煙葉蛋白高效降解菌的篩選鑒定及其作用效果研究

2017-04-06 19:02:27楊宗燦Zongcan馮穎杰王鵬飛張耀廣楊永鋒李家美劉向真王紅霞

食品與機械 2017年11期

楊宗燦 Zong-can 馮穎杰 - 劉超王鵬飛 - 張展張耀廣 - 楊永鋒 - 李家美 - 劉向真 - 王紅霞 -

(1. 河南中煙工業有限責任公司技術中心，河南鄭州 450000；2. 河南農業大學生命科學學院，河南鄭州 450000)

蛋白質是煙葉中主要的含氮化合物[1]，其含量對煙葉的吸食品質影響較大，對煙氣飽滿和煙香的豐富性具有重要作用。但是，蛋白質含量過高會導致煙葉在燃吸時產生似燃燒羽毛的臭味，并產生辛辣、苦澀感[2]。同時，蛋白質還是煙葉中許多有害成分的前體物質[3-5]。一般來說，優質烤煙的蛋白質含量在7%～11%[6]，而目前中國國產烤煙蛋白質含量普遍較高，尤其是河南產區的煙葉。因此有效降低煙葉蛋白質，使其維持在合理范圍，是提高煙葉品質的重要途徑。

蛋白質屬于大分子化合物，在自然陳化條件下降解緩慢，通過生物技術加速降解煙葉蛋白具有重要意義。目前的研究[7-8]主要集中在酶法降解和微生物發酵降解，前者具有降解時間短、降解效率高的優勢，但蛋白酶成本較高，導致其難以在工業中大規模的應用；而后者以成本低廉和工藝簡單成為了當前的研究熱點。李梅云等[9]將微球菌屬或桿菌屬的細菌在濃度為107CFU/mL時處理K326片煙，蛋白質降解率最高時為24.46%；馬玲玲[10]從煙葉表面篩選出一株枯草芽孢桿菌，噴施于煙葉表面，蛋白質降低了20.00%。但目前為止，利用微生物發酵法降解煙葉蛋白依然存在蛋白酶活性不高，蛋白降解率偏低等問題，難以在工業生產中推廣應用。

為獲得能夠高效降解煙葉蛋白質的菌株，提高煙葉品質，本研究從不同年份、不同等級復烤煙葉表面篩選出一株蛋白酶高產菌株，并對其進行鑒定及應用效果探索，以期為高蛋白含量煙葉在卷煙中的應用提供新的選擇。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 煙葉

用于菌株篩選的煙葉：采自河南(許昌和三門峽)、福建(三明和南平)以及云南(楚雄和臨滄)6個產地，3個年份(2011～2013年)的復烤煙葉，共計18份；

供試煙葉(作用效果考察用)：河南許昌C3F。

1.1.2 主要試劑

酪素、牛血清白蛋白：分析純，美國Fluka公司;

馬鈴薯、玉米漿、豆粕：市售;

其他試劑：分析純，國藥集團化學試劑有限公司。

1.1.3 培養基

營養瓊脂(NA)培養基：胰蛋白胨10 g，牛肉膏3 g，氯化鈉 5 g，去離子水定容至1 000 mL，pH 7.0，固體培養基加15 g 瓊脂粉，121 ℃滅菌20 min，用于細菌的分離與培養；

YEPD培養基：酵母膏10 g，蛋白胨20 g，葡萄糖20 g，去離子水定容至1 000 mL，pH 7.0，固體培養基加入15 g瓊脂粉，121 ℃滅菌20 min，用于酵母的分離和培養；

馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)培養基：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂粉12 g，去離子水定容至1 000 mL，固體培養基加15 g瓊脂粉，121 ℃滅菌20 min，用于煙葉表面真菌的分離與篩選；

初篩培養基：KH2PO40.36 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，ZnCl20.014 g，Na2HPO4·12H2O 1.07 g，NaCl 0.16 g，CaCl2·H2O 0.002 g，FeSO4·7H2O 0.002 g，脫脂奶粉10.0 g，瓊脂15 g，去離子水定容至1 000 mL，pH 7.0，121 ℃滅菌20 min；

復篩培養基：玉米漿15.0 g，豆粕15 g，蛋白胨1.0 g，NH4Cl 5.0 g，KH2PO41.0 g，Na2HPO45.0 g，MgSO4·7H2O 0.2 g，MnSO40.1 g，pH 7.0，去離子水定容至1 000 mL，121 ℃ 滅菌20 min。

1.1.4 主要儀器

分光光度計：WFJ2100型，尤尼柯(上海)儀器有限公司；

冷凍離心機：Sigma2-16K型，德國Sigma公司；

PCR儀：Mastercycler nexus X型，德國Eppendorf公司。

1.2 方法

1.2.1 煙葉中微生物的初步分離稱取0.5 g煙葉粉末，加入含有4.5 mL無菌水的10 mL滅菌試管中，于搖床200 r/min 水平震蕩15 min，然后豎直靜置5 min。用移液槍吸取上清菌懸液1 mL于含有9 mL無菌水的滅菌10 mL試管中，依次稀釋為10-2和10-3的菌懸液；分別吸取10-2、10-3稀釋度的菌懸液100 μL，涂布于NA和PDA培養基平板，分別于37，28 ℃培養過夜。

觀察菌落大小、形態特征，對不同菌落進行編號，記錄菌落特征及長勢。

1.2.2 產蛋白質降解菌篩選將上述分離獲得的細菌、真菌依次接種到蛋白質降解菌選擇培養基上，細菌在37 ℃培養，真菌在30 ℃培養。觀察并計算透明圈直徑與菌落直徑的比值和透明圈明顯程度，通過統計學分析選擇出酶活較高的菌株。

將能夠在蛋白質降解菌選擇培養基上產生透明圈的菌株，按菌株種類的不同接種到NA或YEPD培養基，37 ℃或30 ℃下150 r/min震蕩培養12 h，按照2%的接種量接入50 mL 產蛋白酶發酵培養基的錐形瓶中，37 ℃下150 r/min發酵48 h。取發酵液于3 500 r/min離心10 min后取上清液，測酶活。

1.2.3 蛋白質降解菌的蛋白酶活性測定采用福林酚法[11]，以2%的酪蛋白溶液為底物。

1.2.4 煙葉蛋白含量的測定采用Brad-Ford法[12]，以牛血清白蛋白為標準。

1.2.5 蛋白質降解菌的16S rDNA分析菌株總DNA的提取，采用改良的SDS方法進行提取。PCR擴增采用通用引物，得到的PCR產物經1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測合格后送至上海鉑尚生物技術有限公司進行測序，測序結果在NCBI數據庫中利用BLAST進行序列分析。

下載同源性較高菌株的16S rDNA序列，與測得序列通過DNAMAN軟件進行序列比對分析。

1.2.6 煙葉中蛋白質降解菌的形態學與理化鑒定在NA固體培養基上，37 ℃培養48 h后，觀察菌落外部形態特征；使用顯微鏡油鏡觀察細菌形態[13]。

參照文獻[14]對蛋白酶產生菌HN-3進行革蘭氏染色、接觸酶反應、V-P反應、酪素水解反應等試驗。

1.2.7 菌株降解煙葉蛋白質的應用將保藏的HN-3菌株轉接到NA培養基內，于37 ℃、150 r/min震蕩培養24 h，至菌懸液OD值為2.0時，3 600 r/min離心10 min，棄上清，加入等體積的無菌生理鹽水，得到種子液。

取100 g許昌復烤煙葉，選擇發酵時間、施加菌液量、發酵溫度為影響因素，通過單因素試驗確定了各因素的水平范圍，并設計三因素三水平正交試驗，優化菌株有效降解煙葉蛋白質的適宜條件[15]。正交試驗因素和水平見表1。

將煙葉切絲，制成煙支規格(20+64) mm×24.5 mm的煙支樣品，在22 ℃、相對濕度60%的恒溫恒濕箱中平衡48 h后待評。由11名專業評吸員按9分制打分，匯總結果去除最高分和最低分后取平均值。

2 結果與分析

2.1 蛋白質降解菌的初篩

從不同類型復烤煙葉樣品中，經菌落大小、顏色、形態分析，共分離獲得細菌123株，真菌9株。這些細菌、真菌經蛋白質降解菌選擇培養基篩選，獲得能夠產生透明圈的菌株18株。

18株菌株在蛋白質降解菌選擇培養基上生長48，72 h之后產生的透明圈分別見圖1、2。

進一步測定18株菌株在蛋白質降解菌選擇培養基上生長48，72 h之后透明圈/菌落直徑比值的平均值，并通過均值方差分析法分析差異顯著性，結果見表2。

? 99% 整體置信區間，分組中不共享字母的均值之間具有顯著差異；*表示由于該菌落形態極不規則，無法計算直徑，或長度無法計算，或透明圈與菌落直徑比值無法計算。

方差分析結果表明，48 h和72 h的透明圈菌落直徑比中，HN-3、YN-6和YN-10的比值較大，差異性分組均不共享字母，差異性顯著。HN-4的48 h比值差異不顯著，考慮到72 h的結果差異顯著以及透明圈較大，列為待考察菌株。YN-13和FJ-18菌落形態不規則，但實際觀察中透明圈較大，因此同樣列為待考察菌株。

2.2 煙葉中蛋白質降解菌的復篩

將6個菌株接種于產蛋白酶培養基上，30 ℃下150 r/min振蕩培養48 h后，經測定OD660并計算，結果見圖3。其中，HN-3具有最高的蛋白酶活力(3 417 U/mL)，因此選擇為試驗菌株，應用于煙葉蛋白的降解。

2.3 菌株的16S rDNA序列測定

采用16S rDNA基因片段通用引物FP/RP，對HN-3進行PCR擴增以及克隆測序，獲得一條1 422 bp的片段，將測序結果與NCBI數據庫中的基因序列進行比對，發現HN-3與短小芽孢桿菌的同源性高達100%，確定HN-3是短小芽孢桿菌。使用DNAMAN軟件，選取同源性較高的7種模式細菌菌株，進行系統進化分析，顯示HN-3與短小芽孢桿菌的親緣關系最近(圖4)。

2.4 HN-3的形態學觀察

在37 ℃培養48 h后，HN-3菌落呈白色至淡黃色，表面無光澤，不透明，表面不平整，凸起，菌落近圓形或不規則，菌落邊緣不規則，在蛋白質降解菌選擇培養基上生長速度較快。菌株個體0.6～0.7 μm×2.0～3.0 μm，呈桿狀(圖5)，很少呈鏈狀，芽孢橢圓形。

2.5 HN-3的理化鑒定

HN-3經試驗分析，發現該菌革蘭氏染色呈陽性，甲基紅反應呈陰性，接觸酶反應呈陽性，V-P測驗呈陽性，產酸反應呈陽性，在7% NaCl中不能生長，酪素水解反應呈陽性，淀粉水解反應呈陽性，硝酸鹽還原試驗呈陰性，最低生長溫度10 ℃，最高生長溫度50 ℃(表3)。參考《伯杰細菌鑒定手冊》[16]，確定HN-3為短小芽孢桿菌。

2.6 HN-3降解煙葉中蛋白質的效果

測得對照煙葉的蛋白質含量為112.47 mg/g。由表4可知，最優水平組合為A3B1C2，即時間為84 h、菌液施加比例為3%、發酵溫度為37 ℃；菌液施加比例對整個作用條件的影響最大，其次是發酵溫度，而發酵時間的影響最小。

由于最優化組合A3B1C2并不在9組正交處理方案中，因此對優化處理方案進行了驗證實驗。結果表明，將菌液按照3%的煙葉質量比例施加于抽梗后的煙葉表面，在溫度為37 ℃的條件下發酵84 h后，煙葉中蛋白質降解率可達最高值(29.66%)。

2.7 HN-3處理煙葉后感官評吸效果

進一步對菌液處理前后的煙葉進行感官質量評價，結果見表5。

由表5可知，煙葉經過菌液處理后，香氣質變好，香氣量、煙氣濃度有所提高，雜氣減少，余味有所改善，與對照相比，總得分提高1.13分，煙葉整體感官質量得到明顯提升。

?T=(A+B)×2.3+C×1.5+D+E+F+G。

3 結論

本研究從不同類型復烤煙葉樣品中分離出18株蛋白質降解菌株，觀察其在蛋白質降解菌選擇培養基上生長48 h和72 h降解蛋白質的情況可知，HN-3、HN-4、YN-6、YN-10、YN-13、FJ-18降解蛋白的能力較強。進一步測定菌株蛋白質酶活力表明，6種菌株的蛋白酶活性分別為3 417，2 217，3 246，2 789，2 217，3 017 U/mL，蛋白酶活力最高的菌株是在蛋白質降解菌選擇培養基上生長快且透明圈與菌落直徑比值較大的HN-3。

通過16Sr DNA測序，HN-3與短小芽孢桿菌(Bacilluspumilus)的同源性高達100%，親緣關系最近，結合形態學與理化特性，參考《伯杰細菌鑒定手冊》，確定HN-3為短小芽孢桿菌(Bacilluspumilus)。在之前的研究中，黃靜文等[17]從烤煙表面分離到1株短小芽孢桿菌Van35，將其制成菌液施用于卷煙煙絲，22 ℃于60%恒溫恒濕箱發酵20 d，結果表明，煙葉纖維素含量、總氮均明顯降低，短小芽孢桿菌處理后的煙葉，煙香、細膩醇均明顯提升，煙葉刺激性、雜氣均明顯下降，但未報道短小芽孢桿菌Van35是否具有降解煙葉中蛋白質的功能。本研究將由HN-3制成的菌液噴施于煙葉表面，煙葉中蛋白質降解率可達29.66%，證明短小芽孢桿菌HN-3能有效降解煙葉中的蛋白質，且能顯著改善煙葉的整體感官質量。綜合之前研究可推測短小芽孢桿菌可有效降解煙葉中蛋白質、纖維素等大分子物質，減少這些大分子物質在煙葉燃吸時產生的刺激氣體等，從而有效改善煙葉的吸食品質，相關結果有待進一步驗證。

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