全自動凱氏定氮儀測定大米蛋白質

郭應時 Ying-shi 曹小彥 - 鄒杭君 - 郭明義 - 張 威

(1. 廣電計量檢測﹝湖南﹞有限公司，湖南 長沙 410007；2. 長春市食品藥品監督管理局，吉林 長春 130000)

目前已報道的蛋白質測定方法可分為兩類：間接法和直接法。間接法根據定氮后的氮含量，利用蛋白質系數計算出蛋白質含量，杜馬斯燃燒法和凱氏定氮法是使用最廣泛的間接方法；直接法利用蛋白質的物理或化學性質，采用儀器通過建立工作曲線得出蛋白質含量[1-3]，直接方法有近紅外光譜法[4]、紫外分光光度法[5]、電泳法[6]、紫外吸收光譜法[7]和Bradford法[8]。

凱氏定氮法憑借著靈敏度高、穩定性好、成本低廉等優點，成為了目前分析含氮化合物最常用的方法，被國內外作為法定的標準檢驗方法[9]。由于傳統的半微量定氮法檢測時間需要4～6 h，效率低下，全自動凱氏定氮法得到了較快發展。目前對凱氏定氮法測定食品蛋白質進行的研究已有不少[10-11]，但是利用全自動凱氏定氮儀測定特定食品蛋白質的研究報道僅見于大豆、小麥、乳制品。盡管供應商都會根據各自儀器的特性提供一個基本方法以滿足大部分樣品的分析，但是由于食品基質復雜，普適性再強的方法具體到特定的樣品時不一定是最佳方法，希望用同一處理方法來處理所有類型的樣品是不切實際的，需要根據實際情況進行適當的調整和改進。有針對性地優化建立最優的大米處理方法，在最短的時間內得出更精準的結果十分必要。本試驗擬采用全自動凱氏定氮儀測定大米中蛋白質的含量，通過考查樣品質量、濃硫酸添加量、消化溫度、消化時間等關鍵因素對蛋白質測定結果的影響，確定最佳試驗條件，得出最佳分析程序，以提高分析效率，節約試驗試劑，實現實驗室對大批量樣品的快速、準確檢測。

1 材料與方法

1.1 材料

大米：產地分別為東北、江蘇、新疆、湖南、海南，均為當地知名品牌的大米。

1.2 試劑

鹽酸、氫氧化鈉、濃硫酸、硼酸、甲基紅：分析純，國藥集團化學試劑有限公司；

溴甲酚綠：指示劑，國藥集團化學試劑有限公司；

尿素：99.9%，GBW09201，中國計量科學研究院；

全麥粉粗蛋白質標準物質：GBW(E)100126，國家糧食局科學研究院；

銅催化劑：4.5 g K2SO4+0.5 g CuSO4·5H2O/片，福斯華(北京)科貿有限公司。

1.3 試劑配置

1.3.1 鹽酸標準滴定溶液(0.1 mol/L) 按GB/T 601—2016配置及標定。

1.3.2 氫氧化鈉溶液(400 g/L) 稱取4 000 g氫氧化鈉溶于水，冷卻后稀釋至10 L。

1.3.3 硼酸吸收溶液(含溴甲酚綠和甲基紅指示劑)

(1) 1%硼酸：將100 g硼酸溶于10 L純水中。

(2) 0.1%溴甲酚綠溶液：0.1 g溴甲酚綠溶于100 mL 95%乙醇中。

(3) 0.1%甲基紅溶液：0.11 g甲基紅溶液100 mL 95%乙醇中。

(4) 在10 L 1%的硼酸溶液中加入100 mL 1%溴甲酚綠和70 mL 1%甲基紅溶液混勻。

1.4 主要儀器設備

凱氏定氮儀：8400型，福斯華(北京)科貿有限公司；

消化爐：DT220型，福斯華(北京)科貿有限公司；

中藥粉碎機：FW177型，天津市泰斯特儀器有限公司；

電子天平：ME204E型，梅特勒-托利多儀器(中國)有限公司。

1.5 試驗方法

1.5.1 樣品制備 用中藥粉碎機粉碎大米，并過100目篩。

1.5.2 單因素試驗 參考GB 5009.5-2016及定氮儀簡報，用消化爐消化樣品，全自動凱氏定氮儀測定蛋白質。以蛋白質含量為指標，分別考察樣品質量(0.25，0.50，0.75，1.00，1.25，1.75 g，固定濃硫酸添加量12 mL，消化溫度420 ℃、消化時間60 min，添加1片催化劑)、濃硫酸添加量(6.00，8.00，10.00，12.00，14.00，16.00，18.00 mL，固定樣品質量0.50 g，消化溫度420 ℃，消化時間60 min，添加1片催化劑)、消化溫度(320，340，360，380，400，420，440 ℃，固定樣品質量0.50 g，濃硫酸添加量12 mL，消化時間60 min，添加1片催化劑)、消化時間(30，40，50，60，70，80，90 min，固定樣品質量0.50 g，濃硫酸添加量12 mL，消化溫度420 ℃，添加1片催化劑)4個因素對大米蛋白質測定值的影響。

1.5.3 正交試驗 根據單因素試驗結果選取合理水平設計正交試驗。

1.5.4 精密度及準確度試驗 稱取6個平行樣品進行精密度試驗，稱取3個平行樣品，加入尿素純度標準物質進行加標回收試驗，同時利用全麥粉粗蛋白質標準物質考察準確度。

1.5.5 數據處理 試驗數據用SPSS數據分析軟件進行單因素方差分析并進行Duncan多重比較。

2 結果與分析

2.1 樣品量對測定結果的影響

分析過程中，樣品稱取量一般依照樣品含氮量和均勻度而定[12]。一般來說，減少樣品質量可以減少消化時間；同時，在保證試樣均勻的情況下，增加樣品質量能夠減少系統誤差，提高試驗準確性。但是隨著樣品量的增加，消化過程需要消耗更多的硫酸、消化時間也會相應延長，因此，試驗過程中確定合理的稱樣量十分必要。

由圖1可知，當其他影響因素固定不變時，樣品質量在0.25～0.75 g時，消化效果最好，蛋白質測定值相對較高。當樣品質量超過0.75 g以后，隨著樣品質量的增加，蛋白質測定值有下降趨勢。在測定大米蛋白質時，為保證分析結果的準確性，稱樣量可控制在0.25～0.75 g。

2.2 硫酸量對測定結果的影響

大米中有機氮與濃硫酸共熱，在催化條件下被分解為無機氮，產生的氨與硫酸結合[13]，因此，濃硫酸在消化過程中起直接消化作用，濃硫酸用量直接影響消化結果。硫酸量過少會導致樣品消化不完全，試驗結果偏低；濃硫酸用量過多，又會浪費試劑。因此，確定合適的硫酸用量十分必要。由圖2可知，當濃硫酸量為10～12 mL時消化效果最好，蛋白質測定值最高。當硫酸量<10 mL時，隨著濃流酸使用量的增加，蛋白質測定值增大，硫酸量>10 mL后，隨著硫酸量的增加，蛋白質測定值有下降趨勢。因此樣品量為0.5 g時，濃硫酸添加量宜控制在10 mL左右。

2.3 消化時間對測定結果的影響

消化時間關系到樣品中蛋白質能否完全被分解，對測定結果有重要影響。由圖3可知，消化時間<50 min時，隨著消化時間的延長，蛋白質含量測定值增加，消化時間為50～90 min時，蛋白質測定結果差異不大。有研究[14]表明，消化時間過長，氮元素會隨蒸氣逸出，造成結果偏低。為節約時間，測定大米蛋白質時可將時間控制在50 min。

2.4 消化溫度對測定結果的影響

消化過程本質上是使大米中有機氮轉換成銨離子，氮的臨界分解溫度為373 ℃，理論上溫度越高，消化速度越快，但是過高的溫度勢必會引起氮元素的損失。由圖4可知，在溫度<400 ℃時，隨著消化溫度的升高，蛋白質測定值也隨之增加，380～440 ℃時蛋白質測定結果最高，且無顯著差異。可見消化溫度是影響消化效果的另一個重要因素，并且消化溫度過低會造成消化不完全，導致試驗結果偏低；消化溫度過高也對消化過程無益，有研究[15]表明，消化溫度過高容易造成氮元素損失，導致測定結果偏低。因此，進行大米樣品處理時，宜將消化溫度控制在400 ℃左右。

2.5 正交試驗

根據單因素試驗結果，選取樣品量、濃硫酸量、消化時間、消化溫度4個因素各取4個水平采用湖南大米作為試驗材料進行正交試驗，試驗結果見表1。方差分析見表2。

由表2～6可知：消化溫度和消化時間的顯著值分別為0.000 1(P<0.05)和0.045 1(P<0.05)，可見消化溫度和消化時間對測定結果影響十分顯著；濃硫酸量的顯著值為0.095 2(0.050.10)，對測定結果無十分顯著影響。各因素影響次序分別為消化溫度>消化時間>濃硫酸量>樣品質量。

因此，當樣品質量為0.40 g，濃硫酸量為12 mL，消化溫度為420 ℃，消化時間為50 min時，消化效果最為理想，大米蛋白質測定值最高。

2.6 精密度試驗和準確度試驗

按照優化后的樣品處理方法進行精密度試驗，5種大米樣品各測定6次，計算均值和相對標準偏差。各稱取3個平行樣品，加入一定量的尿素純度標準物質進行加標試驗，同時稱取3份全麥粉粗蛋白質標準物質進行試驗，檢驗該處理方法的準確性。

由表7可知：當樣品質量為0.40 g，濃硫酸量為12 mL，消化溫度為420 ℃，消化時間為50 min時，5種大米蛋白質測定結果的相對標準偏差最大值為0.101 1，說明該方法精密度高、穩定性好。由表8可知：該處理條件下，試驗回收率結果理想，平均回收率達到了100.1%。由表9可知，標準物質的回收率也達到了98.5%，說明試驗結果準確可靠 。

? 樣品測定值和加標樣品測定值均以0.40 g樣品中氮含量計。

2.7 全自動凱氏定氮法與半微量蒸餾法的比較

采用優化后的全自動凱氏定氮法和國標方法中半微量蒸餾法(GB 5009.5—2016第一法5.1部分)分別測定5種大米的蛋白質含量，并對測定結果進行分析，結果見表10。

由表10可知，全自動凱氏定氮法和半微量蒸餾法測定蛋白質結果的差值均為正值，在0.213 2～0.381 8；測定結果比值均>1，在1.023 4～1.079 4。說明2種方法的測定結果差異不大，且全自動凱氏定氮法的測定值均要比半微量蒸餾法高，這是由于半微量蒸餾法涉及到多次樣品轉移，氮元素的損失不可避免。同時，全自動凱氏定氮法測定結果的相對標準偏差均要小于半微量蒸餾法，說明該方法穩定性要要比半微量蒸餾法好；另一方面，全自動凱氏定氮法與半微量蒸餾法相比，檢測時間由4 h縮短到1 h，并且減少了人為操作誤差，既提高了效率，又提高了結果的準確性。

3 結論

消化溫度、消化時間和濃硫酸量對大米蛋白質的測定結果有顯著影響，樣品質量亦對測定結果有一定影響，4個影響因素的影響次序為消化溫度>消化時間>濃硫酸量>樣品質量。

在測定大米蛋白質過程中，控制試樣質量為0.40 g，濃硫酸量為12 mL，消化溫度為420 ℃，消化時間為50 min，消化效果最佳，大米蛋白質測定結果較為理想，精密度試驗和準確度試驗均達到了試驗要求。該方法與傳統方法相比，操作更簡便，減少了人為誤差，保證了結果的準確性，同時耗時短，提高了工作效率。

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