濃香型白酒糟醅中農(nóng)藥降解菌的篩選及多樣性分析

馮瑞章周萬海 游 玲 魏 琴 舒 媛

(1. 宜賓學(xué)院生命科學(xué)與食品工程學(xué)院學(xué)院，四川 宜賓 644000；2. 固態(tài)發(fā)酵資源利用四川省重點實驗，四川 宜賓 644000)

濃香型白酒糟醅中農(nóng)藥降解菌的篩選及多樣性分析

馮瑞章1,2周萬海 游 玲 魏 琴 舒 媛

(1. 宜賓學(xué)院生命科學(xué)與食品工程學(xué)院學(xué)院，四川 宜賓 644000；2. 固態(tài)發(fā)酵資源利用四川省重點實驗，四川 宜賓 644000)

通過富集培養(yǎng)和平板初篩，從濃香型白酒糟醅中分離篩選可降解農(nóng)藥的微生物菌株，并進行16S rRNA 基因序列系統(tǒng)發(fā)育分析。結(jié)果顯示：52株分離菌株中，可降解丙環(huán)唑、莠去津和2,4D丁酯的菌株分別為25，10，17株，其中51株菌分屬于Bacillus、Lysinibacillus、Pseudomonas、Acinetobacter、Brevibacillus和Stenotrophomonas6個屬的22個模式菌株，1株菌與B.thuringiensis的序列相似度為97.3%，可能是該菌株的變種；Bacillus是可以降解3種農(nóng)藥的共有屬和優(yōu)勢屬(37株，占總菌數(shù)的71.2%)，Stenotrophomonas和Brevibacillus分別為降解莠去津和2,4D丁酯的特有屬。

白酒糟醅；農(nóng)藥降解菌；篩選；多樣性

農(nóng)藥殘留是農(nóng)藥吸附、降解、遷移等多種因素綜合作用的結(jié)果，其中降解是制約殘留量的關(guān)鍵因子[1]。為了降低農(nóng)藥對食品和環(huán)境的影響，科學(xué)家們早就開始了農(nóng)藥降解行為的研究，張寧[2]2006年報道臭氧可降解蔬菜中多種農(nóng)藥的殘留。研究[3]表明，因微生物對農(nóng)藥的降解具有反應(yīng)條件溫和、反應(yīng)速度快和反應(yīng)專一性強等特點，對環(huán)境中的農(nóng)藥降解起著關(guān)鍵作用。近年來，研究人員[4]已從自然界的土壤或污水中篩選出包括細(xì)菌、真菌、放線菌、藻類等可降解各類農(nóng)藥的菌群；亦有研究[5]表明，農(nóng)產(chǎn)品的發(fā)酵可有效降低或消除農(nóng)藥殘留，表現(xiàn)出潛在降解農(nóng)藥的作用。以固態(tài)發(fā)酵為典型特征的濃香型白酒，其釀造過程中復(fù)雜的微生物群落對產(chǎn)品的質(zhì)量和酒體風(fēng)格有至關(guān)重要的作用，目前關(guān)于濃香型白酒微生物的研究主要涉及微生物群落組成及變化、功能微生物在提高產(chǎn)量方面的應(yīng)用，但對于農(nóng)藥降解微生物的研究未見報到。

本研究擬選用小麥、玉米、高粱等濃香型白酒生產(chǎn)原料種植中廣泛使用的莠去津、丙環(huán)唑和2,4D丁酯農(nóng)藥，通過糟醅噴藥、誘發(fā)降解菌、采集糟醅進行農(nóng)藥降解菌的分離和篩選，并對其發(fā)育多樣性和農(nóng)藥降解能力進行研究，旨在為中國白酒生產(chǎn)過程的安全監(jiān)控和風(fēng)險預(yù)測提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 糟醅和藥劑

糟醅：采自宜賓規(guī)模以上濃香型白酒生產(chǎn)企業(yè)；

莠去津(99%)、丙環(huán)唑(98%)、2,4D丁酯(95%)：國藥集團化學(xué)試劑有限公司。

1.1.2 培養(yǎng)基

基礎(chǔ)培養(yǎng)基：K2HPO42.4 g/L，KH2PO41.2 g/L，NH4NO31 g/L，MgSO4·7H2O 0.2 g/L，CaCl2·2H2O 0.025 g/L, Fe2(SO4)30.008 g/L，蒸餾水1 000 mL，pH 值7.0～7.2；

富集培養(yǎng)基：基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加一定濃度的農(nóng)藥；

純化培養(yǎng)基：蛋白胨5 g/L，胰蛋白胨5 g/L，酵母膏5 g/L，葡萄糖10 g/L，MgSO4·7H2O 0.03 g/L，CaCl2·2H2O 0.003 g/L；蒸餾水1 000 mL，pH值7.0～7.2。

1.2 試驗方法

1.2.1 富集培養(yǎng) 將50 mL富集培養(yǎng)基裝入250 mL的三角瓶中，滅菌后加入丙環(huán)唑原藥，使丙環(huán)唑含量為100 mg/L，加入糟醅樣品10 g搖床培養(yǎng)7 d(30 ℃，160 r/min)，按體積比1∶10的接種量轉(zhuǎn)接到含丙環(huán)唑濃度為200 mg/L的富集培養(yǎng)基，相同條件培養(yǎng) 7 d。連續(xù)轉(zhuǎn)接5次，直至培養(yǎng)基中莠去津濃度為500 mg/L。相同的方法富集培養(yǎng)莠去津和2,4D丁酯降解菌株。

1.2.2 菌種分離純化 取富集培養(yǎng)5次后的菌懸液0.2 mL，稀釋至10-5，10-6，10-7，涂布于含有100 mg/L丙環(huán)唑的基礎(chǔ)培養(yǎng)基平板上，28 ℃培養(yǎng)3～4 d。根據(jù)形態(tài)、色澤、大小特點挑取單個菌落接種至純化培養(yǎng)基上28 ℃培養(yǎng)24 h，再將菌落劃線培養(yǎng)，至單菌落生成。同法分離純化莠去津和2,4D丁酯菌株，不同農(nóng)藥菌株分別編號。

1.2.3 農(nóng)藥降解菌的篩選 將純化、編號后的菌株接種于含有100 mg/L丙環(huán)唑的固體基礎(chǔ)培養(yǎng)基上，28 ℃培養(yǎng)2～3 d，轉(zhuǎn)代培養(yǎng)于丙環(huán)唑含量為200 mg/L的培養(yǎng)基，繼續(xù)轉(zhuǎn)代3次，培養(yǎng)基中丙環(huán)唑濃度增至500 mg/L時還能生長良好的菌株，即為具有丙環(huán)唑降解潛能的菌株。同法篩選具有莠去津和2,4D丁酯降解潛能的菌株。

1.2.4 DNA提取與PCR擴增 參照文獻[6]的方法提取各菌株的總DNA、擴增16S rRNA基因片段。引物27f：5-AGAGTTTGATCTGGCTCAG-3和 1541r：5-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3。擴增產(chǎn)物由上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司(Sangon)純化測序(長度700～900 bp)，所有序列在GenBank注冊。

1.2.5 系統(tǒng)發(fā)育分析 所得序列用EzTaxon Server 2.0[7]在線進行相似性分析。用ClustalX程序按照最大同源性的原則進行比對，采用 Kimura-2[8]計算序列相似值，并用BioEdit 5.0.9 進行檢驗；Mega 4.0軟件進行系統(tǒng)進化樹的構(gòu)建、編輯與保存。

2 結(jié)果分析

2.1 農(nóng)藥降解菌的分離篩選

通過富集馴化，在3種含有供試農(nóng)藥的基礎(chǔ)培養(yǎng)基上，共分離純化得到132株細(xì)菌的純培養(yǎng)物，其中可利用丙環(huán)唑、莠去津、2,4D丁酯的菌株分別為37，53，43株(表1)。 將上述菌株轉(zhuǎn)代培養(yǎng)于農(nóng)藥濃度逐漸增加的固體平板培養(yǎng)基上，當(dāng)莠去津、丙環(huán)唑和2,4D丁酯的濃度達到500 mg/L時，長勢良好的菌株共52 株，其中，在丙環(huán)唑培養(yǎng)基上25 株、在莠去津培養(yǎng)基上有10株、2,4D丁酯培養(yǎng)基上17株，分別占初分離菌株數(shù)的18.9%，67.6%，39.5%。

2.2 系統(tǒng)發(fā)育分析

由圖1可知，52 株供試細(xì)菌中，1株菌(菌株代號：XQB-33)的對應(yīng)序列與Bacillusthuringiensis的相似性為97.3%，根據(jù)微生物16S rRNA 基因序列時相似度大于98%可認(rèn)定為同一個種，相似度大于97%可認(rèn)定為同一個屬的理論[9-10]，可認(rèn)定該菌株為B.thuringiensis菌株的變種或與其親緣關(guān)系較近的其它種。除XQB-33菌株外，其余51 株菌與6個屬的22個種的模式菌株對應(yīng)序列相似度大于98%，其中37株菌屬于Bacillus，占總供試菌株總數(shù)的71.2%，7株屬于Lysinibacillus，3株屬于Acinetobacter，2株屬于Pseudomonas，2株分別屬于Stenotrophomonas和Brevibacillus。以上結(jié)果表明濃香型白酒糟醅中可降解農(nóng)藥的微生物菌株表現(xiàn)一定的系統(tǒng)發(fā)育多樣性，其中Bacillus是降解農(nóng)藥的主要和優(yōu)勢微生物。

2.3 降解不同農(nóng)藥菌株的種屬分布

分析降解不同農(nóng)藥菌株的種屬分布特征(表2)發(fā)現(xiàn)，能夠降解丙環(huán)唑的25株細(xì)菌中，有22株分屬于Bacillus的10個種，其中與模式種BacillusanthracisATCC 14578(T)的序列相似度大于98%的有12株，與B.oceanisediminisH2(T) 的序列相似度大于98%的有2株，與其它8個種相似度大于98%的菌株各有1株； 剩余2株與LysinibacillusmacroidesLMG 18474(T)屬于同一微生物種群，1株與PseudomonasazotoformansIAM1603(T)的相似度大于98%。

能夠降解莠去津的10菌株中，5株屬于Bacillus的3個模式菌株，其中與B.anthracisATCC 14578(T)序列相似度大于98%有3株，1株與B.mycoidesATCC 6462(T) 序列相似度大于98%，1株與B.thuringiensisATCC 10792(T)的序列相似度為97.3%，可能是該模式種的一個變種或與其親緣性很近的其它種；3株與Acinetobacter屬的2個模式種的同源性大于98%，另外2株分別與Pseudomonas和Stenotrophomonas屬的菌株同源性大于98%。

17株可降解2,4D丁酯的菌株中11株與Bacillus的6個模式菌株同源性超過98%，占到降解該農(nóng)藥總菌株數(shù)的64.7%，4株與LysinibacillusmacroidesLMG 18474(T)為同一菌株，另外2株分別與AcinetobacternosocomialisLMG 10619(T)和BrevibacillusparabrevisIFO 12334(T)為同一菌株。

以上結(jié)果表明，在宜賓白酒糟醅中，能夠降解丙環(huán)唑的細(xì)菌有Bacillus、Lysinibacillus和Pseudomonas3個屬，能夠降解莠去津的細(xì)菌有Bacillus、Acinetobacter、Pseudomonas和Stenotrophomonas4個屬，可以降解2,4D丁酯的菌株有Bacillus、Lysinibacillus、Acinetobacter和Brevibacillus4個屬，其中Bacillus是可以降解3種農(nóng)藥的共有屬，也是降解各種農(nóng)藥的優(yōu)勢屬，Stenotrophomonas和Brevibacillus分別為降解莠去津和2,4D丁酯的特有屬。

3 結(jié)論

微生物降解農(nóng)藥具有投入低、無毒、無殘留、無二次污染的優(yōu)勢，治理效果也相對明顯，是目前公認(rèn)的低成本且環(huán)境友好型去除污染物的方法[11]。目前已經(jīng)分離得到一批能降解或轉(zhuǎn)化某種農(nóng)藥的細(xì)菌、真菌、放線菌等微生物，其中細(xì)菌因生化上的多種適應(yīng)能力及易誘發(fā)突變菌株而占主要地位[12]。本試驗通過富集培養(yǎng)，從宜賓濃香型白酒糟醅中分離篩選得到52株可降解農(nóng)藥的微生物菌株，系統(tǒng)發(fā)育分析發(fā)現(xiàn)，51株供試菌株與6個屬22個種的模式菌株對應(yīng)序列相似度大于98%， 1株菌與Bacillusthuringiensis的相似性為97.3%。Bacillus是可以降解丙環(huán)唑、莠去津和2,4D丁酯農(nóng)藥的共有屬和優(yōu)勢屬，Stenotrophomonas和Brevibacillus分別為降解莠去津和2，4D丁酯的特有屬，優(yōu)勢種屬及特有種屬微生物的開發(fā)利用為中國白酒安全生產(chǎn)提供資源，也為后續(xù)繼續(xù)研究農(nóng)藥降解菌及其酶活性的作用機制、有效應(yīng)用現(xiàn)代生物技術(shù)改造或構(gòu)建新的菌種提供資源。

? “-”代表沒有菌株分配。

[1] LOZOWICKA B, KACZYNSKI P, PARITOVA A E, et a1. Pesticide residues in grain from Kazakhstan and potential health risks associated with exposure to detected pesticides[J]. Food and Chemical Toxicology, 2014, 64: 238-248．

[2] 張寧. 臭氧降解蔬菜中農(nóng)藥殘留機理與效果研究[J]. 食品與機械, 2006, 22(1): 57-60.

[3] 鄭永良, 劉德立, 高強, 等. 甲胺磷農(nóng)藥降解菌HS-A32的分離鑒定及降解特性[J]. 應(yīng)用與環(huán)境生物學(xué)報, 2006, 12(3): 399-403.

[4] 虞云龍, 樊德方, 陳鶴鑫. 農(nóng)藥微生物降解的研究現(xiàn)狀與發(fā)展策略[J]. 環(huán)境科學(xué)進展, 1996, 4 (3): 28-36.

[5] ZHOU Xin-wei, Zhao Xin-huai. Susceptibility of nine organophosphorus pesticides in skimmed milk towards the inoculmed lactic acid bacteria and yogurt starters [J]. Journal of the Science of Food and Agriculture, 2015, 92(230): 260-266.

[6] 東秀珠, 蔡妙英. 常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊[J]. 北京: 科學(xué)出版社, 2001: 353-358.

[7] CHUN J, LEE J H, JUNG Y, et al. EzTaxon: a web-based tool for the identification of prokaryotes based on 16S ribosomal RNA gene sequences [J]. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 2007, 57: 2 259-2 261.

[8] Kimura M. A simple method for estimating evolutionary rates of base substitutions through comparative studies of nucleotide sequences [J]. Journal of Molecular Evolution, 1980, 16: 111-120.

[9] DEVEREUX R, HE S H, DOYLE C L, et al. Diversity and origin of Desulfovibrio species: phylogenetic definition of a family[J]. Journal of Bacteriology, 1990, 172(7): 3 609-3 619.

[10] STACKEBRANDT E, EBERS J. Taxonomic paramenters revisited: tarnished gold standard[J]. Microbiology Today, 2006, 33(4): 152-155.

[11] 王連祥, 閏檠, 袁方曜, 等. 不同微生物菌劑降解土殘農(nóng)藥的研究[J]. 山東農(nóng)業(yè)科學(xué), 2010(4): 75-78.

[12] 盧桂寧, 陶雪琴, 黨志. 農(nóng)藥降解菌及其基因工程研究進展[J]. 礦物巖石地球化學(xué)通報, 2005, 24(3): 258-262.

Selection and diversity of pesticide-degrading bacteria isolated fromZaopeiof Luzhou-flavor Liquor

FENG Rui-zhang1,22ZHOUWan-hai21,2YOULing1,21,2WEIQing1,21SHUYuan1

(1.CollegeofLifeScienceandFoodEngineering,YibinUniversity,Yibin,Sichuan644000,China; 2.Solid-StateFermentationResourceUtilizationKeyLaboratoryofSichuanProvince,Yibin,Sichuan644000,China)

The pesticide-degrading bacteria was isolated and selected fromZaopeiof Luzhou-flavor Liquor by the enrichment culture and plate separation technology, then the phylogenetic analysis of these strains were carried out by 16S rRNA gene sequence. The results showed that 52 strains were isolated fromZaopeiof Luzhou-flavor Liquor, and 25 strains had degradative capability for Propiconazol, and 10, 17 had degradative capability for, Atrazine, 2,4-D butyl ester respectively. 51 strains belonged to 22 species of 6 genera (Bacillus,Lysinibacillus,Pseudomonas,Acinetobacter,Brevibacillus,Stenotrophomonas), and 1 isolatewaspresumed to be variety ofBacillusthuringiensis(with 97.3% sequence similarity).Bacilluswas the shared and dominant genus for, degradation three kinds of pesticides (Propiconazol, Atrazine, 2,4-D butyl ester) with 37 strains (accounting for 71.2% of 52 strains).StenotrophomonasandBrevibacilluswas the specific genera for Atrazine and 2,4-D butyl ester degradation respectively.

Zaopeiof Luzhou-flavor Liquor; pesticide-degrading bacteria; selection; diversity

四川省教育廳項目(編號：13ZA0201)；發(fā)酵資源與應(yīng)用四川省高校重點實驗室項目(編號：2010KFZ004，2011KFJ003)

馮瑞章，女，宜賓學(xué)院副教授，博士。

周萬海(1979—)，男，宜賓學(xué)院副教授，博士。 E-mail:wanhaizhou@126.com。

2016—12—22

10.13652/j.issn.1003-5788.2017.03.004