探究生物種間關系的實驗活動

趙冉冉（上海海事大學附屬北蔡高級中學上海 201204）

探究生物種間關系的實驗活動

趙冉冉（上海海事大學附屬北蔡高級中學上海 201204）

利用釀酒酵母與灰霉菌競爭營養(yǎng)物質(zhì)的機理來防治紅辣椒灰霉病，從而探討三種生物的種間關系，以加深學生對生物種間關系的理解，豐富實驗課的教學。

種間關系 灰霉菌 釀酒酵母 植物真菌病害 生物防治

文件編號：1003－7586（2017）01－0056－02

生物的種間關系是一個非常有趣的知識點，學生大都有一定的感性認識。人教版高中生物《必修3：穩(wěn)態(tài)與環(huán)境》教科書中，給出了生物種間關系的一些基本概念，并列舉了對應的例子，但例子比較簡單，不利于學生積極性的調(diào)動以及手腦結(jié)合的運用。為了加深學生對該知識點的理解，增強動手能力，下面以實驗“釀酒酵母對紅辣椒灰霉病的生物防治作用”為例，探討三種生物（紅辣椒、灰霉菌和釀酒酵母）的種間關系。本探究實驗不僅可以彌補該知識點缺乏相關配套實驗的不足，同時還可以作為學生進行探究性學習的一個載體。

1 實驗原理

灰霉菌是一種廣寄主性的、能夠引起多種蔬菜和水果灰霉病的壞死營養(yǎng)型病原真菌。在日常生活中遇到的果蔬長毛，多數(shù)是受到了灰霉菌的侵染。研究表明，灰霉菌分生孢子萌發(fā)需要適當?shù)臓I養(yǎng)條件，植物表面水分中的營養(yǎng)物質(zhì)可以被灰霉菌和拮抗菌所共用，從而使灰霉菌所能利用的營養(yǎng)物質(zhì)濃度降低，使其芽管生長速度減慢。酵母菌是灰霉菌的主要拮抗菌，如釀酒酵母菌對灰霉菌就有很好的拮抗作用，可用于灰霉病的生物防治。

2 材料用具

灰霉菌、釀酒酵母：實驗前均于4℃下保存于馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）培養(yǎng)基上。

紅辣椒：選用外觀整齊、大小一致、無病蟲害、無機械損傷，未用化學或生物藥劑處理過的果實為實驗材料，實驗前用無菌水洗凈備用。

葡萄糖溶液、質(zhì)量分數(shù)為0.5%的NaCl溶液、體積分數(shù)為70%的乙醇溶液、無菌水、PDA培養(yǎng)基、培養(yǎng)皿、試管、無菌打孔器、接種環(huán)、移液槍、量筒、光學顯微鏡、恒溫培養(yǎng)箱、塑料袋、直尺。

3 方法步驟

3.1 釀酒酵母對灰霉菌拮抗作用的體外生物防治實驗

3.1.1 制備PDA有孔培養(yǎng)基

將紅辣椒汁加入融化狀態(tài)的PDA培養(yǎng)基中（每毫升培養(yǎng)基含0.15 g紅辣椒汁），混勻后倒入無菌培養(yǎng)皿中，冷卻至凝固；然后用無菌打孔器在凝固的平板中央打一個直徑4 mm的孔。

3.1.2 配制菌懸液

將釀酒酵母和灰霉菌于28℃下分別培養(yǎng)于PDA斜面上48 h和72 h。用接種環(huán)挑取釀酒酵母菌種，以無菌水稀釋，分別制成濃度為5×106、5×107、5×108、5× 109細胞/mL的釀酒酵母懸浮液；同樣方法配制灰霉菌孢子懸浮液，濃度為5×104孢子/mL。

3.1.3 接種觀察

將20 μL濃度分別為5×106、5×107、5×108、5×109細胞/mL的釀酒酵母懸浮液依次注入到4個PDA平板的孔中，保持1～2 h，使其充分滲入，之后同樣位置注入20mL濃度為5×104作孢子/mL的灰霉菌懸液為實驗組(b～e)；在另一個平板的孔中只注入20 μL濃度為5×104孢子/mL的灰霉菌孢子懸浮液，并充分滲入，作為對照組(a)。28℃下培養(yǎng)5 d，觀察釀酒酵母和灰霉菌的生長情況，記錄灰霉菌菌落直徑。

3.2 釀酒酵母對灰霉菌拮抗作用的體內(nèi)生物防治實驗

3.2.1 果實處理

將紅辣椒果實于質(zhì)量分數(shù)為0.5%的NaCl溶液中浸泡5 min，以除去表皮污物；然后用無菌水洗凈，空氣干燥后，用體積分數(shù)為70%的乙醇溶液處理；最后用無菌打孔器將果實表皮打上傷口（傷口直徑4 mm，深度1 mm），一個果實一個傷口。

3.2.2 接種觀察

將20 μL濃度分別為5×106、5×107、5×108、5×109細胞/mL的釀酒酵母懸浮液依次注入到果實傷口處，1～2 h之后，同樣位置注入20 μL濃度為5×104孢子/mL的灰霉菌懸浮液，作為實驗組(c～f)。對照組a只注入20 μL濃度為5×109細胞/mL的釀酒酵母懸浮液，對照組b只注入20 μL濃度為5×104孢子/mL的灰霉菌孢子懸浮液。將處理后的果實裝入塑料袋，28℃下密封避光保存，5 d后記錄果實表面病灶直徑（病灶直徑用以衡量紅辣椒果實灰霉病的嚴重程度）。

3.3 營養(yǎng)競爭實驗

取5支試管，各加入2 mL 0.15 g/mL的紅辣椒汁；在其中3支試管中依次加入2mL 0.1、0.5、1.0g/mL的葡萄糖溶液，再將50 μL濃度為5×109細胞/mL的釀酒酵母懸浮液和50 μL濃度為5×104孢子/mL的灰霉菌孢子懸浮液共同接種于以上試管中，記為實驗組（c～e）；余下2支試管，其中1支加入50 μL濃度為5×109細胞/mL的釀酒酵母懸浮液和50 μL濃度為5× 104孢子/mL的灰霉菌孢子懸浮液，記為對照組b；另1支只加入50 μL濃度為5×104孢子/mL的灰霉菌孢子懸浮液，記為對照組a。所有試管均于28℃下培養(yǎng)16 h。顯微觀察，計算孢子萌發(fā)率（灰霉菌每復制1次至少有50個孢子）。

4 實驗結(jié)果

4.1 體外實驗中不同濃度釀酒酵母懸浮液對灰霉菌生長的抑制作用

用體外平板實驗來確定釀酒酵母抑制作用的最適濃度。對照組平板（a）上灰霉菌菌落的直徑為4.6 cm；實驗組平板（b～e）上灰霉菌菌落的直徑隨釀酒酵母懸浮液濃度的升高(5×106、5×107、5×108、5×109細胞/mL)而逐漸減小，從3.7 cm降至2.2 cm。

4.2 體內(nèi)實驗中不同濃度釀酒酵母懸浮液對灰霉菌生長的抑制作用

體內(nèi)實驗的結(jié)果顯示出類似的酵母懸浮液濃度對灰霉菌生長的抑制作用。對照組（b）辣椒果實的病灶直徑為1.3 cm；實驗組（c-f）果實病灶直徑隨釀酒酵母懸浮液濃度的升高(5×106、5×107、5×108、5×109細胞/mL)而逐漸減小，從1.1 cm降到0.6 cm。

圖1所示病變區(qū)域一開始有水樣點，然后水樣點逐漸擴散成灰棕色、質(zhì)地如海綿的區(qū)域，表面覆有灰霉菌菌絲和孢子。釀酒酵母生長速度越快，就越干擾灰霉菌的生長，并競爭營養(yǎng)物質(zhì)。然而，只接種釀酒酵母的紅辣椒果實沒有出現(xiàn)病變（圖1a），這就表明，釀酒酵母不影響紅辣椒活細胞的生長，但是它會在植物受傷部位生長。

4.3 灰霉菌和釀酒酵母之間的營養(yǎng)競爭

圖1 不同濃度釀酒酵母懸浮液對紅辣椒果實病灶直徑的影響

28 ℃條件下，顯微觀察到對照組a灰霉菌分生孢子萌發(fā)率為91.2%，對照組b的萌發(fā)率為24.6%。結(jié)果表明，酵母菌干擾灰霉菌孢子萌發(fā)的過程。然而，孢子萌發(fā)率在葡萄糖質(zhì)量濃度為0.1 g/mL時為35.7%，當濃度上升到0.5 g/mL時，萌發(fā)率為56.2%，上升到1.0 g/mL時，萌發(fā)率為70.5%。這表明，釀酒酵母抑制灰霉菌生長的能力隨葡萄糖濃度升高而降低。

5 結(jié)論與建議

灰霉菌引起紅辣椒果實病變，表明了兩者的寄生關系。釀酒酵母利用紅辣椒果實的營養(yǎng)物質(zhì)，保護其細胞免受病原菌感染，說明了兩者的互利共生關系。釀酒酵母通過爭奪養(yǎng)分而抑制灰霉菌孢子萌發(fā)，可解釋兩者的競爭關系，但二者對養(yǎng)分的爭奪并不是唯一的機制，釀酒酵母也可產(chǎn)生酒精和毒素殺死灰霉菌，灰霉菌也能產(chǎn)生抗真菌劑殺死釀酒酵母。

筆者建議學生在學校實驗室中進行該實驗，實驗過程中所使用到的灰霉菌和釀酒酵母對學生沒有危害。在實驗材料的選取上，學生可以嘗試使用番石榴、番茄或蘋果進行實驗，將會得到和用紅辣椒做實驗相同的結(jié)果。該實驗的進行不僅可以使學生了解到生物的3個主要種間關系（寄生、競爭、互利共生），并且還可以給學生一個批判性思考低等生物（微生物）和高等生物（植物）之間關系的機會。

［1］孟祥東,傅俊范,嚴雪瑞等.灰霉病菌（Botrytis cinerea）生物防治研究進展[J].沈陽農(nóng)業(yè)大學學報,2003,34(6):472-475.

［2］Arun Chanchaichaovivat a,Bhinyo Panijpan a&Pintip Ruenwongsa a.Yeast biocontrol of a fungal plant disease:a model for studying organism interrelationships[J].The Journal of Biological Education.2008,43(1):36-40.

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