高溫處理對牛肉蛋白質組分及其降解的影響

鄒良亮ZOU Liang-liang 康懷彬,2 -,2 張慧蕓,2 -,2 謝安國,2 -,2 蔡超奇 - 王 波

(1. 河南科技大學食品與生物工程學院，河南 洛陽 471023;2. 食品加工與安全國家級實驗教學示范中心，河南 洛陽 471023)

高溫肉制品是指加熱介質溫度高于100 ℃(通常為115～121 ℃)，中心溫度高于115 ℃并恒定適當時間的肉制品。由于蒸煮溫度較高，牛肉高溫肉制品中細菌含量低甚至不含菌，產品保質期長更適合流通，并且具有營養衛生、攜帶方便等特點而深受消費者喜愛[1]。而在高溫處理過程中蛋白質的變性、降解和氧化對牛肉制品最終的品質起著重要作用。目前國內外對于蛋白質降解的研究多集中在干腌火腿、風鴨等加工過程中的變化，如趙改名等[2]研究了金華火腿在加工過程中蛋白質及游離氨基酸的變化。熱處理方面也主要集中于煮制條件在100 ℃以下的低溫肉制品，如顧偉剛等[3]對3種豬肉湯體系中蛋白質降解產物進行了比較，戴研等[4]研究了歐姆加熱對豬肉蛋白質降解的影響，但是對于蛋白質組分的變化卻未有相關研究報道。

而對于高溫肉制品，尤其是高溫處理過程對牛肉蛋白質組分及其降解的影響尚未有過報道。因此本試驗以不同處理溫度及時間的牛背最長肌為研究對象，通過對其不同溶解性和不同結構蛋白質的含量，總氮、非蛋白氮、氨基態氮的含量，蛋白質水解指數以及全肌肉蛋白質十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳進行研究分析，為牛肉高溫肉制品的現代化工藝改進提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

牛背最長肌(取樣前已排酸3 d)：夏洛萊公牛(18月齡)，河南伊賽牛肉股份有限公司；

三氯乙酸、磷酸氫二鈉、溴酚藍、異丙醇：分析純，天津市德恩化學試劑有限公司；

丙烯酰胺、四甲基乙二胺(TEMED)、N,N，-亞甲基雙丙烯酰胺、考馬斯亮藍G250、考馬斯亮藍R250、十二烷基磺酸鈉(SDS)：分析純，美國Sigma公司；

牛血清白蛋白、羥脯氨酸：分析純，上海伊卡生物技術有限公司。

1.2 儀器與設備

全自動凱式定氮儀：K9860型，濟南海能儀器股份有限公司；

紫外可見分光光度計：V-LS-30型，尤尼柯上海儀器有限公司；

高速分散均質機：FJ-200型，上海標本模型廠；

高速離心機：H1650型，長沙湘儀離心機儀器有限公司；

穩壓穩流型電泳儀：DYY-6C型，北京市六一儀器廠；

凝膠成像儀：Gel-Doc-XR+型，美國Bio-Rad公司；

高壓蒸氣滅菌鍋：TYAIB型，寧波久興醫療器械有限公司；

無線溫度傳感器：Ellab-TrackSense-Pro型，丹麥Ellab公司。

1.3 方法

1.3.1 牛肉樣品的預處理及高溫處理 順著肉樣紋理，將牛背最長肌中肉眼可見的表面脂肪、夾層脂肪剔除干凈，并修整切割成大小均勻的方形肉塊(5 cm×5 cm×1 cm)，用蒸煮袋真空密封包裝，隨后放入高壓蒸氣滅菌鍋中進行高溫處理。參考張莉莉[5]21的方法，高溫處理條件為：高壓蒸氣滅菌鍋壓力0.12 MPa，當溫度達到(110±1)，(115±1)，(121±1) ℃ 后分別保持3，6，9，12，15 min，高溫處理后的牛肉樣品靜置冷卻后放在4 ℃冰箱冷藏待測。

1.3.2 牛肉樣品高溫處理傳熱曲線繪制 高溫處理過程中，牛肉樣品中心溫度參考張莉莉[5]22的方法，用無線Ellab-TrackSense-Pro溫度傳感器進行數據記錄。

1.3.3 牛肉樣品蛋白的提取

(1) 不同溶解性蛋白的提取：參照Visessanguan等[6]的方法，并作適當修改，稱取1 g左右(精確至0.001 g)處理過的肉樣，加入10倍體積pH 3.0鹽酸溶液，10 000 r/min 均質1 min，6 500 r/min 冷凍(4 ℃)離心15 min，所得上清液即為酸溶性蛋白。另取1 g肉樣，加入10倍體積預先冷卻至4 ℃的提取液A(3.5 mmol/L磷酸二氫鈉，15.6 mmol/L磷酸氫二鈉，pH 7.0)，10 000 r/min均質1 min，6 500 r/min冷凍(4 ℃)離心15 min，此步驟重復2次，將上清液合并，沉淀備用。在上清液中加入50%三氯乙酸至終濃度為10%，6 500 r/min 冷凍(4 ℃)離心15 min，所得沉淀即為水溶性蛋白。在第1次離心所得的沉淀中加入10倍體積預先冷卻至4 ℃的提取液B(3.5 mmol/L磷酸二氫鈉，15.6 mmol/L 磷酸氫二鈉，0.45 mol/L氯化鈉，pH 7.0)，10 000 r/min 均質1 min，8 500 r/min冷凍(4 ℃)離心15 min，此步驟重復2次，上清液合并即為鹽溶性蛋白。所得沉淀中加入10倍體積的0.1 mol/L氫氧化鈉，6 500 r/min冷凍(4 ℃)離心15 min，上清液即為堿溶性蛋白。

(2) 不同結構蛋白的提取：參考Hashimo等[7]的方法，并作適當修改，稱取1 g左右(精確至0.000 1 g)處理過的肉樣，加入10倍體積20 mmol/L磷酸鹽緩沖液(3.5 mmol/L磷酸二氫鈉，15.6 mmol/L磷酸氫二鈉，0.45 mol/L氯化鈉，pH 6.5)，10 000 r/min均質1 min，10 000 r/min 冷凍(4 ℃)離心10 min，上清液即為肌漿蛋白。上述沉淀重新溶于30 mmol/L pH 6.5的磷酸鹽緩沖液，10 000 r/min 均質30 s，10 000 r/min冷凍(4 ℃)離心10 min，除去上清液，沉淀溶于0.1 mol/L pH 6.5的磷酸鹽緩沖液，加入迭氮鈉和碘化鉀至最終濃度為0.02%和0.7 mol/L，10 000 r/min 冷凍(4 ℃)離心10 min，所得上清液即為肌原纖維蛋白。膠原蛋白的提取參照Eilert等[8]的方法，準確稱取1 g肉樣后加入9 mL 25%的Ringer溶液，10 000 r/min均質1 min，55 ℃水浴10 min，12 000 r/min冷凍(4 ℃)離心25 min，上清液即為膠原蛋白，此步驟重復3次。膠原蛋白含量測定參照GB/T 9695.23—2008《肉與肉制品 羥脯氨酸含量測定》，羥脯氨酸含量乘以9.75即為膠原蛋白含量。

1.3.4 蛋白質濃度的測定 采用考馬斯亮藍法。

1.3.5 總氮(TN)、非蛋白氮(NPN)、蛋白水解指數(PI)的測定

(1) 總氮：按GB/T 5009.5—2003執行。

(2) 非蛋白氮：參照趙改名等[3]的方法，并作適當修改，稱取1 g左右(精確至0.000 1 g)肉樣，加入10倍體積的15%三氯乙酸，10 000 r/min均質1 min，25 ℃靜置1 h，6 500 r/min 冷凍(4 ℃)離心15 min，取上清液過濾。

(3) 蛋白水解指數：總氮用凱氏定氮法測定，非蛋白氮用微量凱氏定氮法測定，按式(1)計算蛋白水解指數。

(1)

式中：

PI——蛋白水解指數，%；

NPN——非蛋白氮含量，%；

TN——總氮含量，%。

1.3.6 氨基態氮含量的測定 按ZB X 66038—87執行。

1.3.7 全肌肉蛋白SDS-PAGE電泳

(1) 全肌肉蛋白的提取：參考Bechtel等[9]的方法，稱取1 g左右(精確至0.000 1 g)處理過的肉樣，加入10 mL提取液(10 mmol/L Na2HPO4-NaH2PO4，1% SDS，pH 7.0)，11 000 r/min 均質1 min，4 ℃靜置1 h，10 000 r/min冷凍(4 ℃)離心15 min，所得上清液即為全肌肉蛋白溶液。

(2) SDS-PAGE電泳：采用Laemimli[10]的電泳體系，并參考姜啟興[11]50的方法，分離膠濃度為12%，濃縮膠濃度為5%。

1.4 數據處理

采用SPSS 19.0統計軟件進行數據分析。

2 結果與分析

2.1 牛肉高溫處理傳熱曲線

將牛背最長肌置于高壓蒸氣滅菌鍋中，待溫度分別達到(110±1)，(115±1)，(121±1) ℃時繪制高溫處理傳熱曲線，結果見圖1。在加熱前20 min，牛肉中心部位溫度急劇上升，并迅速接近至加熱介質溫度，升溫速率不斷增加。而在加熱后期則升溫速率明顯變緩，可能是隨著溫度的升高，牛肉表面的蛋白質變性產生了不溶性的凝膠，阻礙了熱量從牛肉表面向中心部位傳遞[5]23。

2.2 不同溶解性、不同結構蛋白質含量的變化

由表1可知，在原料牛背最長肌不同溶解性蛋白中，含量最高的為堿溶性蛋白，占7.13%，不同結構蛋白含量最高的是肌原纖維蛋白，為87.21 mg/g。水溶性蛋白含量在加熱初期與原料相比顯著降低(P<0.05)，并隨溫度的升高和時間的延長呈下降趨勢，可能是由于水溶性的肌漿蛋白變性導致的。121 ℃加熱15 min后，水溶性蛋白較原料下降了57.37%。

鹽溶性蛋白含量的變化趨勢與水溶性蛋白相似，與孫麗等[12]研究的蒸煮對金槍魚蛋白質熱變性的結果一致，可能是鹽溶性的肌原纖維蛋白受熱降解造成的。酸溶性蛋白含量隨著加熱時間的延長先下降后輕微上升，差異不顯著(P>0.05)。堿溶性蛋白含量在110 ℃時，隨著加熱時間的延長而升高，而在115，121 ℃時呈先升高后下降、最后增加的趨勢。堿溶性蛋白在加熱后期含量增加主要是由肌漿蛋白和肌原纖維蛋白受熱變性生成了不溶于水和鹽溶液但溶于0.1 mol/L NaOH溶液的凝結物造成的。

? 同列上標字母不同表示差異顯著(P<0.05)。

肌漿蛋白和肌原纖維蛋白含量均隨溫度的升高和時間的延長而快速下降，121 ℃加熱15 min后，肌漿蛋白含量下降了86.9%，肌原纖維蛋白含量下降了89.88%。肌漿蛋白和肌原纖維蛋白受熱變性降解成小分子的蛋白質或多肽和游離氨基酸，從而導致了其含量急劇下降[13]。隨著加熱時間的延長，膠原蛋白含量先下降后基本保持平緩，加熱初期下降主要是膠原蛋白隨著加熱溫度的升高和時間的延長而降解成小分子蛋白，甚至進一步降解成明膠而溶出，而加熱后期保持平緩是因為膠原蛋白全部變成了可溶性的膠原。Kong等[14]在研究鮭魚時也發現，當加熱到121.1 ℃時，90%的膠原已經溶出。

2.3 總氮、非蛋白氮及蛋白水解指數的變化

總氮、非蛋白氮及蛋白水解指數的變化可以客觀地反映牛背最長肌在高溫處理過程中蛋白質的降解，結果見表2。

牛背最長肌經高溫處理后總氮含量顯著升高(P<0.05)，并在110 ℃ 加熱9 min時達到最大值(14.02%)。隨著處理溫度的升高，總氮含量呈下降的趨勢，可能是由部分水溶性含氮物質溶解到滲出液中，或者部分揮發性含氮物的損失造成的。在高溫處理初期非蛋白氮含量均顯著升高(P<0.05)，加熱6 min后變化不顯著(P>0.05)。高溫處理15 min后，110，115 ℃條件下的非蛋白氮含量相差不大。110，115 ℃時，非蛋白氮含量均先上升后下降，主要是因為游離氨基酸和多肽分子的聚集，其中水溶性氨基酸和肽類分子轉移到滲出液中，使牛肉樣品中非蛋白氮的含量降低[15]。在121 ℃時非蛋白氮含量先上升后下降再趨于平緩，與常亞楠[16]研究煮制條件對雞腿中總氮和非蛋白氮含量影響的結果相一致。蛋白水解指數隨加熱溫度的升高和時間的延長先升高后下降，牛背最長肌在加熱初期蛋白水解指數變化顯著(P<0.05)。高溫處理9 min時，115 ℃條件下的蛋白水解指數比110，121 ℃ 條件下的都大，為4.58%；而在高溫處理15 min時，121 ℃ 條件下的蛋白水解指數達到最大值(5.94%)。隨著高溫處理過程的不斷進行，在加熱后期蛋白水解指數呈下降趨勢，可能是牛肉中水分活度不斷降低、pH值發生改變以及離子濃度的升高阻礙了蛋白質的分解。

表2處理溫度和處理時間對牛背最長肌總氮、非蛋白氮及蛋白水解指數的影響?

Table 2 Effects of different treatment temperature and time on TN, NPN and PI of beef longissimus dorsi muscle (n=3)

? 同列上標字母不同表示差異顯著(P<0.05)。

2.4 氨基態氮含量的變化

不同高溫處理后的牛背最長肌氨基態氮含量見圖2。

Figure 2 Effects of different treatment temperature and time on content of amino nitrogen in beef longissimus dorsi muscle (n=3)

隨著加熱時間的延長，牛背最長肌中氨基態氮含量呈現上升趨勢(P<0.05)，蛋白質水解作用不斷增強。相同加熱時間下，溫度越高，氨基態氮含量越高，表明在較高的溫度下，蛋白質的一級結構被破壞，蛋白質發生降解并且其肽鍵斷裂，從而使得游離的氨基增多[17]。隨著加熱時間延長，氨基態氮含量呈現先平緩后上升后基本平衡的趨勢(P>0.05)，110 ℃較115，121 ℃條件下增長趨勢緩和，氨基態氮含量最終分別增加了0.015%，0.035%，0.037%。這與姜啟興[11]49研究鳙魚肉加工特性時的結果基本一致，主要是因為牛背最長肌中含有較多大分子量的肌原纖維蛋白和膠原蛋白，而且肌纖維直徑大密度小，受熱沖擊強烈，從而在加熱過程中隨溫度的升高釋放出更多的游離氨基。

2.5 SDS-PAGE凝膠電泳分析

將不同高溫處理后的牛背最長肌全肌肉蛋白進行SDS-PAGE凝膠電泳，結果見圖3。

由圖3可知，隨著處理溫度的升高和加熱時間的延長，牛背最長肌中蛋白質發生了降解聚集從而導致許多電泳條帶消失以及新條帶產生。結合圖3(b)可知，加熱處理后的牛背最長肌相較于生鮮牛肉的電泳條帶，在200.0～66.4 kDa和44.3～29.0 kDa條帶范圍內出現了明顯的模糊變淡現象，表明蛋白質發生了高度降解。200.0 kDa的肌球蛋白重鏈(myosin heavy chain，MHC)隨著加熱溫度的升高和時間的延長逐漸變淡，而在121 ℃加熱時則完全消失，與Jiraporn Runglerdkriangkrai等[18]研究魚丸高溫殺菌時，發現116 ℃加熱3 min時，MHC條帶明顯變淺，加熱至6 min時則幾乎完全消失的結果基本一致。而29.0～44.3 kDa的蛋白質只在加熱初期發生了輕微降解，44.3 kDa的肌動蛋白在整個高溫處理過程中都無明顯的變化，表明肌動蛋白比肌球蛋白的熱穩定性明顯要高，與Tornberg等[19]在雞肉加熱過程中發現肌動蛋白電泳條帶比肌球蛋白條帶消失更慢的結果相一致。隨著處理溫度的升高和時間的延長，MHC電泳條帶上部的顏色會加深，可能是高溫使蛋白質發生了過度聚合變性，產生了聚集現象。

Figure 3 SDS-PAGE of proteins from beef longissimus dorsi muscle at different treatment temperature and time

3 結論

(1) 在高溫處理過程中，牛背最長肌中的蛋白質高度降解，蛋白質組分發生了明顯變化。水溶性蛋白和鹽溶性蛋白均隨加熱溫度的升高和時間的延長而急劇下降，膠原蛋白含量先下降后基本保持平穩。121 ℃加熱15 min后，牛背最長肌中肌漿蛋白含量下降了86.9%，肌原纖維蛋白含量下降了89.88%。

(2) 隨著加熱時間的延長總氮含量呈先升高后降低的趨勢，并在110 ℃加熱9 min時達到最大值，為14.02%。加熱溫度對非蛋白氮和蛋白水解指數影響不顯著(P>0.05)，而加熱時間則對其影響顯著(P<0.05)。隨著加熱時間的延長氨基態氮含量呈上升的趨勢，110 ℃較115，121 ℃條件下增長趨勢緩和，最終分別增加了0.015%，0.035%，0.037%。

(3) 牛背最長肌中200 kDa的肌球蛋白重鏈條帶隨著加熱時間的延長逐漸變淡消失，并在200～66.4 kDa和44.3～29.0 kDa條帶范圍內表現出明顯的模糊變淡，而44.3 kDa的肌動蛋白在整個高溫處理過程中均無明顯的變化。

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