牛類芽孢桿菌BD3526產抗菌物質培養條件的優化

花榜清張秋香 劉振民 吳正鈞

(1. 江南大學食品學院，江蘇 無錫 214122；2. 光明乳業股份有限公司乳業生物技術國家重點實驗室，上海 200436)

牛類芽孢桿菌BD3526產抗菌物質培養條件的優化

花榜清1,2張秋香1劉振民2吳正鈞2

(1. 江南大學食品學院，江蘇 無錫 214122；2. 光明乳業股份有限公司乳業生物技術國家重點實驗室，上海 200436)

為提高牛類芽孢桿菌BD3526在麩皮培養基中抗菌物質的產量，以藤黃微球菌為指示菌，抑菌圈直徑為指標，分別考察了培養溫度、培養時間、種齡、接種量以及麩皮濃度5個單因素對抗菌物質產量的影響。其中，培養溫度、培養時間、接種量以及麩皮濃度4個因素對抗菌物質產量影響顯著，故選取該4個因素進行響應面法優化。優化后的培養條件為：培養溫度29 ℃、培養時間73 h、接種量3.2%、麩皮濃度4.2%，在該條件下，BD3526抑菌圈直徑為19.88 mm，抑菌效價相對于優化前提高了100%。

牛類芽孢桿菌 BD3526；抗菌物質；培養條件

細菌素是指微生物在代謝過程中通過核糖體合成機制產生的一類具有生物活性的蛋白質或肽類物質，可以殺滅親緣相近的菌株或抑制其生長[1]。近年來，細菌素作為有潛力的天然食品防腐劑得到了廣泛的研究，乳酸鏈球菌素(Nisin)是目前唯一應用于食品中的細菌素，其在食品中的應用有助于減少化學防腐劑的使用，降低食品的滅菌強度，有利于產品營養物質的保留，延長食品貨架期，使產品具有高品質[2-3]。乳酸鏈球菌素在堿性條件下不穩定且難以溶解，從而限制了其應用范圍[4]。本試驗所用供試菌株是從西藏地區牦牛奶中分離得到的，命名為P.bovisBD3526(CGMCC 8333 = DSM 28815)[5]，前期研究[6]表明其產生的抗菌物質對藤黃微球菌、金黃色葡萄球菌、單增李斯特桿菌和枯草芽孢桿菌均有抑制作用，且耐酸堿，具有極強的熱穩定性，并初步判定其為多肽類抗菌物質，在食品方面有著較大的應用前景。菌株的自身特性是影響其產抗菌物質能力大小的唯一內在因素，此外，發酵條件如培養基中的營養成分[7-8]、培養溫度[9-10]和培養時間[11-12]等外在因素對其產抑菌物質的能力大小也具有很大的影響，因此優化發酵條件，是一種有效提高抗菌物質產量的辦法[13-14]。目前還未有關于牛類芽孢桿菌這種新的菌種產抗菌物質能力大小的研究。本試驗擬以牛類芽孢桿菌BD3526為研究對象，以經濟實惠的麩皮為發酵培養基，通過單因素試驗得到顯著性影響因素，進而通過響應面法優化培養條件，從而獲得其產抗菌物質的最佳培養條件，為后期分離純化以及結構鑒定的研究提供依據。

1 材料與方法

1.1 菌種

供試菌株P.bovisBD3526(CGMCC 8333= DSM 28815)、指示菌藤黃微球菌(Micrococcusluteus)CGMCC1.1848：乳業生物技術國家重點實驗室；

P.bovisBD3526生長培養基(TYC固體培養基)：胰酪蛋白胨15 g/L，酵母提取物5 g/L，蔗糖50 g/L，無水乙酸鈉20 g/L，氯化鈉1 g/L，碳酸氫鈉2 g/L，硫酸鈉 0.1 g/L，L-胱氨酸0.2 g/L，十二水合磷酸氫鈉2 g/L，瓊脂12 g/L；

P.bovisBD3526種子液培養基(TYC液體培養基)：胰酪蛋白胨15 g/L，酵母提取物5 g/L，蔗糖50 g/L，無水乙酸鈉20 g/L，氯化鈉1 g/L，碳酸氫鈉2 g/L，硫酸鈉 0.1 g/L，L-胱氨酸0.2 g/L，十二水合磷酸氫鈉2 g/L；

發酵培養基(麩皮溶液培養基)：小麥麩皮40 g/L；

指示菌培養基(營養瓊脂)：牛肉膏1 g/L，酵母膏2 g/L，蛋白胨5 g/L，氯化鈉5 g/L，瓊脂15g/L。

1.2 試劑

營養瓊脂：上海盛思生化科技有限公司；

胰酪蛋白胨、酵母抽提物：上海拜力生物科技有限公司；

無水乙酸鈉、蔗糖、氯化鈉、碳酸氫鈉、硫酸鈉、十二水合磷酸氫鈉：分析純，國藥集團化學試劑有限公司；

L-胱氨酸：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；

小麥麩皮：蛋白質18.6%，脂肪6.2%，總碳水化合物63.9%，水分7.89%，灰分3.38%，市售。

1.3 儀器與設備

隔水式恒溫培養箱：GNP-9270型，上海精宏實驗設備有限公司；

超凈工作臺：TH-CB-402型，美國Labconco公司；

高壓蒸汽殺菌鍋：HVE-50型，日本Hirayama公司；

電子天平：TE612-L型，美國Sartorius公司。

1.4 方法

1.4.1 菌株的培養

(1) 供試菌株的培養：將菌株劃線接種于TYC瓊脂平板，30 ℃好氧培養48 h，備用。

(2) 指示菌的培養：指示菌劃線接種于營養瓊脂固體平板上，30 ℃好氧培養48 h，挑取單菌落于15 mL營養肉湯中，于30 ℃、180 r/min搖床中培養20 h，菌液稀釋備用。

1.4.2 發酵種子液的制備 挑牛類芽孢桿菌BD3526在TYC瓊脂平板上的單菌落，接種到20 mL TYC液體培養基中，于30 ℃、180 r/min搖床中培養16 h，即得種子液。

1.4.3 發酵液的制備 將P.bovisBD3526 TYC種子液按3.0 mL/100 mL接入40 g/L麩皮培養基中，裝量為50 mL/250 mL 錐形瓶，于30 ℃，180 r/min搖床培養72 h，即得發酵液。

1.4.4 牛類芽孢桿菌BD3526計數方法 取1 mL 培養后的BD3526樣品用無菌生理鹽水進行10倍系列稀釋，取0.1 mL經過稀釋后的菌懸液，采用傾注倒平板的方法、以營養瓊脂為培養介質進行計數。待營養瓊脂平板凝固后，于30 ℃好氧培養24 h取出，進行計數。

1.4.5 抑菌活性的測定 將發酵液在6 000 g下離心10 min，將菌體和麩皮去除，發酵液上清60 ℃水浴30 min，將部分菌體滅活，測定發酵上清液的抑菌活性。抑菌活性的測定采用牛津杯法[15]。將培養好的指示菌菌液與融化后、冷卻至45 ℃的營養瓊脂混合，使指示菌終濃度為106CFU/mL，將培養基倒入平板。待瓊脂完全凝固后，在培養基表面放置牛津杯(內徑6 mm、外徑8 mm、高10 mm的圓形光滑小管)，在杯中加入100 μL待檢樣品，置30 ℃培養48 h，觀察結果。

1.4.6 抗菌物質的效價測定 采用二倍稀釋法測定抗菌物質的效價。取牛類芽孢桿菌BD3526發酵上清液，用滅菌的生理鹽水進行2 倍梯度稀釋，以能夠出現抑菌圈的最高稀釋度為一個活力單位(1 AU)，其倒數即為原發酵液的效價值(AU/mL)。

1.4.7 培養溫度和時間對抗菌物質產量的影響 在40 g/L麩皮發酵培養基(50 mL/250 mL三角瓶)中，以3.0 mL/100 mL接種量接入活化的牛類芽孢桿菌BD3526，分別置于20，25，30，35 ℃搖床中進行培養，搖床轉速為180 r/min，分別取不同培養時間點的發酵液進行抗菌物質活性和活菌數量的測定。

1.4.8 種齡對抗菌物質產量的影響 將培養9，12，15，18，21，24，27 h的種子液以3.0 mL/100 mL的接種量接種到40 g/L 麩皮培養基中(50 mL/250 mL三角瓶)，于30 ℃、180 r/min培養72 h，發酵結束后，測定活菌數和抗菌活性。

1.4.9 接種量對抗菌物質產量的影響 在40 g/L 麩皮發酵培養基(50 mL/250 mL三角瓶)中，分別接入1.0，2.0，3.0，4.0，5.0 mL/100 mL活化的牛類芽孢桿菌BD3526，在30 ℃、180 r/min條件下搖床培養72 h后，取發酵液進行抗菌活性和活菌數量測定。

1.4.10 麩皮濃度對抗菌物質產量的影響 將BD3526 種子液按3.0 mL/100 mL 的接種量分別接入麩皮濃度為10，20，30，40，50 g/L的麩皮培養基中(50 mL/250 mL)，于30 ℃、180 r/min搖床培養72 h后，取樣測定抗菌物質活性和活菌數。

1.4.11 抗菌物質產量影響因素的響應面優化 在單因素試驗結果的基礎上，選取顯著影響因素，以抗菌物質的抑菌圈直徑為響應值，設計響應面試驗。每組試驗重復3次。

1.5 數據處理和分析方法

采用Design Expert 8. 0 與SPSS 17.0 軟件進行數據處理，并進行顯著性分析，其中P<0.05表示差異顯著，P>0.05表示差異不顯著；運用Excel對試驗數據繪制表格；運用Origin 8.0對試驗數據進行繪圖。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 培養溫度和時間對抗菌物質產量的影響 由圖1可知，在不同的培養溫度和時間下，BD3526抗菌物質的產量差異顯著。當菌株BD3526的培養溫度為20 ℃時，發酵液活性極低，直到60 h才檢測出活性，圖2中此溫度下BD3526的活菌數明顯較少，菌體處于半休眠狀態。隨著溫度的升高，抗菌物質的抗菌活性增強，當溫度為30 ℃時，菌體進入穩定期最早，抗菌效果最好，然而隨著溫度的繼續升高，抗菌物質的產量明顯下降。當菌株BD3526的培養溫度為25，30，35 ℃時，均在24 h時檢測出活性，隨著培養時間的延長抗菌物質產量持續增加，72 h時產量達到最大值。此后，抗菌物質的抑菌圈直徑明顯下降，可能是菌體自身產的蛋白酶降解了部分抗菌物質[16]。在培養時間為72 h時，不同培養溫度下BD3526抗菌物質產量有明顯的差異，在30 ℃和35 ℃下，BD3526的活菌數差異不大，但抗菌物質產量差異較大，表明菌株在適當的培養溫度下(25～35 ℃)活菌數的多少對抗菌物質產量沒有影響。在本試驗中不同培養溫度和時間下，菌株BD3526所產抗菌物質的生物活性均存在顯著差異(P<0.05)，且在30 ℃，72 h的培養條件下抗菌活性最大，因此選取培養溫度30 ℃，培養時間72 h作為下一步響應面試驗的中心試驗點。

Figure 1 Diameter of inhibition zone of fermented wheat bran broth with obtained under different cultivation temperature and period

Figure 2 Viable account of fermented wheat bran broth with obtained under different cultivation temperature and period

2.1.2 種齡對抗菌物質產量的影響 由圖3可知，在18 h內隨著接種菌齡的增大，抗菌物質的產量逐漸變大。之后，抗菌物質的產量有所降低，方差分析結果顯示種齡在12～27 h對該抗菌物質的產量影響并不顯著(P>0.05)。因此，在后期的響應面優化試驗中未選擇種齡作為考察因素。

2.1.3 接種量對抗菌物質產量的影響 由圖4可知，隨著接種量的增加，抗菌物質的產量也逐漸增大，當接種量為3%時該抗菌物質的抑菌活性最高，隨后抗菌活性隨接種量增加而下降，接種量對BD3526產抗菌物質的影響顯著(P<0.05)。因此選擇接種量為3%進行下一步的響應面試驗。

Figure 3 Diameter of inhibition zone of fermented wheat bran broth with different inoculum age

Figure 4 Diameter of inhibition zone of fermented wheat bran broth with different inoculum amount

2.1.4 麩皮濃度對抗菌物質產量的影響 由圖5可知，隨著麩皮濃度的增加，抑菌圈的直徑逐漸變大，抗菌物質的產量逐漸增加，當麩皮的濃度達到4%時產量最大，繼續增加麩皮濃度，抑菌圈直徑明顯變小，在前期的研究[17]中發現麩皮濃度的增加有利于BD3526 產胞外多糖，導致發酵液黏度增加，從而影響溶氧，可能菌體發酵產抗菌物質的能力大小與通氧量有關。因此選擇麩皮濃度為4% 進行下一步的響應面試驗。

Figure 5 Diameter of inhibition zone of fermented wheat bran broth with different concentration of bran

2.2 抑菌物質產量影響因素的響應面優化

2.2.1 試驗結果 在單因素試驗結果的基礎上，選取培養溫度、培養時間、接種量和麩皮濃度4個顯著影響因素，以抗菌物質的抑菌圈直徑為響應值，設計4因素3水平響的應面試驗，見表1，試驗結果見表2。

2.2.2 影響抗菌物質產量因素的回歸模型建立與顯著性分析 利用Design Expert 8.0軟件對表2 中的數據進行多元回歸擬合，獲得的抑菌圈直徑(Y)對培養溫度、培養時間、接種量和麩皮濃度二次多項式回歸模型方程為

Y=19.8+0.56A+0.16B+0.69C-0.53D+0.46AB-0.82AC-0.14AD-0.04BC-0.19BD+0.57CD-1.48A2-0.6B2-3.03C2-1.33D2。

(1)

回歸模型的決定系數為0.943 2，說明該模型能夠解釋94.32%的變化。失擬項值為0.144 6，沒有達到顯著水平，說明非試驗因素對試驗結果的影響不大，表明該模型能準確模擬各因素對抗菌物質產量的影響。因此，可用此模型對 BD3526代謝產抗菌物質的發酵條件進行分析和預測。由F值(見表3)可以看出，各因素對抗菌物質產量的影響順序為：培養時間>接種量>培養溫度>麩皮濃度。

? P<0.05，差異顯著； P<0.01，差異極顯著。

2.2.3 響應面分析 4個顯著因素(發酵時間、發酵溫度、接種量和麩皮濃度)對抗菌物質產量的交互作用可以由響應面圖和等高線圖直觀地看出(圖6)。其中各圖表示當A、B、C、D中任意兩個變量取零水平時，其余兩個變量對抗菌物質產量的交互影響。

由圖6可知，培養溫度、培養時間、接種量和麩皮濃度兩兩之間均有比較明顯的交互作用，其中培養時間與接種量、培養時間與培養溫度之間的交互作用最明顯。回歸方程存在穩定點，即極大值點。通過軟件分析得出BD3526產抗菌物質的最佳條件為：培養溫度28.91 ℃、培養時間73.44 h、接種量3.22%、麩皮濃度4.25%，在此條件下BD3526抑菌圈直徑為19.967 mm。為了更便于操作，將參數修正為培養溫度29 ℃、培養時間73 h、接種量3.2%、麩皮濃度4.2%，牛類芽孢桿菌BD3526采取上述修正后的條件進行培養，測得其產抗菌物質的平均抑菌圈直徑為19.88 mm，比預測值低1.9%，說明該模型能較好地預測試驗結果。

2.3 抗菌物質效價的測定

由于牛類芽孢桿菌BD3526采取上述修正后的條件進行培養，測得抗菌物質的抑菌圈直徑與優化前相近，故而通過測定培養條件優化前后抗菌物質的效價來比較兩者的差異，將BD3526在優化后的培養條件下，培養后測得其產抗菌物質的效價為200 AU/mL，較優化之前所得抑菌物質效價100 AU/mL 提高了1倍，因此利用響應面法對牛類芽孢桿菌BD3526產抗菌物質條件進行優化具有一定的意義。

3 結論

單因素試驗結果顯示：牛類芽孢桿菌BD3526產有抗菌物質的最佳發酵溫度30 ℃、最佳發酵時間72 h、最佳接種量為3%、最佳麩皮濃度為4%。在此試驗基礎上，利用響應面法對其發酵條件進行進一步優化，經驗證，該模型合理可靠。通過模型分析并將其產抗菌物質的培養條件進行修正后得到的最佳培養條件為：培養溫度29 ℃、培養時間73 h、接種量3.2%、麩皮濃度4.2%，采取上述優化條件進行培養， BD3526抑菌圈直徑為19.88 mm，通過測定效價得出優化培養條件下BD3526產抗菌物質效價為200 AU/mL，較優化之前所得抗菌物質效價(100 AU/mL)提高了1倍。因此，利用響應面法對牛類芽孢桿菌BD3526產抗菌物質條件進行優化對后期進一步的試驗研究具有一定的指導意義。菌體發酵產抗菌物質能力的大小除了與以上研究的發酵條件有關外，培養基的營養成分對其產量也有很大的影響，因此后續試驗可以考慮研究碳源、氮源和無機鹽的種類及其添加量對牛類芽孢桿菌BD3526產抗菌物質能力大小的影響，從而更全面地探討影響牛類芽孢桿菌BD3526產抗菌物質能力的因素。

[1] ANGIOLILLO L, CONTE A, NOBILE M A D. Food Additives: Natural Preservatives [M]// Encyclopedia of Food Safety.[S.l.]: Elsevier, 2014: 474-476.

[2] CLEVELAND J, MONTVILLE T J, NES I F, et al. Bacteriocins: safe, natural antimicrobials for food preservation [J]. International Journal of Food Microbiology, 2001, 71(1): 1-20.

[3] DEEGAN L H, COTTER P D, HILL C, et al. Bacteriocins: Biological tools for bio-preservation and shelf-life extension [J]. International Dairy Journal, 2006, 16(9): 1 058-1 071.

[4] 貢漢生, 孟祥晨. 乳酸菌細菌素分類與作用機制[J]. 食品與發酵工業, 2008, 34(1): 105-109.

[5] GAO C, HAN J, LIU Z, et al.Paenibacillusbovissp.nov., isolated from raw yak (Bos grunniens) milk [J]. International journal of systematic and evolutionary microbiology, 2016, 66(3): 1 413-1 418.

[6] 劉玉娟, 韓瑨, 吳江, 等. 類芽孢桿菌 BD3526 抑菌活性物質的初步分離及性質測定[J]. 天然產物研究與開發, 2015, 27(7): 1 176-1 180.

[7] 蘇芳, 李莉, 羅斌, 等. 戊糖乳桿菌WH12-2-1產細菌素條件的優化[J]. 中國乳品工業, 2010, 38(3): 10-15.

[8] OH S, RHEEM S, SIM J, et al. Optimizing conditions for the growth of Lactobacillus casei YIT 9018 in tryptone-yeast extract-glucose medium by using response surface methodology [J]. Applied & Environmental Microbiology, 1995, 61(11): 3 809-3 814.

[9] 胡敏, 郝林, 賈麗艷. 枯草芽孢桿菌產細菌素發酵條件的優化[J]. 食品科學, 2014, 35(9): 198-202.

[10] 劉國榮, 張郡瑩, 王成濤, 等. 響應面法優化雙歧桿菌B04代謝產細菌素的發酵條件[J]. 食品科學, 2013, 34(3): 147-152.

[11] 陳琳, 孟祥晨. 響應面法優化植物乳桿菌代謝產細菌素的發酵條件[J]. 食品科學, 2011, 32(3): 176-180.

[12] 佟世生, 解洛香, 徐樂, 等. 植物乳桿菌代謝產細菌素的培養基優化[J]. 現代食品科技, 2012, 28(2): 152-155.

[13] 魯晶晶, 王遠亮, 謝夢琴. 植物乳桿菌LJ-3產細菌素的響應面優化[J]. 食品與機械, 2014, 30(5): 242-246.

[14] GRATTEPANCHE F, AUDET P, LACROIX C. Milk fermentation by functional mixed culture producing nisin Z and exopolysaccharides in a fresh cheese model [J]. International Dairy Journal, 2007, 17(2): 123-132.

[15] 劉冬梅, 李理, 楊曉泉, 等. 用牛津杯法測定益生菌的抑菌活力[J]. 食品研究與開發, 2006, 27(3): 110-111.

[16] PALACIOS J, VIGNOLO G, FAR AS M E, et al. Purification and amino acid sequence of lactocin 705, a bacteriocin produced by Lactobacillus casei CRL 705 [J]. Microbiological Research, 1999, 154(2): 199-204.

[17] 崔燕麗, 韓瑨, 吳正鈞. Paenibacillus bovis BD3526產胞外多糖的培養條件優化[J]. 食品與發酵工業, 2016, 42(5): 108-13.

Optimization on cultivation conditions for antimicrobial substance production byPaenibacillusbovissp.nov. BD3526

HUA Bang-qing1,2ZHANGQiu-xiang1LIUZhen-min2WUZheng-jun2

(1.SchoolofFoodScienceandTechnology,JiangnanUniversity,Wuxi,Jiangsu214122,China; 2.StateKeyLaboratoryofDairyBiotechnology,BrightDairyandFoodCo.,Ltd.,Shanghai200436,China)

In order to increase the production of the antimicrobial substances byP.bovisBD3526 in wheat bran broth，the effect of individual fermentation parameter including cultivation temperature, period, inoculum ratio, age of the inoculum and concentration of wheat bran on the inhibitory intensity of the fermented wheat bran broth was determined, employingMicrococcusluteusas the indicator. Based on the results of single factor tests, four variables i.e. cultivation temperature, cultivation period, inoculum ratio and concentration of wheat bran were employed to further optimize the fermentation conditions for antimicrobial components production by the strain BD3526 by response surface methodology. The optimal cultivation conditions for BD3526 to produce antimicrobial substance were composed of a cultivation temperature of 29 ℃, a cultivation period of 73 h, an inoculum ratio of 3.2% and a wheat bran concentration of 4.2%. The inhibitory zone of the cultivated wheat bran broth under the optimal condition onM.luteusreached 19.88 mm in diameter, and the potency of bacteriocin produced under the optimal conditions was raised by 100% and 300% as compared to that produced under the original fermentation conditions.

P.bovisBD3526; antimicrobial substance; cultivation conditions

國家“十二五”科技支撐計劃 (編號：2013BAD18B01)；上海市科委項目(編號：16DZ2280600)

花榜清，女，江南大學在讀碩士研究生。

張秋香(1979—)，女，江南大學副教授，博士。 E-mail: zhangqx@jiangnan.edu.cn

2017-01-05

10.13652/j.issn.1003-5788.2017.03.007