal peptide，and has two CYS domains. The bioinformatics analysis indicates that the HbCYS2 is belonged to CYS II（GeneBank：KX161925）. The expression analysis indicated that the HbCYS2 has high level expression in latex，and similar expression pattern responding to tapping and ET treatment. In addition，the expression of HbCYS2 is apparently regulated by Corynespora inoculation in leaf. It is speculated that the HbCYS2 plays an important role in latex regeneration，tapping treatment and disease resistance in rubber tree.

Hevea brasiliensis；cystatin；latex regeneration；stress response

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017.03.013

2016-07-18

國家自然科學基金青年科學基金項目（31300570），海南省自然科學基金項目（314141），中國熱帶農業科學院橡膠所基本科研項目（1630022016006-01）

龍翔宇，男，博士，研究方向：橡膠樹產膠生物學；E-mail：yuxianglong006@163.com

唐朝榮，男，博士，研究方向：橡膠樹產膠生物學；E-mail：chaorongtang@126.com