蛹蟲(chóng)草無(wú)性單孢菌株的分離及其配對(duì)選育

劉麗+田云

摘要 分別以菌株JW14-1和CW15為材料，分離出只具有交配型Ⅰ基因的無(wú)性單孢子和只具有交配型Ⅱ基因的無(wú)性單孢子，將這2種無(wú)性單胞菌株進(jìn)行配對(duì)，通過(guò)測(cè)定蟲(chóng)草素含量對(duì)配對(duì)后的變異株進(jìn)行選育，獲得2株蟲(chóng)草素含量顯著增加的優(yōu)良變異菌株；進(jìn)一步利用RT-PCR技術(shù)檢測(cè)蟲(chóng)草素合成相關(guān)基因的表達(dá)情況。結(jié)果表明：蟲(chóng)草素含量高的菌株6號(hào)配對(duì)株中腺苷酸琥珀酸合成酶基因的表達(dá)水平最低，而5′-nucleotidase基因和嘌呤核苷磷酸化酶基因的表達(dá)水平則最高。該研究為蛹蟲(chóng)草的定向選育提供了新的思路。

關(guān)鍵詞 蛹蟲(chóng)草；無(wú)性單孢子；蟲(chóng)草素；配對(duì)選育

中圖分類號(hào) S567.3 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 1007-5739（2016）23-0091-02

Abstract Theasexual single spore strains with mating type Ⅰ gene or mating type Ⅱ gene were isolated from strain JW14-1 and CW15，respectively，and the two mutant strains with higher cordycepin content were selected through the matching selection with these two asexual single spore strains.Further researches indicated the No.6 strain with high content of cordycepin showed the low expression level of adenylosuccinate synthetase and high transcriptional level of 5′-nucleotidase and purine nucleoside phosphorylase.This study provided a novel idea for the directional breeding of Cordyceps militaris.

Key words Cordyceps militaris；aesual single spore；cordycepin；matching selection

蛹蟲(chóng)草（Cordyceps militaris），又稱北蟲(chóng)草，屬子囊菌亞門(mén)（Asicomyxotinae）麥角菌科（Clavicipitanceae）蟲(chóng)草屬[1]。它是蛹蟲(chóng)草真菌寄生在鱗翅目、鞘翅目、雙翅目等夜蛾科昆蟲(chóng)蛹體及幼蟲(chóng)上形成的蟲(chóng)菌復(fù)合體[2]。蛹蟲(chóng)草是一種具有滋補(bǔ)作用的中藥和營(yíng)養(yǎng)品，其主要包含蟲(chóng)草素、蟲(chóng)草酸、蟲(chóng)草多糖、氨基酸、麥角甾醇等物質(zhì)，功效與冬蟲(chóng)夏草相似，而且蟲(chóng)草素含量和抗氧化活性高于多重夏草，是冬蟲(chóng)夏草良好的代用品[3-4]。蟲(chóng)草素作為蛹蟲(chóng)草重要的生物活性成分之一，自從20世紀(jì)中期被發(fā)現(xiàn)并分離得到純品開(kāi)始，人們就不斷研究蟲(chóng)草素的生物活性作用，包括抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)、抑制抗炎、與環(huán)磷酰胺有明顯的協(xié)同作用，并有降血糖的作用[5]。

自然界原始分離得到的蛹蟲(chóng)草菌株中蟲(chóng)草素含量一般較低，因此選育蟲(chóng)草素含量高、生長(zhǎng)迅速的蛹蟲(chóng)草新菌種有著十分重要的意義。現(xiàn)階段一般主要采用化學(xué)誘變、輻射誘變、航天誘變、有性單孢雜交等方法選育蛹蟲(chóng)草新菌種，筆者采用無(wú)性單孢子配對(duì)的方法選育蛹蟲(chóng)草新菌種，為蛹蟲(chóng)草的定性選育提供新的思路與技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

本研究所用的菌株JW14-1采購(gòu)于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，菌株CW15采自于長(zhǎng)白山。尖草型菌株JW14-1分離出的單分生孢子挑選出只具有交配型I基因的單孢菌株，野生菌株CW15分離出的單分生孢子挑選出只具有交配型II基因的單孢菌株。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 蛹蟲(chóng)草無(wú)性單孢子分離株的獲得與配對(duì)。將供試菌種接種于PDA平板上，25 ℃避光培養(yǎng)7 d后進(jìn)行轉(zhuǎn)色，在超凈工作臺(tái)中，取1 mL無(wú)菌水洗脫菌絲體，經(jīng)過(guò)4層無(wú)菌紗布后過(guò)濾收集孢子懸液。在顯微鏡下觀察收集的孢子懸液，根據(jù)觀察結(jié)果對(duì)孢子懸液進(jìn)行適當(dāng)稀釋。取0.1 mL稀釋后的孢子懸液在含有PDA培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中進(jìn)行均勻涂布，然后將涂布培養(yǎng)的培養(yǎng)皿于20 ℃避光倒置培養(yǎng)7 d待有肉眼可見(jiàn)的菌落出現(xiàn)后，挑取單菌落，將單菌落中的菌絲體接入新的PDA平板上25 ℃避光培養(yǎng)，菌絲體長(zhǎng)滿平板后，刮取菌絲。將經(jīng)過(guò)檢測(cè)的含有不同交配型基因的單孢菌絲放入同一瓶種子培養(yǎng)液中，22 ℃，避光震蕩培養(yǎng)（125 r/min）4 d后開(kāi)始出草試驗(yàn)工作。

1.2.2 基因組DNA的提取。采用改進(jìn)的CTAB法[6]提取所收集的蛹蟲(chóng)草菌絲體樣本基因組DNA。

1.2.3 交配型基因分子鑒定。蛹蟲(chóng)草的交配型位點(diǎn)上存在著2類相互不同源的交配型基因：一類是MAT-alpha（MAT1-1-1和MAT1-1-2），另一類是MAT-HMG（MAT1-2-1）。使用PCR方法對(duì)交配型基因類型進(jìn)行分子鑒定[7]，結(jié)果如表1所示。

1.2.4 蟲(chóng)草素含量測(cè)定。精密稱取蛹蟲(chóng)草粉末0.5 g，置于50 mL量瓶中，加10%甲醇水溶液至刻度線，精密稱量，超聲提取（55 kHz，20 ℃）10 min，冷卻至室溫，用10%甲醇水溶液補(bǔ)足失重，搖勻，離心10 min（4 000 r/min），過(guò)濾，濾液為樣品提取液。蟲(chóng)草素含量的測(cè)定采用高效液相色譜法，檢測(cè)條件為色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流速1.0 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)260 nm，進(jìn)樣體積10 μL，柱溫25 ℃，流動(dòng)相A為甲醇，流動(dòng)相B為水，梯度洗脫程序?yàn)? min（90%B）→5 min （78%B）→12 min（74.5%B）。

1.2.5 RNA提取。采用Trizol法[8]提取蛹蟲(chóng)草子實(shí)體總RNA。

1.2.6 RT-PCR檢測(cè)蟲(chóng)草素相關(guān)基因的表達(dá)。根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒操作說(shuō)明書(shū)（PrimeScript 1st Strand cDNA Synthesis Kit）對(duì)提取的蛹蟲(chóng)草子實(shí)體總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄操作。將反轉(zhuǎn)錄的cDNA樣本作為PCR的模板，以蟲(chóng)草菌株肌動(dòng)蛋白基因actin作為內(nèi)參基因，對(duì)5′-nucleotidase、腺苷酸琥珀酸合成酶、嘌呤核苷磷酸化酶這3個(gè)蟲(chóng)草素相關(guān)基因進(jìn)行半定量分析。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，actin基因25個(gè)循環(huán)，其他3個(gè)基因35個(gè)循環(huán)；72 ℃后延伸10 min。基因引物序列見(jiàn)表2。

2 結(jié)果與分析

2.1 單交配型基因無(wú)性單孢子篩選結(jié)果

蛹蟲(chóng)草的無(wú)性孢子容易在PDA培養(yǎng)基上萌發(fā)，一般在涂布后3 d可觀察到PDA平板上有孢子萌發(fā)的跡象，5 d后有肉眼可見(jiàn)的小菌落在平板上形成。挑取單菌落放入新的PDA平板培養(yǎng)萌發(fā)9 d后提取菌絲體DNA，PCR鑒定其交配型類型。菌株JW14-1和菌株CW15分離的無(wú)性單孢中，有的單孢子只含有交配型I基因，有的單孢子只含有交配型II基因，有的單孢子則2種交配型基因都含有（圖1），在JW14-1單孢分離株中，1號(hào)、4號(hào)、5號(hào)3個(gè)單孢分離株只含交配型I基因，在CW15單孢分離株中，9號(hào)單孢分離株只含有交配型II基因（圖1）。最終經(jīng)過(guò)PCR鑒定，從29個(gè)JW14-1的單孢子中挑選出12個(gè)只含有交配型I基因的單孢分離株，從46個(gè)CW15的單孢中挑選出8個(gè)只含有交配型II基因的單孢分離株。將這12個(gè)JW14-1單孢與這8個(gè)CW15的單孢菌株進(jìn)行配對(duì)培養(yǎng)。根據(jù)優(yōu)良菌種菌絲潔白，濃密粗壯，呈匍匐裝緊貼在培養(yǎng)基上，邊緣整齊，沒(méi)有明顯的絨毛狀白色的氣生菌絲，菌絲見(jiàn)光后會(huì)變金黃色等特點(diǎn)，最終選出了16株配對(duì)菌種進(jìn)行出草培養(yǎng)試驗(yàn)。

2.2 配對(duì)菌株子實(shí)體中蟲(chóng)草素含量的比較分析

初步選育的16株配對(duì)菌株接種培養(yǎng)60 d后，檢測(cè)各菌株子實(shí)體中蟲(chóng)草素的含量，結(jié)果表明：親本株CW15子實(shí)體中蟲(chóng)草素含量?jī)H為0.392%，JW14-1子實(shí)體中蟲(chóng)草素含量為0.515%。16個(gè)配對(duì)菌種中，所有菌種子實(shí)體中蟲(chóng)草素含量均高于親本株CW15，14個(gè)菌種的蟲(chóng)草素含量與親本株 JW14-1相差不大，但6號(hào)和14號(hào)配對(duì)菌株子實(shí)體中蟲(chóng)草素含量均達(dá)到了0.763%，具有進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用的重要價(jià)值（表3）。

2.3 菌株子實(shí)體中蟲(chóng)草素相關(guān)基因的表達(dá)分析

Zheng P等[8]利用NGS對(duì)蛹蟲(chóng)草 Cm01菌株的基因組進(jìn)行Denovo測(cè)序，獲得蛹蟲(chóng)草的基因組序列并找到了腺嘌呤和腺苷代謝的相關(guān)基因。Yin Y等[9]對(duì)假設(shè)的蟲(chóng)草素合成途徑上的相關(guān)基因進(jìn)行研究，結(jié)果表明，不同基因在菌絲體和子實(shí)體中的表達(dá)不同。根據(jù)上述文獻(xiàn)，可認(rèn)為腺苷酸琥珀酸合成酶、5′-nucleotidase和嘌呤核苷磷酸化酶可能在蟲(chóng)草素合成過(guò)程中起到了較為重要的作用。為此，分別采集培養(yǎng)60 d后的CW15、JW14-1、5號(hào)配對(duì)株以及6號(hào)配對(duì)株的子實(shí)體，提取總RNA，利用RT-PCR技術(shù)檢測(cè)3個(gè)基因在這些菌株中的表達(dá)情況，結(jié)果如圖2所示。可以看出，腺苷酸琥珀酸合成酶基因在CW15中的表達(dá)水平最高，在6號(hào)配對(duì)株中的表達(dá)水平最低；5′-nucleotidase基因在JW14-1中的表達(dá)水平最低，在6號(hào)配對(duì)株中的表達(dá)水平最高；嘌呤核苷磷酸化酶基因在CW15中的表達(dá)水平最低，在6號(hào)配對(duì)株中的表達(dá)水平最高。因此，高蟲(chóng)草素含量菌株（6號(hào)配對(duì)株）中的5′-nucleotidase基因和嘌呤核苷磷酸化酶基因具有高水平表達(dá)，而腺苷酸琥珀酸合成酶基因的表達(dá)水平則相反。

3 結(jié)論與討論

食用菌的雜交育種中，有性雜交育種是目前食用菌種改良的一種主要手段，無(wú)性雜交育種則用的較少。在親本性狀的變異表現(xiàn)型中，有性單孢子的變異主要來(lái)源于核基因的重組和分離，而無(wú)性單孢子的變異則與核外的遺傳物質(zhì)如細(xì)胞質(zhì)因子有關(guān)[10]。本文利用不同交配型基因無(wú)性單孢菌株配對(duì)的方式，獲得了蟲(chóng)草素含量顯著提升的蛹蟲(chóng)草菌種，認(rèn)為該菌種的核外遺傳物質(zhì)可能發(fā)生了某種變異，這種變異可能直接或間接影響了蟲(chóng)草素代謝通路中某些相關(guān)基因的表達(dá)。據(jù)此，大膽推測(cè)，在食用菌中，核外遺傳物質(zhì)是否更多與次生代謝相關(guān)。因此，本工作可能為無(wú)性雜交技術(shù)改良菌種的次生代謝活性提供了一些新思路。

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