山皂莢多糖的提取工藝及抑菌活性

高 潔董文賓 王 勇 王 燕

(1. 陜西國際商貿學院醫藥學院，陜西 咸陽 712046；2. 陜西科技大學，陜西 西安 710000；3. 陜西省食品加工工程技術研究中心，陜西 西安 710000；4. 陜西農產品加工技術研究院，陜西 西安 710000)

山皂莢多糖的提取工藝及抑菌活性

高 潔1董文賓2,3王 勇4王 燕1

(1. 陜西國際商貿學院醫藥學院，陜西 咸陽 712046；2. 陜西科技大學，陜西 西安 710000；3. 陜西省食品加工工程技術研究中心，陜西 西安 710000；4. 陜西農產品加工技術研究院，陜西 西安 710000)

以山皂莢多糖為研究對象，在單因素的基礎上，以液固比、提取時間、提取溫度作為主要影響因素，使用響應面設計法優化了山皂莢多糖的提取工藝，并使用濾紙片擴散法對所提多糖進行抑菌活性試驗。結果表明：山皂莢多糖的最佳提取工藝為：液固比50∶1(mL/g)，提取溫度65 ℃，提取時間80 min，山皂莢多糖的得率可達(31.52±0.54)%；山皂莢多糖溶液濃度為100 mg/mL時，對細菌的抑菌效果為：沙門氏菌<大腸桿菌<蠟樣芽孢桿菌<枯草芽孢桿菌<金黃色葡萄球菌，山皂莢多糖抑制金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、沙門氏菌、枯草芽孢桿菌、蠟樣芽胞桿菌的最小抑菌濃度分別為25，50，50，25，50 mg/mL。

山皂莢；多糖；抑菌活性

皂莢(GleditsiasinensisLam. )系豆科蘇木亞科(或云實亞科)的多年生木本植物。皂莢中主要含有鞣質、酚性物質、生物堿、有機酸、糖類、油脂等化學成分[1]，其具有抗菌[2-3]、殺蟲[4]、抗病毒[5]、免疫調節[6]等功效，現有的皂莢成分研究多集中在皂苷上，而皂莢中多糖的含量遠大于皂苷，皂莢多糖藥用價值較高，可提高免疫力[7]、保肝護肝[8-9]、抗菌消炎[10]等。

植物多糖的分離提取方法較多，主要有酶提取法、微波輔助法、超聲波提取法等[11]，它們雖優點較多，但有機溶劑使用量大，條件不易控制，且影響因素較多。而水提法相比其他提取方法具有便捷、經濟、適合量化生產等特點。本研究擬采用水提取法提取山皂莢多糖，在單因素試驗的基礎上，采用響應曲面法對提取條件進行優化，并研究不同濃度的山皂莢多糖對5種細菌的抑菌效果，旨在為皂莢資源的有效利用及工業化生產提供試驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

山皂莢：采摘于陜西省安康寧陜縣旬陽壩鎮平河梁，經陜西中醫藥大學雷國蓮教授鑒定為山皂莢Gleditsiajaponic.miq；

無水乙醇：分析純，西安福晨化學試劑有限公司；

其他試劑均為分析純；

金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、枯草芽抱桿菌(Bacillussubtilis)、蠟狀芽胞桿菌(Bacilluscereus)、大腸桿菌(Escherichiacoli)、沙門氏菌(S.typhimurium)：陜西科技大學生物工程實驗教學中心；

牛肉膏-蛋白胨瓊脂培養基[12-13]：牛肉膏3 g，蛋白胨10 g，瓊脂20 g，氯化鈉5 g，水1 000 mL，pH 7.0～7.2。

1.1.2 主要儀器設備

真空干燥箱：DZF-6020型，上海赫田科學儀器有限公司；

電熱恒溫水浴鍋：HH-M4型，上海赫田科學儀器有限公司；

旋轉蒸發儀：RE-52A型，上海亞榮生化儀器廠；

循環水多用真空泵：SHZ-D(III) 型，鄭州長城工貿有限公司；

離心機：TGL-16B型，上海安亭科學儀器廠；

紫外可見分光光度計：TU-1810型，北京普析通用儀器有限責任公司；

壓力蒸氣滅菌鍋：YXQ-LS-100A型，濟南捷島分析儀器有限公司；

電熱恒溫培養箱：HT-350B型，上海赫田科學儀器有限公司；

透析袋：MD25(8 000-14 000)型，上海歐韋達儀器科技有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 山皂莢多糖的制備 取去籽后的山皂莢莢果，粉碎過5號篩，干燥后得皂莢粉末。用天平稱取5 g，加入體積分數為80%的乙醇，浸制預處理10 h，旋轉蒸發儀內蒸出乙醇，殘留液乙醇洗滌后進行干燥，得預處理山皂莢干粉。稱量山皂莢干粉5 g，蒸餾水回流提取2次，合并濾液，紗布過濾，濾液離心(3 000 r/min，10 min)去殘渣，收集濾液，3倍無水乙醇沉淀，脫水干燥，得山皂莢粗多糖。

山皂莢粗多糖采用sevag法除蛋白[14-15]，稱取一定量的山皂莢粗多糖，蒸餾水溶解后加入1/5體積的sevag試劑，分液漏斗中混合均勻，除去蛋白層，取脫蛋白后的多糖溶液進行H2O2脫色，將脫色后的多糖溶液置于透析袋中，3 h換一次水，透析24 h，透析后的多糖溶液加入3倍乙醇，4 ℃沉淀過夜，離心(4 000 r/min，10 min)除清液，沉淀干燥至恒重得山皂莢精多糖。

(1)

式中：

Y——山皂莢多糖的得率，%；

m——提取純化后山皂莢多糖的質量，g；

M——山皂莢干粉質量，g。

1.2.2 單因素試驗 以山皂莢多糖得率為考核指標，選取可能影響多糖得率的液固比、提取時間、提取溫度進行單因素試驗，確定每個因素對山皂莢多糖得率的影響范圍。

(1) 液固比的影響：固定提取溫度60 ℃，回流時間80 min，回流2次，分別設置液固比為25∶1，35∶1，45∶1，55∶1，65∶1，75∶1，85∶1，95∶1(mL/g)，考察液固比對山皂莢多糖得率的影響。

(2) 提取時間的影響：固定提取溫度60 ℃，液固比55∶1(mL/g)，分別回流提取30，50，70，90，110，130，150，170 min，回流2次，考察提取時間對山皂莢多糖得率的影響。

(3) 提取溫度的影響：固定液固比55∶1(mL/g)，回流提取2次，每次80 min，分別設置溫度為20，30，40，50，60，70，80，90 ℃，考察提取溫度對山皂莢多糖得率的影響。

1.2.3 響應曲面法優化提取工藝 綜合單因素試驗中各個單因素的試驗結果，將液固比、提取時間及提取溫度3個因素作為本次響應面法的主要考察因素，以山皂莢多糖得率為考察指標，根據試驗結果進行數據分析，模型確立，從而確定最優提取工藝條件。

1.2.4 抑菌試驗

(1) 供試溶液制備：將1.2.1提取所得的山皂莢精多糖用無菌水分別配置成25，50，75，100 mg/mL的多糖溶液，濾膜過濾，備用。

(2) 菌懸液的的制備：將試驗菌接入斜面培養基中進行活化(置于37 ℃恒溫箱中，培養24 h)，然后制備菌懸液(挑取活化菌種于生理鹽水中)，菌懸液濃度約為106～107CFU/mL。

(3) 抑菌效果測定：采用濾紙片擴散法[16-18]，將細菌培養基倒入培養皿中，待凝固后，吸取0.2 mL菌懸液于培養皿內，涂抹均勻，用鑷子取出經不同濃度皂莢多糖溶液浸泡過的濾紙片(6 mm濾紙圓片，經160 ℃干熱滅菌2 h)，每個平皿放3個濾紙片，用無菌水浸泡的濾紙片做對照，每種菌重復做3次，每個濃度平行做5個。倒置于水循環式恒溫培養箱中37 ℃，培養24 h后，測量抑菌圈的直徑。

1.2.5 數據處理方法 采用Design-Expert 8.0.6對山皂莢多糖提取結果進行處理，對試驗數據進行回歸分析，對模型進行顯著性分析，從而得出最優提取工藝條件。

2 結果與分析

2.1 山皂莢多糖提取單因素試驗

2.1.1 液固比的影響 由圖1可知，山皂莢多糖的得率會隨著液固比的增大而有明顯的升高趨勢，當液固比為55∶1(mL/g)時皂莢多糖得率最大，而當液固比再持續增大后，皂莢多糖得率未見增加，而呈現出下降趨勢。這是由于液固比的大小決定固液兩相的混合情況，從而改變傳質速率。當液固比較小時，固相濃度較低，不利于整體得率的提高，當液固比較高時，會出現攪拌不均勻，固液兩相混合不徹底的現象，且醇沉不徹底，從而使得率降低，因此，適宜固液比為55∶1(mL/g)。

2.1.2 提取時間的影響 由圖2可知，山皂莢多糖得率在提取初始隨著提取時間的增加而明顯提高，提取時間的延長有助于多糖的充分浸提，當提取時間為80～90 min時，多糖得率最大，繼續延長提取時間后，由于多糖結構部分發生了破壞和降解，使山皂莢多糖得率不再增加，并且呈現下降趨勢，綜合考慮山皂莢多糖得率和節能，適宜提取時間為80 min。

Figure 1 Effect of liquid/material rate on yield of polysaccharide inGleditsiajaponic.miq

2.1.3 提取溫度的影響 由圖3可知，在反應初始階段，皂莢多糖得率會隨著提取溫度的升高而有明顯的增大，說明溫度較高有助于破壞細胞結構，使多糖能夠較好地浸出；當溫度為60 ℃時，皂莢多糖得率達到最大，之后開始下降，溫度過高可使皂莢多糖糖鏈發生斷裂，生物活性受損，得率下降，因此，適宜提取溫度為60 ℃。

Figure 2 Effect of extraction time on yield of polysaccharide inGleditsiajaponic.miq

Figure 3 Effect of the extraction temperature on yield of polysaccharide inGleditsiajaponic.miq

2.2 響應曲面法優化皂莢多糖提取工藝試驗結果

在單因素試驗的基礎上，采用Box-Behnken設計法制定試驗方案，對影響多糖得率的液固比、提取時間、提取溫度3個因素進行因素水平設計，得到17個試驗點的設計方案，試驗設計與結果見表1、2。

使用Design-Expert 8.0.6軟件進行試驗結果分析，以山皂莢多糖得率為響應值，得到多元回歸方程為：

Y=31.40+0.76A-0.43B+0.48C-7.85A2-1.23B2-1.81C2+0.06AB+0.17AC+0.42BC(R2=0.999 6)。

(2)

2.3 皂莢多糖提取工藝的響應曲面法分析

由圖4可知，液固比對響應值的影響較提取時間圖形陡，液固比的曲線呈現先升高后降低的趨勢，且變化幅度較

表3 回歸方程方差分析?

Table 3 Result of variance (ANOVA) analysis for the fitted quadratic polynomial model

? **表示極顯著(P<0.01)，*表示顯著(P<0.05)。

大；提取時間的曲線較平緩，表明其對多糖得率的影響較小，且交互作用不顯著。由圖5可知，液固比對響應值的影響較提取溫度圖形陡，曲線先升高后降低，變化幅度較大，提取溫度圖形走向較為平緩，表明其對多糖得率變化的影響不大。由圖6可知，提取溫度和提取時間的曲線均較平緩，表明其對多糖得率的影響較不明顯。

本試驗根據響應曲面設計所得山皂莢多糖的最優提取工藝條件為：液固比51.02∶1(mL/g)，提取溫度64.77 ℃，提取時間82.02 min，在該提取工藝條件下得率最大可達31.502 5%。考慮到在實際操作條件，會有一定的限制，所以將以上結果優化為：液固比50∶1(mL/g)，提取時間80 min，提取溫度65 ℃，在此提取條件下平行實驗3次，測得皂莢多糖得率為(31.52±0.54)%，與預測值基本一致，說明本次響應面法所得到的山皂莢多糖提取工藝參數準確可用。

2.4 山皂莢多糖抑菌活性

由表4可知，當皂莢多糖濃度為100 mg/mL時，對金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌抑制效果最好，抑菌圈分別為14.5，12.0 mm；該濃度下多糖對沙門氏菌、大腸桿菌與蠟樣芽胞桿菌也具有一定的抑制作用，抑菌圈均在7 mm以上。同時可看出，隨著多糖濃度的增加，抑菌圈直徑呈增大趨勢。

當皂莢多糖溶液濃度為100 mg/mL時，多糖溶液對細菌的抑菌效果為：金黃色葡萄球菌>枯草芽孢桿菌>蠟樣芽孢桿菌>大腸桿菌>沙門氏菌。整體而言，山皂莢多糖對革蘭氏陽性菌的抑菌作用較革蘭氏陰性菌強。

由表5可知，山皂莢多糖對供試菌有不同程度的抑制作用，其抑菌活性隨著多糖濃度的降低而逐漸減弱，當多糖濃度在15 mg/mL時，對5種供試菌均無抑菌活性，當多糖濃度在50 mg/mL及以上時，抑菌作用較為顯著。山皂莢多糖的最小抑菌濃度MIC分別為：金黃色葡萄球菌25 mg/mL，大腸桿菌50 mg/mL，沙門氏菌50 mg/mL，枯草芽孢桿菌25 mg/mL，蠟樣芽胞桿菌50 mg/mL。

3 結論

采用應用響應曲面分析法對山皂莢多糖的水提取工藝進行優化，得到較為理想的多糖提取條件：液固比為50∶1(mL/g)，提取時間為80 min，提取溫度為65 ℃，在此提取條件下山皂莢多糖的得率為(31.52±0.54)%，相較于其他提取方法，水提法是一種較為方便經濟的方法；抑菌試驗表明山皂莢多糖具有一定的抑制金黃色葡萄糖菌、大腸桿菌、沙門氏菌、枯草芽孢桿菌、蠟樣芽孢桿菌生長的作用，但影響山皂莢多糖抑菌效果的因素較多，本試驗只選用了一種品系的皂莢多糖和一種提取方法，下一步可對不同品系和不同提取方法的皂莢多糖抑菌效果展開系統全面的研究。

? “+” 表示有抑菌圈，“-”表示無抑菌圈。

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Extraction of polysaccharide fromGleditsiajaponic.miqand its antibacterial activities

GAO Jie1DONGWen-bin2,3WANGYong4WANGYan1

(1.CollegeofMedical,ShaanxiInstituteofInternationalTrade&Commerce,Xianyang,Shaanxi712046,China; 2.ShaanxiUniversityofScience&Technology,Xi‘an,Shaanxi710000,China; 3.ShaanxiResearchInstituteofFoodProcessingTechnology,Xi‘an,Shaanxi710000,China; 4.ShaanxiResearchInstituteofAgriculturalProductsProcessingTechnology,Xi‘an,Shaanxi71000,China)

The polysaccharide inGleditsiajaponic.miqwas researched. Based on the single factor level determination, the major factors including liquid/material ratio, extraction temperature and time were investigated by response surface analysis, and then its antibacterial activity was studied by filter paper diffusion method. The results showed that the optimum technology condition were using liquid/material at 50 mL/g, extracted at 65 ℃ for 80 min. Under these conditions, the yield of polysaccharide was (31.52±0.54) %. Furthermore, when the concentration of polysaccharide was 100 mg/mL, the antibacterial activity was in this order,S.typhimurium

Gleditsiajaponic.miq; polysaccharide; antibacterial activities

陜西省教育廳科研計劃項目(編號：12JK1044)；陜西省咸陽市科技局科學技術研究項目(編號：2015K04-20)

高潔，女，陜西國際商貿學院講師，碩士。

董文賓(1951—)，男，陜西科技大學教授，博士生導師，碩士。E-mail：251536749@qq.com

2016—12—26

10.13652/j.issn.1003-5788.2017.03.030