冷藏期間草魚和鰱魚魚片特征生物胺變化差異

王 秀 李宗權(quán) 劉永樂 王建輝 陳 奇 李向紅 王發(fā)祥 俞 健

(長沙理工大學(xué)湖南省水生食品加工工程技術(shù)研究中心，湖南 長沙 410114)

冷藏期間草魚和鰱魚魚片特征生物胺變化差異

王 秀 李宗權(quán) 劉永樂 王建輝 陳 奇 李向紅 王發(fā)祥 俞 健

(長沙理工大學(xué)湖南省水生食品加工工程技術(shù)研究中心，湖南 長沙 410114)

旨在明確草魚和鰱魚魚片冷藏過程中生物胺的動態(tài)變化規(guī)律以及其特征生物胺變化差異，測定分析了4 ℃貯藏條件下草魚和鰱魚片pH、揮發(fā)性鹽基氮(TVB-N)、菌落總數(shù)(TVC)、感官評價以及生物胺含量的動態(tài)變化。結(jié)果表明，隨著貯藏時間的延長，TVB-N、TVC呈明顯上升趨勢；草魚和鰱魚魚片冷藏過程中苯乙胺、腐胺、酪胺及8種生物胺總量變化明顯，且草魚和鰱魚魚片中各生物胺顯著變化的時間點分別為第10天和第8天。草魚和鰱魚片生物胺含量的差異變化主要發(fā)生在腐敗后期，在貯藏第12天，草魚、鰱魚片間腐胺和酪胺含量差異顯著(P<0.05)，其含量分別為(23.39±0.40)，(44.46±1.88) mg/kg和(25.01±1.85)，(50.84±1.50) mg/kg。經(jīng)相關(guān)性分析顯示，苯乙胺、腐胺、酪胺與草魚片品質(zhì)指標間顯著相關(guān)(P<0.05)，可作為草魚品質(zhì)的監(jiān)測指標；苯乙胺、腐胺、酪胺、尸胺與鰱魚片品質(zhì)指標間顯著相關(guān)(P<0.05)，可作為鰱魚片品質(zhì)的評價指標。且冷藏期間草魚和鰱魚魚片關(guān)鍵腐敗時間點的酪胺和8種總生物胺的含量分別相近，可作為草魚和鰱魚片品質(zhì)評價的共同指標。

草魚；鰱魚；魚片；冷藏；特征生物胺；相關(guān)性分析；變化差異

生物胺(BA s)是一類天然存在、堿性含氮的熱穩(wěn)定有機化合物，其形成主要源于氨基酸的脫羧或醛酮類化合物的氨基化和轉(zhuǎn)氨基作用[1]。在生物體內(nèi)，所有生物胺均具有某些特定的生理功能，但產(chǎn)生或攝入過量會引起不良反應(yīng)，如苯乙胺和酪胺可引起頭痛與偏頭痛，組胺可引發(fā)心血管和神經(jīng)系統(tǒng)毒性，腐胺和尸胺可導(dǎo)致破傷風(fēng)、四肢痙攣等，同時可增加其他生物胺的毒性效應(yīng)[2]。如Taylor S L等[3]研究發(fā)現(xiàn)腐胺可抑制組胺甲基轉(zhuǎn)移酶(HMT)活性，尸胺可抑制二胺氧化酶(DAO)和組胺甲基轉(zhuǎn)移酶(HMT)的作用，從而阻礙組胺在腸道內(nèi)的降解。目前，水產(chǎn)制品中生物胺的產(chǎn)生機理及其防控已成為該領(lǐng)域的研究熱點問題之一，且研究主要集中于海產(chǎn)品，如Chen Hwi-Chang等[4]研究尖吻四鰭旗魚(Rastrelligerkanagurta)中組胺及其它生物胺可能引發(fā)食源性疾病的含量時發(fā)現(xiàn)，當組胺含量>40 mg/100 g可能導(dǎo)致潛在中毒；Zare D等[5]研究表明，不同貯藏溫度下羽鰓鮐(Rastrelligerkanagurta)中組胺、腐胺、尸胺含量隨著貯藏時間延長不斷增加，且溫度越高，生物胺的含量越高，增長速度越快；Rossi S等[6]研究表明，腐胺、尸胺和組胺可以作為監(jiān)測大眼金槍魚(BigeyeTuna)和鰹魚(SkipjackTuna)腐敗的指標。此外，色胺、精胺、亞精胺、酪胺和胍基丁胺在海鮮食品中均有發(fā)現(xiàn)，當生物胺指數(shù)[(腐胺+尸胺+組胺)÷(腐胺+尸胺+組胺+酪胺+色胺+甲胺+精胺+亞精胺)]×100<25時被建議作為質(zhì)量指標參數(shù)，而化學(xué)指數(shù)[(腐胺+尸胺+組胺)÷(1+亞精胺+精胺)]<1時被建議作為罐裝金槍魚的質(zhì)量指標參數(shù)[7]。但淡水魚中生物胺的研究相對甚少。當生物胺指數(shù)(腐胺+尸胺)<20 mg/kg 或腐胺<10 mg/kg 時可作為評價冷藏鯉魚的品質(zhì)指標[8]；4 ℃貯藏下青魚腐胺和尸胺與感官指標顯著相關(guān)(P<0.01)[9]；而冷藏過程中鯽魚色胺和腐胺隨貯藏時間變化明顯，其可作為鯽魚品質(zhì)評價的參考指標[10]。

草魚和鰱魚是中國重要的經(jīng)濟淡水魚類，均屬鯉科，肌肉中粗蛋白、水分含量基本相似，但氨基酸含量和脂肪組成及含量差異較大[11]41。迄今，對草魚和鰱魚貯藏過程中的品質(zhì)變化研究較多，其主要評價指標多集中于菌落總數(shù)(TVC)、揮發(fā)性鹽基氮(TVB-N)、三甲胺、K值、感官評價等[12-13]，但有關(guān)生物胺變化規(guī)律及特征生物胺與品質(zhì)指標間相關(guān)性的研究卻鮮有報道。Wang Hang等[14]研究了冷藏條件下草魚生物胺的變化規(guī)律及微生物對生物胺形成的影響，張月美等[15]研究了草魚冷藏過程魚肉品質(zhì)與生物胺的變化及熱處理對生物胺的影響；Shi C等[16]對鰱魚生物胺與TVB-N、TVC、感官評分間的相關(guān)性進行了研究，且發(fā)現(xiàn)腐胺可作為鰱魚的重要質(zhì)量評價指標，然而迄今尚無對比研究草魚和鰱魚貯藏過程中特征生物胺變化規(guī)律及構(gòu)建以特征生物胺為指標的草魚和鰱魚鮮度評價體系的相關(guān)報道。本研究擬通過探究低溫貯藏過程中草魚和鰱魚生物胺的差異性變化規(guī)律，進而探尋特征生物胺與品質(zhì)間的相關(guān)性，以期為特征生物胺作為草魚和鰱魚品質(zhì)監(jiān)測指標提供理論依據(jù)，最終構(gòu)建以生物胺為指標的草魚和鰱魚鮮度評價體系。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

8種生物胺標準品：色胺(Tryptamine)、苯乙胺(Phenetthylamine)、腐胺(Putrescine)、尸胺(Cadaverine)、組胺(Histamine)、酪胺(Tyramine)、亞精胺(Spermidine)、精胺(Spermine)：純度≥99%，美國Sigma-aldrich公司；

丹磺酰氯：純度≥99%，美國Sigma公司；

氮氣：純度≥99.99%，長沙日臻氣體有限公司；

高效液相色譜-紫外檢測器(HPLC-UV)：2695-2998 PDA型，日本島津公司；

氮吹儀：DCY-24B型，山東安博儀器股份有限公司。

1.2 樣品前處理

鮮活的草魚和鰱魚購自湖南長沙高云小區(qū)新旺佳超市，低溫活體運至實驗室后宰殺，去頭、去鱗、去尾、去內(nèi)臟、去皮，去骨，清洗干凈，切成重約為30 g的魚片(2.0 cm×3.0 cm×2.5 cm)，瀝干后裝入聚乙烯自封袋中，于(4±0.2) ℃下貯藏，并于相應(yīng)時間點(0，2，4，6，8，10，12 d)隨機取樣進行pH、TVB-N、TVC、感官評價以及生物胺含量的測定，每個指標平行3次。

1.3 測定方法

1.3.1 pH測定 參考張欽發(fā)等[17]的方法進行。

1.3.2 TVB-N測定 按GB 5009.228—2016執(zhí)行。

1.3.3 菌落總數(shù)測定 參考Chang Shu-chen等[18]的方法進行。

1.3.4 感官評價 參考侯溫甫等[19]的生魚片感官評定方法，以魚肌肉色澤、氣味、組織形態(tài)、組織彈性作為評價指標，由10名經(jīng)過專門培訓(xùn)的評定人員逐項打分，各項最高分為5分，最低分為1分，以總得分評價魚體的總體可接受性。18分以上為新鮮，10～18分為次新鮮，低于10分為腐敗階段。具體感官評分標準見表1。

1.3.5 生物胺含量測定

(1) 生物胺標準液的制備：參照胡超等[20]的方法，以0.4 mol/L 的高氯酸為溶劑配制系列濃度(0.5，1.0，2.0，5.0，10.0，20.0 μg/mL)的混合標準液。

(2) 生物胺提?。簠⒖紡堦朳21]的方法，并稍作修改。準確稱取5.00 g絞碎的魚肉樣品于50 mL離心管中共加入0.4 mol/L 的高氯酸10 mL，均質(zhì)1 min，8 000 r/min離心15 min，收集上清液于25 mL棕色瓶中，沉淀按同樣的方式重復(fù)提取一次，合并上清液，并用0.4 mol/L的高氯酸定容至25 mL。移取上述提取液5.00 mL于25 mL的具塞試管中，加入等體積的正己烷，漩渦振蕩5 min，棄去上層有機相，重復(fù)進行兩次以除去脂肪。將脫脂后的樣品于-20 ℃保存，待測。

(3) 生物胺衍生化：參考Nie Xiao-hua等[22]的方法，并稍作修改。移取上述提取液和混合標準液各1.0 mL于5 mL 的棕色容量瓶中，依次加入2 mol/L NaOH 溶液100 μL、飽和碳酸氫鈉溶液300 μL和丹磺酰氯(10 mg/mL丙酮)1 mL，蓋塞封口，于50 ℃避光反應(yīng)45 min，期間每隔10 min超聲波振蕩一次，反應(yīng)完畢后加入25%氨水100 μL，終止反應(yīng)，靜置30 min，然后氮吹去除丙酮，并用乙腈定容至5 mL，于4 000 r/min 離心10 min，取適量的上清液過0.22 μm 濾膜于2 mL棕色瓶中，4 ℃避光保存，供液相使用。

(4) 生物胺HPLC分析[23-24]：色譜柱：ODS-SP C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；柱溫：35 ℃；流動相：水+乙腈(A+B)，梯度洗脫：B：40%～80%(0～25 min)，80%～100% (25～30 min)，100%～40%(30～35 min)；流速：1 mL/min，進樣量：10 μL。

1.3.6 數(shù)據(jù)分析 采用Excel 2003繪圖，用SPSS 17.0進行顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 品質(zhì)指標的變化

由圖1(a)可知，草魚和鰱魚肌肉在4 ℃冷藏過程中pH值變化規(guī)律相似，貯藏前期由于魚類宰殺致死后，隨著糖原酵解產(chǎn)生的乳酸及ATP分解產(chǎn)生的焦磷酸含量的增加，肌肉的pH逐漸下降，但隨著貯藏時間的延長，蛋白質(zhì)不斷降解成胺類等堿性含氮物，肌肉pH升高[11]42。由圖1(b)可知，草魚和鰱魚初始菌落數(shù)存在一定差異，但在貯藏2 d內(nèi)菌落總數(shù)均有所下降，分別為3.45，3.74 lg CFU/g，其緣由可能是微生物從常溫進入新的冷藏環(huán)境，處于適應(yīng)及延滯期，甚至部分微生物被凍死，這與齊鳳生等[25]的研究結(jié)果相似。而后，微生物增長較快，究其原因是魚體蛋白質(zhì)不斷分解，為微生物的生長繁殖提供了良好的生長環(huán)境。揮發(fā)性鹽基氮(TVB-N)是肌肉在腐敗過程中酶和微生物的作用，使蛋白質(zhì)分解成鹽基氮類物質(zhì)，如尸胺、腐胺、酪胺、氨等[26]。由圖1(c)可知，TVB-N隨著貯藏時間的延長不斷增加，草魚在貯藏第10天時達24.27 mg/100 g，鰱魚在貯藏第8天時達21.17 mg/100 g，均高于《食品安全國家標準 鮮、凍動物性水產(chǎn)品》(GB 2733—2015)中對淡水魚TVB-N的二級鮮度限20 mg/100 g，魚肉均發(fā)生腐敗且不再可食。在貯藏前期草魚與鰱魚肌肉中TVB-N產(chǎn)生的速度和量存在一定的差異，可能是其肌肉中氨基酸組成和含量差異所致[27]。草魚和鰱魚肌肉冷藏期間感官分值隨著貯藏時間的延長不斷下降，見圖1(d)。在貯藏前4 d，草魚和鰱魚感官分值無明顯差異(P>0.05)，且感官分值均在16分以上。第4天后，感官分值下降迅速，貯藏第10 天時草魚肌肉評分低于10分，由圖2可知，此時草魚肌肉發(fā)黃，肌肉組織局部松散，彈性下降；鰱魚在貯藏第8天時評分低于10分，此時鰱魚肌肉色澤暗淡，肌肉組織不緊密，彈性小。由此可知，草魚、鰱魚分別在第10、8天時肌肉發(fā)生腐敗，食用價值喪失。

2.2 生物胺含量變化

新鮮魚體中生物胺的含量較低，隨著貯藏時間的延長，草魚和鰱魚中苯乙胺、腐胺、酪胺、8種總生物胺均呈上升趨勢，草魚和鰱魚片品質(zhì)變化的關(guān)鍵時間點分別為10，8 d，其生物胺含量差異變化主要發(fā)生在腐敗后期，在貯藏第12天，草魚和鰱魚魚片間腐胺和酪胺含量差異顯著(P<0.05)。由表2可知，在新鮮草魚中，精胺、亞精胺、酪胺的質(zhì)量分數(shù)較高，分別為(4.62±1.02)，(3.21±0.49)，(2.17±0.46) mg/kg，色胺和苯乙胺的質(zhì)量分數(shù)較低，分別為(1.81±1.34)，(0.48±0.56) mg/kg，組胺、腐胺、尸胺未檢出。但隨著貯藏時間的延長，精胺含量相對穩(wěn)定，亞精胺、色胺在貯藏過程中雖有所波動，但變化不明顯，苯乙胺、腐胺、組胺、酪胺及所測生物胺總含量變化極顯著(P<0.05)，均在第10天時發(fā)生顯著變化，含量分別達(7.38±1.04)，(10.15±5.37)，(2.84±1.27)，(9.50±1.96)，(42.43±1.03) mg/kg。新鮮鰱魚中各生物胺含量與草魚基本相似，無顯著差異，隨著貯藏時間的延長，色胺、組胺在貯藏過程中有所波動，但變化不明顯，苯乙胺、腐胺、尸胺、酪胺變化顯著(P<0.05)，腐胺、酪胺均在第8天時發(fā)生顯著變化(P<0.05)，含量分別達(14.07±0.80)，(9.40±0.21) mg/kg，尸胺在貯藏第12天開始產(chǎn)生，含量為(3.12±0.30) mg/kg，8種生物胺總含量在第8天時開始發(fā)生顯著變化(P<0.05)，含量達(42.22±0.98) mg/kg，與草魚貯藏第8天時的生物胺總含量(42.43±1.03) mg/kg相近。由此可推測得知，草魚和鰱魚片發(fā)生腐敗變質(zhì)時8種生物胺總量基本一致。

? G、S分別代表草魚與鰱魚；“-”表示未檢出；同一行中擁有不同小寫字母的表示有顯著性差異；同一列中擁有不同大寫字母“Y”“Z”表示草(鰱)魚片生物胺質(zhì)量具有顯著差異性，P<0.05。

對比發(fā)現(xiàn)，貯藏前期，草魚和鰱魚片中存在差異的生物胺主要是苯乙胺和酪胺，其中苯乙胺在第2天時呈顯著變化(P<0.05)，而酪胺在第2、4天時均呈顯著變化(P<0.05)。貯藏后期，草魚和鰱魚片中8種生物胺總量快速增加，究其原因是微生物大量繁殖，氨基酸脫羧酶生成速度加快，使氨基酸發(fā)生脫羧作用生成生物胺[28]，且腐胺、酪胺為草魚和鰱魚片存在差異的主要生物胺。草魚和鰱魚片分別于第10天和第8天時開始發(fā)生腐敗，此時，腐胺、酪胺含量基本相近，其中腐胺含量分別達(10.15±5.37)，(14.07±0.80) mg/kg，酪胺含量分別為(9.50±1.96)，(9.40±0.21) mg/kg。而腐敗后期草魚和鰱魚片貯藏第12天時腐胺含量分別達(23.39±0.40)，(44.46±1.88) mg/kg，酪胺含量分別達(25.01±1.85)，(50.84±1.50) mg/kg，不同魚肉間腐胺和酪胺含量差異顯著(P<0.05)。此外，尸胺在草魚片貯藏過程中未有檢出，在鰱魚片貯藏12 d后產(chǎn)生，這與包玉龍等[12]研究冷藏條件下鯽魚尸胺含量變化時僅在個別樣品中被檢出的結(jié)果相似。由此可知，草魚和鰱魚片貯藏過程中苯乙胺、腐胺、酪胺、8種生物胺總含量發(fā)生顯著變化的時間點分別為10，8 d，與TVB-N、感官指標變化時間點一致，由此推斷生物胺與其它品質(zhì)指標間存在一定相關(guān)性。

2.3 生物胺與品質(zhì)指標相關(guān)性分析

由表3可知，草魚和鰱魚中色胺、亞精胺、精胺與其它品質(zhì)指標的相關(guān)性極低(P>0.05)，且貯藏過程中其含量在生物胺總含量中所占的比例相對較低，變化比較平緩，故不宜作為草魚和鰱魚質(zhì)量監(jiān)控指標。草魚和鰱魚中苯乙胺、腐胺、酪胺、8種總生物胺與pH相關(guān)性較差(除草魚中苯乙胺R2=0.558外，R2均小于0.500)，而與TVC、TVB-N、感官評分顯著相關(guān)(P<0.01)(除鰱魚中酪胺R2=0.471外，R2均大于0.500)，且與TVB-N相關(guān)性最強(R2均大于0.700)，相關(guān)性方程分別為Y(苯乙胺)=13.870+1.715X(R2=0.856)[Y(苯乙胺)=11.722+1.619X(R2=0.856)]、Y(腐胺)=16.804+0.592X(R2=0.774)[Y(腐胺)=14.650+0.351X(R2=0.856)]、Y(酪胺)=14.374+0.343X(R2=0.832)[Y(酪胺)=15.320+0.685X(R2=0.839)]、Y(總生物胺)=12.003+0.269X(R2=0.867)[Y(總生物胺)=11.891+0.155X(R2=0.887)]，由此可知，苯乙胺、腐胺、酪胺為草魚和鰱魚片冷藏過程中的主要特征生物胺。此外，鰱魚中尸胺與TVC、TVB-N、感官評分相關(guān)性較好(P<0.05)，線性關(guān)系見表4。因此，苯乙胺、腐胺、酪胺可作為評價草魚冷藏過程中質(zhì)量鮮度評價的指標，苯乙胺、腐胺、尸胺、酪胺可作為鰱魚品質(zhì)評價的指標。

3 結(jié)論

本研究結(jié)果表明，新鮮草魚和鰱魚中生物胺的含量較低，隨著貯藏時間的延長，苯乙胺、腐胺、酪胺、8種總生物胺均呈上升趨勢，草魚和鰱魚片品質(zhì)變化的關(guān)鍵時間點分別為第10，8天，其生物胺含量差異變化主要發(fā)生在腐敗后期，在貯藏第12天，草魚和鰱魚魚片間腐胺和酪胺含量差異顯著(P<0.05)。經(jīng)相關(guān)性分析顯示，苯乙胺、腐胺、酪胺、8種總生物胺均可作為兩種魚魚片品質(zhì)的監(jiān)測指標，酪胺和8種總生物胺的含量可作為兩種魚魚片品質(zhì)評價的共同參考指標。此外，鰱魚中尸胺與菌落總數(shù)、TVB-N、感官評分相關(guān)性較強，可作為鰱魚片新鮮度評價的參考指標。當前研究，明確了冷藏過程中草魚和鰱魚生物胺含量變化的差異，且分析了特征生物胺作為草魚和鰱魚魚片鮮度評價的可行性。然而，特征生物胺產(chǎn)生的機理尚需進一步深入探討，之后將對草魚和鰱魚魚片特征生物胺產(chǎn)生菌株進行分離與鑒定，并明確特征生物產(chǎn)生菌株的產(chǎn)胺特性，為降低淡水魚及其制品中生物胺的含量,確保其安全提供新的理論依據(jù)。

? G、S分別代表草魚與鰱魚；表中數(shù)據(jù)代表相關(guān)系數(shù)R；“-”表示不具相關(guān)性，*表示在0.05水平上顯著相關(guān)，**在0.01水平上顯著相關(guān)。

?X表示品質(zhì)指標值，Y表示生物胺質(zhì)量分數(shù)；“-”表示不具相關(guān)性。

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Study on the difference of Characteristic Biogenic Amines in Grass and Silver Carp Fillets during cold Storage

WANG XiuLIZong-quanLIUYong-leWANGJian-huiCHENQiLIXiang-hongWANGFa-xiangYUJian

(HunanProvincialEngineeringResearchCenterforFoodProcessingofAquaticBioticResources,ChangshaUniversityofScienceandTechnology,Changsha,Hunan410114,China)

In order to investigate the change of biogenic amines, and the correlation between quality indices and characteristics of biogenic amines, the change of pH, TVB-N, TVC, sensory evaluation and biogenic amines of grass carp and silver carp fillets during cold storage at 4 ℃ were detected. The results showed that TVB-N and TVC increased with the cold storage time; phenethylamine, putrescine, tyramine and the total biogenic amines of grass carp and silver carp fillets changed obviously. All kinds of biogenic amines of grass carp and silver carp fillets significantly changed at the 10thand 8thday. Significant differences (P<0.05) existed in putrescine and tyramine of grass carp and silver carp fillets after corruption. The contents of putrescine and tyramine in grass carp fillets and silver carp fillets respectively were (23.39±0.40) mg/kg and (44.46±1.88) mg/kg, (25.01±1.85) mg/kg and (50.84±1.50) mg/kg at 12thday. Correlation analysis showed that there was significant correlation(P<0.05)between phenylethylamine, putrescine, tyramine and quality indices in grass crap fillets. Quality indices were significantly correlated(P<0.05)with phenylethylamine, putrescine, cadaverine, tyramine in silver crap fillets. Therefore, phenylethyla-mine, putrescine, and tyramine could be used as the quality evaluation indices of grass carp fillets. Moreover, the quality of sliver carp fillets could be evaluated by phenylethylamine, putrescine, cadaverine, tyramine. In addition, the critical value of tyramine and total biogenic amines in grass carp fillets and silver carp fillets during the chilled storage respectively were similar, which could also be used as the quality evaluation indicators of grass carp and silver carp fillets.

Grass and Silver carp fillets; Cold storage; Characteristics of biogenic amines; Correlation analysis; Difference

國家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金項目(編號：31301564)；湖南省自然科學(xué)基金項目(編號：2015JJ2011)；湖湘青年英才支持計劃項目(編號：2015RS4051)

王秀，女，長沙理工大學(xué)在讀碩士研究生。

王建輝(1980—)，男，長沙理工大學(xué)教授，博士。 E-mail：wangjh0909@163.com

2017-01-15

10.13652/j.issn.1003-5788.2017.03.023