蜂膠黃酮的乙醇分級提取及其抗氧化活性比較

姜紅宇JIANG Hong-yu 盤 雪 李目武 - 王宗成,2 -,2

(1. 湖南科技學院湖南省銀杏工程技術研究中心，湖南 永州 425100；2. 中南大學化學化工學院, 湖南 長沙 410083)

蜂膠是蜜蜂用于維持整個群體健康的有效物質，一個5～6萬只的蜂群一年只能生產蜂膠70～110 g，被譽為“紫色黃金”[1]。蜂膠主要有黃酮類化合物、萜類化合物、酚類化合物、有機酸類化合物、醛與酮類化合物、酯與醇類化合物等[2-4]。蜂膠被稱為“黃酮類化合物的寶庫”[5]，蜂膠黃酮類化合物與蜂膠的大部分生理及藥理學活性，如抗菌、抗病毒、抗氧化、抗高血壓、降血糖、增強免疫力、抗癌、促進細胞再生、美容養顏、鎮痛等作用密切相關[6-9]。因此，關于蜂膠黃酮提取分離的研究頗多[10-13]。付英娟[11]采用不同溶劑對陜西產蜂膠進行了黃酮提取，其最佳超聲波輔助提取條件為乙醇濃度79.51%，提取時間19.31 min，提取功率538.28 W，液料比39.48∶1；馬士巧等[12]采用不同極性溶劑提取東北黑蜂膠中的活性成分，并研究了其抗氧化活性，發現用甲醇和乙醇提取得到的黃酮、多酚和三萜都較高，且抗氧化活性也都較強；張云香等[13]采用水和3個不同濃度的乙醇溶液對泰山產蜂膠進行黃酮提取，發現70%乙醇提取效果最好。然而，這些研究都是采用一種特定的溶劑進行提取，未見分級提取的研究和不同蜂膠黃酮活性物質的極性大小與活性強弱間關系的研究。為了篩查永州粗蜂膠中活性成分的極性差異以及根據活性強弱選擇合適方法提取分離高活性的蜂膠黃酮，本研究在前人研究的基礎上，選擇水和9個不同濃度的乙醇分級提取永州粗蜂膠中的活性成分，以黃酮含量為指標，比較不同提取條件下蜂膠黃酮含量及其抗氧化活性的差異，通過不同溶劑提取的永州粗蜂膠中黃酮質量、含量和抗氧化活性差異分析永州粗蜂膠中黃酮性質，以期為蜂膠黃酮開發應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 原料與儀器

1.1.1 原料與試劑

粗蜂膠：產地湖南永州，冷凍24 h后粉碎，過20目篩，置干燥箱中備用；

蘆丁標準品：98.0%，北京方程生物科技有限公司；

乙醇、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉：分析純，天津市福晨化學試劑廠。

1.1.2 儀器設備

電子天平：TE124S型，賽多利斯科學儀器(北京)有限公司；

分光光度計：UV2800S型，上海舜宇恒平科學儀器有限公司；

旋轉蒸發儀：RE-201D型，上海亞榮生化儀器廠。

1.2 試驗方法

1.2.1 標準曲線的繪制 參照文獻[14]，配置0.1 mg/mL蘆丁標準溶液，以不加入蘆丁標準溶液為空白對照，在λ=510 nm處分別測定0.01～0.06 mg/mL蘆丁標準溶液的吸光度，繪制標準曲線，得回歸方程為：A=16.853C+0.040 2，R2=0.996 7，說明具有良好的線性關系。

1.2.2 蜂膠黃酮的分級提取與含量測定 精密稱取10.00 g 粗蜂膠于250 mL平底燒瓶中，按1∶20(g/mL)的料液比加入蒸餾水，置于集熱式磁力攪拌器中70 ℃提取1 h后，取出平底燒瓶，趁熱倒入燒杯中用保鮮膜密封，置于陰涼處24 h[13]。樣品分為3層，上層為蜂蠟，中間為水提取液，下層為處理后蜂膠。用玻璃棒將上層蜂蠟取出，在25 ℃烘箱中烘干并進行稱重。將水提取液轉移到已經稱重的平底燒瓶中，于60 ℃下減壓濃縮除去溶劑，再于25 ℃烘箱中烘干，稱重作為樣品1。

將下層處理后蜂膠用20%的乙醇溶液轉移至已經稱重的平底燒瓶中，乙醇溶液用量為處理后蜂膠的1∶20(g/mL)，70 ℃回流提取1 h后取出，用保鮮膜密封，沉降后分為2層，上層為乙醇提取液，下層為處理后蜂膠。將上層乙醇提取液轉移到已經稱重的平底燒瓶中，于60 ℃下減壓濃縮除去溶劑，再于25 ℃烘箱中烘干，稱重作為樣品2。同理，分別用30%，40%，50%，60%，70%，80%，90%的乙醇溶液和無水乙醇，制備樣品3、樣品4、樣品5、樣品6、樣品7、樣品8、樣品9和樣品10。提取完10個樣品后，原平底燒瓶中殘余物在25 ℃烘箱中烘干并進行稱重。

將樣品1～10號，分別溶于50%乙醇中，并定容至100 mL，從中取出5 mL用50%乙醇稀釋至50 mL，作為樣品溶液測定吸光度，依據回歸方程計算黃酮含量。測定后，發現樣品8～10號，由于濃度過低，直接取非稀釋液測定吸光度，計算黃酮含量。

1.2.3 蜂膠黃酮的抗氧化活性測定

(1) 還原能力：參照文獻[15]。

(2) 清除DPPH自由基能力：參照文獻[16]。

(3) 清除ABTS自由基能力：參照文獻[17]。

2 結果與分析

2.1 不同樣品的蜂膠黃酮的乙醇分級提取試驗結果

由表1可知，蜂膠在水中析出蜂蠟后，在水中的溶解量最少，隨著乙醇濃度的升高，溶解量先增大后減少，在50%的乙醇中溶解質量最多(14.52%)，整個分級提取過程中，累積溶解百分數(除去蜂蠟)達到76.75%，說明永州粗蜂膠在水和乙醇中可溶性成分非常高，且蜂蠟含量較低，為13.37%。

由表1可知，水提取液中提取到的黃酮質量比20%和30%乙醇提取液中的略高，隨著乙醇濃度的升高，提取到的黃酮質量先增加后減少，在50%乙醇提取液中得到的黃酮質量最高，隨后減少，說明黃酮基本提取完全。在水提取、40%乙醇提取、50%乙醇提取和60%乙醇提取過程中得到的黃酮含量較高，分別為59.9%，41.8%，50.8%，63.4%，說明永州粗蜂膠中含有一些水溶性黃酮，因此水提取得到的蜂膠黃酮質量和含量較高，與馬士巧等[12]報道的東北黑蜂膠水提物中總酚含量高、黃酮含量低，以及張云香[13]報道的泰山蜂膠水提黃酮含量較低還是有差異的。另外，在40%～60%乙醇提取過程中得到的蜂膠黃酮質量和含量較高，含有大量中等極性的黃酮。整個分級提取過程中，累積提取得到的黃酮達到2.66 g，提取到的總蜂膠黃酮占全部提取物的34.64%，但是80%乙醇、90%乙醇和無水乙醇提取得到的黃酮質量較少，雜質較多，從成本上考慮得到的提取物可以舍棄，將其他提取物合并計算，得到的黃酮可達2.58 g，提取到的蜂膠黃酮占提取物中的含量可達到41.18%，此時所得提取物中蜂膠黃酮含量明顯高于梁巧楣[18]報道用70%乙醇冷浸再乙酸乙酯萃取湖南衡陽產蜂膠得到的蜂膠浸膏中黃酮含量(30.7%)。整個分級提取過程中，從粗蜂膠中累積提取得到的黃酮得率為26.59%，從數據可知用水、20%～70%乙醇從粗蜂膠提取得到的黃酮得率較高，用80%乙醇、90%乙醇和無水乙醇提取黃酮得率較低，從成本上考慮后者得到的提取物可以舍棄，此時黃酮得率可達到25.81%，明顯高于安硯波等[19]報道用72.48% 乙醇超聲輔助提取山東產蜂膠的得率(13.07%)。說明采用乙醇分級提取法提取永州粗蜂膠黃酮具有較好的提取分離效果，得到的蜂膠黃酮純度較高、得率較高。

2.2 蜂膠黃酮的抗氧化活性

2.2.1 還原能力 由表2可知，隨蜂膠黃酮濃度和VC濃度的增加，還原能力增強，呈現量效關系，其中50%乙醇提取和60%乙醇提取黃酮還原能力較強，且顯著高于VC(P<0.05)；水提取黃酮、40%乙醇提取黃酮、70%乙醇提取黃酮比VC還原能力稍弱；30%乙醇提取黃酮還原能力最差。說明粗蜂膠中含有不同類型的蜂膠黃酮，提取活性較高的蜂膠黃酮，可以選擇水提取水溶性黃酮，還可以選擇40%～70%乙醇提取中等極性黃酮；80%、90%乙醇和無水乙醇提取的黃酮還原能力相近且較差。

2.2.2 清除DPPH自由基能力 由表3可知，隨蜂膠黃酮濃度和VC濃度的增加，清除DPPH自由基能力增強，呈現量效關系；50%乙醇提取和60%乙醇提取的黃酮清除DPPH自由基的能力顯著性高于VC的(P<0.05)，且50%乙醇提取的黃酮清除DPPH自由基能力最強；70%乙醇提取的黃酮和VC清除DPPH自由基能力相差不大；水提取的黃酮、40%乙醇提取黃酮比VC清除DPPH自由基能力稍弱；30%乙醇提取的黃酮清除DPPH自由基能力最差。說明粗蜂膠中含有不同類型的蜂膠黃酮，提取活性較高的蜂膠黃酮，可以選擇水提取水溶性黃酮，還可以選擇40%～70%乙醇提取中等極性黃酮；80%乙醇、90%乙醇和無水乙醇提取的黃酮清除DPPH自由基能力相近且較差。

2.2.3 清除ABTS自由基能力 由表4可知，隨蜂膠黃酮濃度和Vc濃度的增加，清除ABTS自由基能力增強，且呈現量效關系；50%乙醇提取的黃酮清除ABTS自由基的能力顯著高于VC的(P<0.05)；水提取的、40%乙醇提取、60%乙醇提取的和70%乙醇提取的黃酮清除ABTS自由基的能力與VC的相近；30%乙醇提取的黃酮清除ABTS自由基能力最差。說明粗蜂膠中含有不同類型的蜂膠黃酮，提取活性較高的蜂膠黃酮，可以選擇水提取水溶性黃酮，還可以選擇40%～70%乙醇提取中等極性黃酮；80%乙醇、90%乙醇和無水乙醇提取的黃酮清除ABTS自由基能力相近且較差。

? a：水提取過程中上層析出的蜂蠟質量；b：不含蜂蠟的溶解質量；c：乙醇分級提取到的總蜂膠黃酮占全部提取物中的含量。

? 同列中不同字母表示有顯著性差異(P<0.05)。

? 同列中不同字母表示有顯著性差異(P<0.05)。

? 同列中不同字母表示有顯著性差異(P<0.05)。

3 結論

采用乙醇分級提取永州粗蜂膠能得到純度較高、得率較高的蜂膠黃酮，提取物中蜂膠黃酮的含量可達到41.2%，黃酮得率可達到25.81%，且可以按照極性大小進行分離，說明乙醇分級提取分離粗蜂膠黃酮具有可行性，且永州粗蜂膠中不但含有大量中等極性黃酮，還含有較多水溶性黃酮。但是分級提取前用熱水溶解蜂蠟，并冷卻析出除去了這部分不含黃酮的成分，蜂蠟是否具有輔助藥效活性，還有待進一步研究。

乙醇分級提取的不同蜂膠黃酮的抗氧化活性具有明顯差異，且隨蜂膠黃酮濃度的增加，抗氧化活性增強，呈現明顯的量效關系。說明永州粗蜂膠中含有不同類型的蜂膠黃酮，提取活性較高的蜂膠黃酮，可以選擇水提取水溶性黃酮和40%～70%乙醇提取中等極性黃酮。由于不同地區蜂膠的抗氧化活性差異較大[20]，且未見乙醇分級提取得到的不同蜂膠黃酮樣品的抗氧化活性差異報道，與其他文獻抗氧化活性沒有較好的可比性，此外黃酮類物質只是衡量物質抗氧化活性的一個指標，能不能將黃酮類物質含量作為唯一衡量抗氧化的指標，值得進一步研究。

乙醇分級提取獲得的不同蜂膠黃酮樣品中黃酮質量、含量與抗氧化活性之間有一定的相關性，說明乙醇分級提取蜂膠黃酮從提取效果、分離效果和抗氧化活性上都具有一定優勢。

[1] 羅火林, 劉星星, 龔上佶, 等. 不同地區蜂膠和樹膠的紅外譜圖分析[J]. 光譜學與光譜分析, 2015, 35(11): 3 058-3 062.

[2] 張翠平, 平舜, 黃帥, 等. 蜂膠的地理來源、植物來源及化學成分的研究[J]. 中國藥學雜志, 2013, 48(22): 1 889-1 892.

[3] 田進軍, 薛艷, 候振健. 偽三元相圖法制備O/W型蜂膠微乳[J]. 食品與機械, 2011, 27(3): 127-129.

[4] 徐響, 張紅城, 董捷. 蜂膠功效成分研究進展[J]. 食品工業科技, 2008, 29(9): 286-289.

[5] 房柱. 蜂膠——黃酮化合物的寶庫[J]. 蜜蜂雜志, 1998(9): 11-12.

[6] 潘婭, 鄭德俊, 周莉玲, 等. 蜂膠生理活性與藥理作用研究淺釋[J]. 中華中醫藥學刊, 2004, 22(2): 381-382.

[7] SAWICKA D, CAR H, BORAWSKA M H, et al. The anticancer activity of propolis[J]. Folia Histochemica Et Cytobiologica, 2012, 50(1): 25-37.

[8] MASSARO C F, KATOULI M, GRKOVIC T, et al. Anti-staphylococcal activity of C-methyl flavanones from propolis of Australian stingless bees (Tetragonula carbonaria) and fruit resins of Corymbia torelliana (Myrtaceae)[J]. Fitoterapia, 2014, 95(2): 247-257.

[9] AGüERO M B, GONZALEZ M, LIMA B, et al. Argentinean propolis from Zuccagnia punctata cav. (Caesalpinieae) exudates: phytochemical characterization and antifungal activity[J]. Journal of Agricultural & Food Chemistry, 2010, 58(1): 194-201.

[10] 張翠平, 胡福良. 蜂膠中的黃酮類化合物[J]. 天然產物研究與開發, 2009, 21(6): 1 084-1 090.

[11] 付英娟. 蜂膠中有效成分的提取及應用研究[D]. 楊凌: 西北農林科技大學, 2007: 18-31.

[12] 馬士巧, 馬海樂, 潘忠禮, 等. 黑蜂蜂膠不同極性提取物的體外抗氧化活性[J]. 中國食品學報, 2016, 16(8): 53-58.

[13] 張云香, 楊志孝, 安蔚, 等. 不同溶劑對蜂膠黃酮提取率影響的研究[J]. 時珍國醫國藥, 2006, 17(1): 9-10.

[14] 王宗成, 蔣玉仁, 劉小文, 等. 響應面優化生姜莖葉總黃酮提取工藝及其抗氧化活性研究[J]. 天然產物研究與開發, 2015, 27(9): 1 582-1 588.

[15] 歐陽凱, 何先元, 陳飛, 等. 四齒四棱草總皂苷提取工藝優化及抗氧化性研究[J]. 食品與機械, 2016, 32(7): 141-145.

[16] 劉安, 羅松, 李祁廣, 等. 不同工藝制備辣椒籽油的體外抗氧化活性比較[J]. 食品與機械, 2016, 32(6): 168-170.

[17] 陸俊, 羅丹, 張佳琦, 等. 三葉木通不同部位多酚、黃酮含量及抗氧化活性比較[J]. 食品與機械, 2016, 32(8): 132-135.

[18] 梁巧楣. 蜂膠總黃酮的制備及含量測定[J]. 中國現代醫學雜志, 2007, 17(17): 2 123-2 126.

[19] 安硯波, 王浩. 響應面法優化蜂膠總黃酮的提取工藝[J]. 中國蜂業, 2016, 67(9): 46-49.

[20] 玄紅專, 胡福良. 不同地區蜂膠抗氧化活性與化學組分的研究進展[J]. 蜜蜂雜志, 2009, 29(2): 7-10.