基于納米金復合探針的沙門氏菌快速定量檢測

謝同彬XIE Tong-bin 梅 林

(安徽農業大學茶與食品科技學院，安徽 合肥 230036)

近年來，食品安全問題引起了世界各國的普遍重視。致病菌污染帶來的食品安全事故也經常被報道，如法國的李斯特氏菌病、日本的腸出血性大腸桿菌O157: H7 和雪印牛奶的葡萄球菌腸毒素中毒事件等[1]。由食源性致病菌引起的食品中毒事件已成為全世界舉足輕重的公共衛生問題。

沙門菌屬是一種能引起人發生傷寒、副傷寒、急性腸胃炎、敗血癥等疾病且能寄生在人和動物腸道內的重要人畜共患病病原體，食品被沙門氏菌感染對其安全構成了嚴重威脅。

目前中國國標(GB 4789.4—2016)規定沙門氏菌檢測方法的主要步驟為前增菌、分離、生化試驗和血清學鑒定等。該法耗時費力、繁瑣復雜，需 4～7 d才能得出檢測結果，且非運動型沙門菌在環境樣本中存活時間較短，需要及時處理樣本。另外檢測從不同部位分離得到的沙門氏菌，生化結果并不是完全一致的[2]，因此國標法被認為敏感度較低，檢測結果的判斷主觀性較強。除了傳統的國標法外，目前應用較多的還有免疫學技術和PCR技術[3-4]。此外，還有一些分子生物學技術：包括基因芯片技術[5]、核酸探針技術[6]等，以及電阻抗法[7]、SPR生物傳感器法[8]。但是鑒于現有的方法都存在一些問題，比如分子生物學檢測方法雖然有快速、靈敏且特異性強的優點，但成本和技術要求較高，很難得到廣泛應用；免疫學技術雖然具有重現性好、靈敏度高和較強特異性的優點，但成本較高，不適于基層實驗室推廣應用。因此，開發一種超靈敏、快速、低成本的檢測方法就顯得非常有意義。

近年來，隨著納米技術的發展，研究發現[9]納米材料不僅具有許多優良的生物學和理化特性，使得其在生物領域被廣泛應用，而且功能化的納米顆粒在食源性致病菌檢測方面能夠發揮巨大的作用。例如：量子點具有量子效應，受激發光刺激會產生熒光，能夠對食源性致病菌進行定量檢測[9-10]；納米金具有優良的光學性能，當其發生粒子團聚時，體系顏色會發生變化，可進行食源性致病菌的半定量檢測，且耗時較短[11]；由于磁性納米材料具有順磁性，當對其表面進行生物學修飾后，可以利用其優良的特異性對致病菌進行分離、富集和純化，從而能快速達到國標法前增菌的效果，大大縮短了檢測時間[12]。

本試驗擬利用量子點的優良發光性質，組裝在納米金粒子上作為顯示探針進行信號放大，再用磁性納米材料作為捕獲探針分離提取沙門氏菌，檢測量子點的熒光強度，從而定量檢測食品中的沙門氏菌含量，以期研發一種新型的快速定量檢測沙門氏菌的方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

碲粉：分析純，中國Alfa Aesar公司；

氯金酸：分析純，上海久岳化工有限責任公司；

親和素：化學純，美國Amresco公司；

巰基丙酸、EDC、NHS：分析純，美國Sigma Aldrich公司；

硼氫化鈉、氯化鎘、氯化高鐵、1，6-己二胺：分析純，國藥集團化學試劑有限公司；

所有沙門氏菌DNA序列由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。

1.2 主要儀器

透射電鏡(TEM)：JEM2100型，日本JEOL公司；

熒光/化學發光儀：Zenyth 3100型，奧地利(Anthos)公司；

集熱式磁力加熱攪拌器：DF-101S型，河南鞏義市予華儀器廠；

臺式高速冷凍離心機器：Centrifuge 5804R型，上海安亭科學儀器廠；

熒光光譜儀：F-7000型，日本日立公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 CdTe量子點的制備 采用巰基丙酸制備CdTe量子點，具體步驟為：稱取0.031 9 g碲粉于燒瓶中，稱取0.037 8 g 硼氫化鈉于5 mL離心管中，用5 mL 超純水溶解洗滌，通氮氣除氧保護；并始終冰浴以保證反應溫度；稱取0.114 2 g水合氯化鎘于三口燒瓶中，同時加入磁性轉子和100 mL超純水；用移液槍移取對應量巰基丙酸于三口燒瓶中，滴加NaOH溶液調節pH至11.2；安裝冷凝回流裝置；通入氮氣除氧30 min，將油浴鍋升溫至100 ℃；取反應7 h后的樣品，待合成液冷卻至室溫后，放入4 ℃ 冰箱儲存，備用。采用透射電鏡對其形貌進行表征，并用熒光分光光度計對量子點的光譜性質進行表征[13-14]。

1.3.2 納米金的制備 采用檸檬酸三鈉還原法制備納米金溶液，具體步驟為：準確量取100 mL新鮮配制的0.01%氯金酸溶液，于圓底燒瓶中，回流加熱攪拌至溶液沸騰，并持續10 min；然后快速加入10 mL 1%檸檬酸三鈉溶液，繼續反應10 min至溶液不再變色；停止加熱，繼續攪拌15 min直至得到棕紅色液體，待合成液冷卻至室溫后，放入4 ℃冰箱儲存，備用。用透射電鏡對其形貌進行表征[15]。

1.3.3 CdTe量子點-納米金顯示探針的制備 依據親和素-生物素特異性結合的原理，利用顯示DNA連接CdTe量子點和納米金粒子，具體步驟為：取100 μL CdTe量子點溶液，加入到200 μL含有4 mg EDC的磷酸鹽緩沖溶液(PBS)中，攪拌混合反應；將1 mg NHS加入到上述溶液中，混合反應；將80 μL 1 mg/mL 親和素加入其中，混合反應，離心。用PBS清洗一次后，再離心，將最終產品保存于4 ℃備用；取800 μL上述備用溶液，加入770 μL 顯示DNA(顯示DNA序列: SH-5'-ATA TCC ACG CAG GAA ATA ACA GGA CTT-3'-biotin)反應24 h；然后加入250 μL納米金溶液，并溫和搖晃反應16 h，離心。用0.1 mol/L NaCl和PBS的混合液清洗一次后，再離心溶解，保存于4 ℃備用。用透射電鏡對其形貌進行表征[16-17]。

1.3.4 氨基化Fe3O4磁性納米粒子的制備 采用水熱-溶劑熱方法，具體步驟為：準確稱取1.0 g 六合水氯化高鐵、6.5 g 1,6-己二胺、2.0 g無水乙酸鈉，置于50 mL具塞圓底燒瓶中，加入30 mL乙二醇，于50 ℃恒溫水浴鍋中劇烈攪拌，直至溶液變為透明酒紅色，轉移至帶有四氟乙烯內襯的高壓反應釜中，并放置于198 ℃ 烘箱中反應6 h，然后停止加熱取出，待自然冷卻至室溫時，用無水乙醇、超純水交替洗滌3～5次，于50 ℃烘箱干燥；最終得到氨基化的磁珠顆粒，存于4 ℃ 備用。用透射電鏡對其形貌進行表征[18]。

1.3.5 磁性納米粒子捕獲探針的制備 利用親和素和生物素的特異性結合原理，制備磁性納米粒子捕獲探針。具體步驟為：稱取5 mg氨基化Fe3O4磁性納米粒子，倒入含5%戊二醛的PBS溶液中，反應4 h；通過磁力收集并用PBS清洗3次；加入300 μL 1 mg/mL親和素，反應4 h；用PBS通過磁力收集清洗3次，保存于4 ℃。吸取100 μL上述溶液，再吸取100 μL 10 nmol/L捕獲DNA溶液(捕獲DNA序列: GAG CGT GCC TTA CCG ACG ATA-biotin-3')，于37 ℃反應2 h，然后用PBS磁力收集洗滌3次，存于 4 ℃備用。

1.3.6 沙門氏菌目標DNA檢測 吸取稀釋不同數量級濃度(10-1，10-2，10-3，10-4，10-5，10-6，10-7)的目標DNA溶液,(目標DNA序列: 5'-TAT CGT CGG TAA GGC ACG CTC AAT TGT CGT TAA AGT CCT GTT ATT TCC TGC GTG GAT AT-3')各100 μL和雜交緩沖溶液100 μL，于42 ℃反應2 h，磁力收集洗滌3次；然后吸取100 μL顯示探針和100 μL雜交緩沖溶液，于42 ℃反應2 h，磁力收集洗滌3次；最后用熒光光譜儀測定反應溶液的熒光強度，從而計算得出目標DNA濃度和熒光強度的線性關系。

1.3.7 復合納米探針法對含有沙門氏菌的食品樣品的檢測

為了檢驗本法的靈敏度和準確性，取人為添加不同濃度沙門氏菌(原液，10-1，10-2，10-3，10-4，10-5)的市售牛奶樣品，用成品試劑盒提取沙門氏菌DNA，然后用本方法檢測溶液的熒光強度，以此來判斷本法的可行性和準確性。

2 結果與分析

2.1 CdTe量子點的表征

由圖1可知，CdTe量子點的粒徑為4 nm左右，呈圓球形。由圖2可知，碲化鎘的最大發射波長為587 nm。

2.2 納米金粒子的透射電鏡圖

由圖3可知，納米金粒的直徑約為12.5 nm，適于作核酸標記物。

2.3 顯示探針的表征

本方法利用親和素和生物素特異性結合的原理，將顯示DNA連接上CdTe量子點，再利用巰基和納米金特異性結合的特點，使一個納米金上連接多個量子點，以起到信號放大作用。由圖4可知，每個納米金粒子已成功連接了多個量子點。

2.4 氨基化Fe3O4磁性納米粒子的透射電鏡圖

試驗采用水熱-溶劑熱法制備了氨基化的單晶Fe3O4磁性納米顆粒。由圖5可知，氨基化Fe3O4磁性納米粒子均為球狀的單晶，粒徑大約在30～60 nm。

2.5 合成的沙門氏菌目標DNA檢測

在10～1 000 fmol/L范圍內，沙門氏菌DNA濃度與熒光強度呈良好的線性關系，回歸方程為IF=0.198[DNA]+55.00，R2=0.997，且得到的檢出限為8 fmol/L。

2.6 納米探針法檢測含有沙門氏菌的食品樣品的檢測結果分析

根據《食品中致病菌限量》(GB 29921—2013)的要求，食品中不得檢出沙門氏菌。為了檢驗本法的靈敏度和準確性，取人為添加不同濃度沙門氏菌的市售牛奶樣品，用成品試劑盒提取DNA后，分別檢測含有梯度稀釋沙門氏菌濃度的牛奶(表1)，當檢測到稀釋10-5的牛奶后，再檢測稀釋1倍、2倍、5倍、10倍的熒光強度。結果顯示稀釋到2倍時，已經檢測不出。因此，將10-5再稀釋1倍的熒光強度，帶入2.5得到的方程中，計算得出最低檢出限是4 fmol/L。

3 結論

為了適應檢測需要，避免現有方法存在的缺陷，本試驗利用發光量子點的高靈敏度，將多個量子點結合到納米金上進行信號放大，以達到超靈敏的檢測目的，克服了國標方法需要前增菌的繁瑣步驟。此外，利用磁性納米材料的磁分離作用，免去了以往的提取分離步驟。同時，本方法一次性制得的顯示探針和捕獲探針溶液，可以多次使用，減少成本，相比分子生物學和免疫學檢測技術的高成本、高技術要求，具有良好的應用推廣前景。

對于沙門氏菌的檢測，該法顯示了良好的穩定性，在10～1 000 fmol/L范圍內，沙門氏菌DNA濃度與熒光強度呈現出良好的線性關系，回歸方程為IF=0.198[DNA]+55.00，R2=0.997，得到的檢出限為8 fmol/L。在檢測被沙門氏菌污染的牛奶樣品中，也顯示了優良的應用性，最低檢出限為4 fmol/L。需要指出的是，最低檢測限的不同主要是由于將不同濃度的沙門氏菌液加入到牛奶中，用試劑盒提取沙門氏菌DNA，通過這個過程，與直接檢測合成的沙門氏菌DNA序列濃度相比更加準確，同時也反映了在今后檢測實際樣品中沙門氏菌時，本法具有更好的靈敏度，可以達到超靈敏檢測的目的。

鑒于納米金和量子點復合探針的優良檢測特性，以及磁性納米探針的特異分離效應，本試驗研發了一種快速、簡便、低成本、高靈敏度的沙門氏菌新型快速定量檢測技術。后續試驗將繼續優化檢測條件，證實本法的特異性和靈敏度，并擴大其應用范圍。

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