氣相色譜燃燒同位素比值質譜法分析氨基酸氮穩定同位素并初步評估水生生物體營養級

趙晶晶　張忠義　鄭能建　田晶　朱光旭　肖化云

摘要氨基酸穩定氮同位素（δ15N）分析能準確有效地評估生物體的營養級以及氮在食物鏈中的流動。本研究優化了氨基酸氮同位素的分析方法：樣品在酸性條件下水解后， 釋放出的蛋白質氨基酸經陽離子交換樹脂純化后， 衍生為對應的N新戊酰基， O異丙醇（Npivaloylisopropyl， NPP）酯， 利用氣相色譜燃燒同位素比值質譜儀（Gas chromatographycombustionisotope ratio mass spectrometry， GCCIRMS）測定其δ15N。經非極性氣相色譜柱DB5ms分離后， 13種氨基酸NPP酯衍生物均可得到良好的基線分離。在樣品量不低于20 ng N條件下， GCCIRMS方法的精密度優于1‰， 測得的δ15N值與EAIRMS法測得的δ15N值沒有明顯差異。陽離子樹脂純化前后各氨基酸δ15N值差異低于1‰， 表明沒有產生明顯的同位素分餾。采用本方法成功地估算了阿哈湖生態系統中常見水生生物的營養級， 可作為研究氨基酸代謝以及生態系統特征的新方法。

關鍵詞N新戊酰基，O異丙醇（NPP）酯； 氨基酸； 氣相色譜燃燒同位素比值質譜； 營養級

1引 言

氮穩定同位素已廣泛用來研究生態系統的特征與過程[1]。其中， 生物體有機質總氮同位素的組成（δ15N）已成為一系列生態學研究的重要手段之一， 尤其是用于評估有機體的營養級和測定氮在食物鏈中的流動[2]。總氮同位素方法用來評估營養級是基于大量研究的平均觀測值：δ15N隨食物網的富集指示大約為3.4‰[3]。然而總氮同位素方法也有局限性：（1）不同物種間的δ15N富集程度存在明顯差異。DeNiro 和Epstein研究發現， 不同綱屬動物（昆蟲綱， 哺乳綱等）的

N值會造成所研究生態系統中營養關系的嚴重誤判。

氨基酸單體氮同位素組成是可以準確有效地估算有機體營養級。研究表明， 生物體內谷氨酸（Glu）以及苯丙氨酸（Phe）氮同位素比值差異可以指示其營養級[5～7]。代謝過程中， 谷氨酸快速進行轉氨基作用， CN鍵斷裂， δ15N富集較大（+8.0‰）。相反， 苯丙氨酸的主要代謝步驟是增加一個羥基基團轉化成酪氨酸， 此過程不伴隨CN鍵斷裂， δ15N富集不明顯（+0.4‰）， 這種代謝關系的差異導致在特定營養級的有機體中谷氨酸和苯丙氨酸的δ15N明顯不同。水生生態系統有機體營養級計算公式為[8，9]：

TLGlu/Phe =1+ （δ15NGlu-δ15NPhe-3.4）/7.6（1）

在文獻[10]基礎上， 本研究對GC條件、前處理方法以及衍生技術進行了優化。本方法準確性高， 重現性好， 為分析氨基酸氮穩定同位素以及評估水生生物體營養級提供參考。

2實驗部分

2.1儀器與試劑

氣相色譜燃燒同位素比值質譜儀（GCCIRMS， 美國ThermoFisher公司）； 氣相色譜質譜儀（GCMS， 689070000C， 美國Agilent公司）；元素分析儀（EA， 美國ThermoFisher公司）； 氮吹儀（BYN1002， 上海秉越電子儀器有限公司）。

13種氨基酸標準品：丙氨酸， 甘氨酸， 纈氨酸， 亮氨酸， 異亮氨酸， 脯氨酸， 天冬氨酸， 蛋氨酸， 絲氨酸， 蘇氨酸， 谷氨酸和苯丙氨酸和γ氨基丁酸， 以及內標氨基酸：正亮氨酸和β氨基丁酸的純度均為99.9%， 均購于美國SigmaAldrich公司。陽離子交換樹脂（Dowex 50W X8 H+， 200～400 mesh， SigmaAldrich公司）用于純化樣品。水解和衍生試劑包括： 12.1 mol/L HCl（ACS級）、 甲醇（色譜級）、 正己烷、 二氯甲烷、 亞硫酰氯、 新戊酰氯、 無水MgSO4， 均購于上海阿拉丁公司。

2.2實驗方法

2.2.1生物樣品采集、氨基酸提取以及衍生化 本研究的樣品為2015年8月10日自阿哈湖水域（東經106°39′， 北緯26°33′）隨機采集9種水生生物。所有樣品冷凍干燥后， 研磨均勻。準確稱取10 mg樣品置于反應瓶中， 加入0.5 mL 2.1mol/L HCl后密封， 于110℃下水解24 h。室溫冷卻后， 水解液在60℃下用氮氣吹干。水解產物溶解于0.1 mol/L HCl， 經正己烷二氯甲烷（3∶2， V/V）充分脫脂后，過陽離子交換樹脂純化， 用4 mol/L 氨水洗脫。內標加入洗脫液中， 經氮吹儀吹干， 并按照上述方法進行衍生化。陽離子交換樹脂處理后可能存在的背景干擾由相應的空白程序檢驗。

2.2.2生物樣品氨基酸混標衍生化標準樣品溶液充分干燥后加入1 mL亞硫酰氯異丙醇（1∶4， V/V）于110℃下酯化2 h。氮吹儀吹干后， 再加入1 mL新戊酰氯二氯甲烷溶液（1∶4， V/V） 于110℃下酰化2 h， 生成N新戊酰基和O異丙醇酯， 多余的衍生化試劑經氮吹后完全去除。氨基酸NPP酯溶于0.5 mL二氯甲烷溶液， 用GCCIRMS測定氮同位素值[10]。

2.2.3色譜及儀器條件色譜柱：Agilent DB5ms毛細管柱（30 m × 0.25 mm × 0.25 μm）； 載氣： He（99.9999%）， 流速1.4 mL/min； 進樣口溫度： 250℃； 升溫程序： 初始40℃保持2.5 min， 以15℃/min升至110℃，再以3℃/min升至150℃， 最后以6℃/min升至230℃； 無分流模式進樣， 進樣量1.0～1.5 μL。單個氨基酸保留時間用GCMS確定。氨基酸氮同位素分析使用GCCIRMS進行， 氨基酸衍生化樣品先通過GC分離， 然后進入毛細管微反應器（IsoLink）轉化為相應的氣體， 燃燒產生的水分由全氟磺酸滲透膜去除， 將連通燃燒管與質譜儀的毛細管置于液氮冷阱中， 以固定樣品燃燒產生的CO2， 每測定10個樣品后， 將冷阱去掉， 以釋放固定住的CO2， 防止堵塞該毛細管[11]。設定燃燒爐溫度為1030℃， 選用N2測定模式， 自動調用m/z 28， 29， 30的離子源參數。

2.3數據處理

數據處理運用ISODAT 軟件（Thermo， Fisher）， δ15N峰開始和結束的斜度分別設為0.2和0.4 mV/s， δ15N值的計算如下：

δ15N（‰）=[（Rsample/Rstandard）-1]×1000（2）

其中， Rsample表示所測樣品中15N豐度與14N豐度之比， Rstandard表示標準樣品中15N豐度與14N豐度之比。

3結果與討論

3.1衍生條件及GCCIRMS系統

氨基酸是兩性離子， 其羧基、氨基以及側鏈官能團被完全衍生化前并不適合用氣相色譜分離。在本研究中， 氨基酸通過衍生成功轉化為NPP酯。該方法的主要優點：所有的衍生化試劑不含氮原子， 因此不需要對氮同位素進行進一步校正；相較乙酰基而言， 新戊酰基的引入進一步減小了氨基酸的極性， 增加了色譜的分離效果。另外， 氨基酸NPP衍生物產生的背景噪音更小[12]。對于氣體同位素質譜系統而言， 毛細管柱和燃燒系統是非常重要的， 任一系統表面失活， 都可能會導致靈敏度的下降， 伴隨著保留時間的漂移， 信號強度顯著下降以及同位素比值不穩定等現象。因此， 每隔20～25個樣品，

GCIsoLink燃燒爐都有必要進行重新氧化。通氧后， 氮信號強度是判斷儀器是否恢復穩定的最好評判標準。本研究在GCCIRMS通氧后連續測定丙氨酸NPP酯衍生物20次。如圖1所示， 丙氨酸氮信號值在第6次進樣后達到穩定。GCCIRMS通氧、反吹后， 為保證測定值的準確性， 至少需測定標準樣品5次（活化）， 待信號值穩定后才能進行樣品的測定。實際過程中， 利用氨基酸混標進行活化。GCCIRMS每批次能測定的樣品數量與、 樣品性質及通氧時間等因素有關。實驗時應注意插入氨基酸標準來檢測Isolink的氧化性能， 一旦發現氧化效率降低， 立即停止測樣進行通氧氧化。通過氧化、活化， 氨基酸保留時間和氮信號強度會恢復正常。

3.2氨基酸在GCCIRMS中的色譜行為

GC的分離度取決于分析物的揮發性以及與固定相的相互作用。本研究使用非極性氣相色譜柱（DB5ms）對氨基酸NPP衍生物進行分離。與其它極性色譜柱相比， 該色譜柱可承受更寬的溫度范圍，

并可以得到氨基酸峰之間的最佳基線分離（如圖2a和圖2b）。目標化合物峰的基線分離是準確測定同位素值的首要條件， 尤其對于復雜的生物樣品而言。氨基酸衍生物保留時間與引入的烷基的長度相關， 其次還與氣相色譜柱的極性相關。在本研究中， 13種氨基酸可以得到基線分離（如圖2a和圖2b）， 低分子量、非極性的氨基酸， 例如丙氨酸、甘氨酸， 與固定相作用不強烈， 所以首先被洗脫出來。其次被洗脫出來的是較高分子量的中性氨基酸（例如纈氨酸， 亮氨酸）以及低分子量的極性氨基酸。最后被洗脫出來的是更高分子量的極性、芳香族氨基酸， 因為它們能與固定相發生強烈作用（圖2b）。樣品水解過程中， 天冬酰胺和谷氨酰胺會轉化為天冬氨酸和谷氨酸， 因此GCCIRMS 測量得到的天冬氨酸的δ15N 值代表了天冬氨酸中的氮和天冬酰胺中的氨基氮的δ15N 值， 谷氨酸的δ15N 值代表了谷氨酸中的氮和谷氨酰胺中的氨基氮的δ15N 值。

3.3GCCIRMS測定氨基酸氮同位素比值的精密度和準確度

為了評估測定結果的精確度以及檢驗本系統是否適用于自然豐度的氨基酸氮同位素比值的測定， 6個同樣濃度的氨基酸混合標準溶液分別衍生化， 并用GCCIRMS 測定其δ15N值。GCCIRMS測定的氨基酸δ15N值與EAIRMS測定的值相比， 評估測定結果的準確性（表1）。結果表明， GCCIRMS測定值具有較高的精密度， 所有氨基酸的δ15N值精密度都在1‰以內。EAIRMS和 GCCIRMS測定結果高度相關， 回歸斜率接近1， 相關系數為0.98（圖3）。經過校正， 這兩種儀器的測量值之間的差異小于1‰。另外， 采用BlandAltman 法評估EAIRMS和 GCCIRMS測定結果的一致性。結果表明， GCCIRMS測定結果的平均偏差接近0.0‰， 明顯位于儀器精確度范圍內（圖4）。因此， GCCIRMS測定

氨基酸氮同位素沒有造成明顯的同位素分餾， 并且本方法得到的δ15N值EAIRMS具有同等的準確度。

3.4氨基酸δ15N分析所需樣品量

GCCIRMS分析氨基酸氮同位素所需的樣品量是優化δ15N測定結果的準確度和精確度必須考慮的另一個重要參數。Merritt 等[13]認為δ15N的測定值和進樣量之間存在一定的相關性。Takano等[14]發現當氨基酸峰高（m/z 28）大于100 mV時， δ15N測定值的精確度較高（1σ=0.5‰）， 約相當于30 ng N的進樣量。同樣的， Styring等[15]發現在100～1200 mV的信號強度范圍內， 氨基酸δ15N測定值重復性最佳。本研究同樣證實了這種現象， 0.3～4.5 nmol氨基酸標準經過衍生后測得的信號值與對應的δ15N值具有一定的相關性， 如圖5所示。為得到準確可靠的δ15N值， 本實驗中進樣量為不少于20 ng N， 大致相當于200 mV（m/z 28）信號強度。與文獻[14，16]相比， 可能是由于同位素質譜儀以及燃燒爐性能的提高， 因此本研究所需進樣量減少。

3.5陽離子交換樹脂對于氨基酸δ15N測定的影響

利用陽離子交換樹脂純化氨基酸樣品被認為是一種有效方法， 可以去除一部分無機化合物， 并且將氨基酸從復雜的親水化合物中分離出來， 如糖、有機酸等。這些干擾化合物會大量消耗衍生劑， 也可能會對GCCIRMS系統的燃燒和還原爐造成損害[14，15]。尤其是， 當樣品中的目標化合物和其它含氮化合物不能基線分離時， 會導致目標化合物的δ15N測定值與真實值偏差較大[17]。因此， 為了得到準確可信的δ15N值， 樣品純化是非常必要的。

如圖6所示， 過柱前后氨基酸δ15N值具有較好的相關性， 即使使用氨水洗脫樹脂中富集的氨基酸， δ15N值差異也不明顯。這說明使用此方法能夠有效排除非氨基酸類物質對檢測結果的干擾。

為了驗證陽離子交換樹脂可能帶來的雜質化合物， 空白溶液經完整的前處理過程后衍生并用GCCIRMS分析。如圖2c所示， 色譜圖中沒有明顯的背景化合物， 因此使用陽離子交換樹脂對生物樣品進行純化是非常有效的手段。

3.6氨基酸氮同位素方法初步評估阿哈湖淡水生態系統常見物種營養級

本研究通過對自然界生物個體中氨基酸氮同位素的測定評估該有機體的營養級。氨基酸的氮同位素組成以及TLGlu/Phe值如表2所示。根據所得TLGlu/Phe 值， 可以有效確定淡水生態系統的有機體營養級。大部分淡水生態系統中的食物鏈始于初級生產者（TL = 1，例如藻類和植物）。一般認為食草動物的營養級為2， 雜食性動物處于2～3之間， 而肉食性動物則處于3以上。在本研究中， 以白鰱和草魚為代表的草食性魚的的TLGlu/Phe≈2， 分別為1.9和 2.1。初級生產者水綿和黑藻的TLGlu/Phe 值分別為1.0和1.2。黃顙魚是一種被公認的兇殘的食肉型魚類， 其TLGlu/Phe=3.2。包括花鰱、鯽魚、鯉魚以及日本沼蝦在內的水生生物被認為是雜食性動物， TLGlu/Phe 值處于2.3～2.4之間。表2中的TLGlu/Phe 值和個體預期的營養級高度符合。因此， 氨基酸氮同位素法能準確反映有機體在自然淡水生態系統中的營養級。

4結 論

本研究采用氨基酸NPP酯衍生方法對前處理、衍生以及GC條件進行優化， 有效分離了13種氨基酸， 通過GCCIRMS測定得到準確可靠的δ15N值。陽離子交換樹脂純化氨基酸是一種有效的方式， 氨基酸標準經純化后其δ15N值變化幅度低于1‰。在進樣量不低于20 ng N時， GCCIRMS測定氨基酸δ15N值精度較高。本方法可以廣泛應用于大部分生物樣品中氨基酸δ15N值的測定。另外， 應用本方法測定阿哈湖水生生態系統中生物個體的氨基酸的δ15N 值， 進而計算對應的營養級， 所得結果與預期值高度相符，說明本方法可以有效估計自然生態中的某特定生物體的營養級。

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AbstractThe analysis of stable nitrogen isotopic composition （δ15N） of individual amino acid was recognized as an effective method for estimating the trophic level of organisms and detecting the nitrogen flow in food webs. In this study， we evaluated a twostage procedure of esterification followed by acylation， in which biological samples underwent hydrolysis in acid and the released individual amino acids were derivative into the corresponding Npivaloylisopropyl （NPP） esters for gas chromatographycombustionisotope ratio mass spectrometric （GCCIRMS） analysis. A total of 13 kinds of individual amino acid derivatives were baseline separated on a nonpolar gas chromatography column （DB5ms）. The amount of sample for each test was not less than 20 ng N on column. High correlations were observed between the δ15N values respectively obtained by GCCIRMS and element analysisisotope ration mass spectrometry （EAIRMS）. Furthermore， the mean precision of this method was better than 1‰. Cationexchange chromatograph was used to purify the samples， and the difference of the detection δ15N values before and after purification by the resin was within 1‰. This method was applied to estimate the trophic level of various natural freshwater organisms from Aha Lake. The present study provided a new idea for the application of stable nitrogen isotope （δ15N） in the trophic level estimation of organisms and metabolism analysis of amino acid.

KeywordsNpivaloylisopropyl esters； Amino acid； Gas chromatographycombustionisotope ratio mass spectrometry； Trophic level