麥冬寡糖的提取純化及抑制α—葡萄糖苷酶活性的研究

許定舟+蘇薇薇++王永剛++彭維++吳忠

[摘要] 目的 研究麥冬中寡糖的提取分離純化工藝，并考察其抑制α-葡萄糖苷酶活性。 方法 采用乙醇和水提取麥冬寡糖，以Sephadex G-75柱層析法進行脫色脫蛋白，利用基質輔助激光解析飛行質譜儀（MALDI-TOF-MASS）檢測其分子量范圍；采用來源于啤酒酵母的α-葡萄糖苷酶和來源于大鼠的具有α-葡萄糖苷酶活性的小腸絨毛提取物，考察麥冬寡糖的抑制α-葡萄糖苷酶活性。 結果 采用乙醇和水提取得到的麥冬提取液中寡糖含量為86.73%，提取率為69.4%；利用Sephadex-G75柱層析法能有效地純化麥冬寡糖，除去色素和蛋白質分子，麥冬寡糖提取物的總寡糖含量達到97.64%，其分子量范圍在500～2500之間；該麥冬寡糖對α-葡萄糖苷酶活性具有顯著抑制作用。 結論 本研究提取純化麥冬寡糖的方法是合理、可行的；麥冬寡糖具有顯著抑制α-葡萄糖苷酶活性。

[關鍵詞] 麥冬寡糖；提取純化；α-葡萄糖苷酶

[中圖分類號] R284.1 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-7210（2017）02（a）-0020-03

Extraction、purification and α-glucosidase inhibitory activity of oligosaccharide from Ophiopogonis japonicas

XU Dingzhou SU Weiwei WANG Yonggang PENG Wei WU Zhong LI Peibo

College of Life Sciences，Sun Yat-sen University，Guangzhou 510275， China

[Abstract] Objective To investigate the extraction，purification and α-glucosidase inhibitory activity of oligosaccharide from Ophiopogonis japonicas. Methods In this study，Ophiopogonis japonicas oligosaccharides were extracted with 95% alcohol and water successively， and the extract was purified by Sephadex G-75 chromatography to remove protein and pigment.The molecular weight range was determined by MALDI-TOF-MASS. The α-glucosidases of rat intestines and Saccharomyces cerevisiae were used to evaluate the inhibitory activity of Ophiopogonis japonicus oligosaccharides. Results The content of oligosaccharide extracted with 95% alcohol and water successively was 86.73%，and the extraction rate was 69.4%. After being purified by Sephadex G-75 chromatography， the protein and pigment in oligosaccharide extract was removed effectively and the content of oligosaccharide increased to 97.64%.The molecular weights were in the range of 500-2500. Furthermore，Ophiopogonis japonicas oligosaccharide could significantly inhibit the activity of α-glucosidase. Conclusion The methods of extraction and purification are technically reasonable and feasible；Ophiopogonis japonicus oligosaccharide possess significant α-glucosidase inhibitory activity.

[Key words] Ophiopogonis japonicus oligosaccharide；Extraction and purification；α-glucosidase

麥冬為百合科植物麥冬[Ophiopogon japonicas （L.f） Ker-Gawl.]的干燥塊根，有養陰生津、潤肺清心之功，主要用于肺燥干咳、津傷口渴、內熱消渴和腸燥便秘等[1]。《本草正義》記載[2]：“凡消谷能食，無非胃火極旺，必以甘寒大劑清胃解渴，麥冬固在必需之列者也”。有研究表明麥冬對四氧嘧啶[3]、鏈脲佐菌素[4-5]誘導的高血糖動物和自發性糖尿病大鼠[6]具有顯著降血糖作用。麥冬中含有皂苷、黃酮、氨基酸和糖類等成分[7-8]。由于我國糖尿病發病人數逐年上升[9]，麥冬顯著的降血糖作用引起了越來越多的重視[10-12]。已有研究表明，麥冬多糖具有顯著降血糖作用[3，5，12]。本課題組前期研究表明，麥冬寡糖具有顯著抗2型糖尿病作用[13]，但其作用機制尚不明確。本實驗研究麥冬中寡糖的提取純化工藝，并考察其抑制α-葡萄糖苷酶活性，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 原料與試劑 麥冬，購于廣州清平藥材市場，經中山大學生命科學學院彭維主任藥師鑒定，為百合科植物麥冬Ophiopogon japonicas（L.f）Ker-Gawl.的干燥塊根；α-葡萄糖苷酶（美國，SIGAMA）；阿卡波糖（中國，拜耳醫藥保健有限公司）；對硝基苯-β-D-半乳糖吡喃糖苷（美國，SIGAMA）；蒽酮、無水乙醇、無水乙醚、丙酮、D-果糖等試劑均為分析純。

1.1.2 設備與儀器 常壓蛋白層析儀（美國，BIO-RAD）；自動部分收集器（美國，BIO-RAD）；雙光束紫外可見分光光度計（TU-19101，北京普析通用公司）；基質輔助激光解析飛行質譜儀（MALDI-TOF-MASS；美國，Bruker Daltonics）；酶標儀（美國，THERMO公司）；Sephadex G-75（瑞典，Pharmacia公司）。

1.2 動物

Wistar大鼠，7周齡，雄性，體重180～200 g，SPF級，由廣東省醫學實驗動物中心提供，動物合格證號：SCXK（粵）2008-0002。

1.3 方法

1.3.1 麥冬寡糖的提取與純化 取麥冬藥材適量，剪碎，加10倍量95%乙醇，回流2 h，過濾，棄濾液，揮干乙醇，加10倍量蒸餾水，水浴提取2次，濾過，合并濾液，減壓濃縮至密度為1.2 g/mL，加乙醇至醇濃度為80%，靜置12 h，沉淀，分別以無水乙醇、無水乙醚、丙酮洗滌，55℃烘干，即得麥冬粗提取物。取麥冬粗提取物，溶于適量蒸餾水中，以3000 r/min的轉速離心，除去沉淀，Sephadex G-75層析柱（3 cm×80 cm）上樣，以蒸餾水洗脫，流速為0.5 mL/min。每管5 mL，自動部分收集器收集，合并洗脫峰，冷凍干燥，得到純化后的麥冬寡糖。硫酸-蒽酮法測定總寡糖含量。將Sephadex G-75柱層析所得麥冬寡糖樣品溶于超純水，配成2 μg/mL溶液，分別取0.5 μL樣品溶液與5mg/mL 的基質2，5-二羥基苯甲酸（DHB）互溶揮干溶液，采用MALDI-TOF-MASS進樣檢測麥冬寡糖的分子量范圍。

1.3.2 麥冬寡糖對α-葡萄糖苷酶活性的影響 （1）大鼠小腸α-葡萄糖苷酶提取液的制取，參照文獻方法[14]，取Wistar大鼠，禁食24 h后，脫頸椎處死，立即取出小腸，用冰冷生理鹽水沖洗小腸內外，將洗凈的小腸置于冰臺上，用載玻片輕刮小腸黏膜，稱重后加入5倍量的4 ℃磷酸鹽緩沖液（pH 6.8），勻漿后于4℃、5000 r/min冷凍離心30 min，取上清液，考馬斯亮藍法測定上清液蛋白含量，于-20℃下保存備用。（2）樣品溶液配制，稱取麥冬寡糖樣品，用磷酸鹽緩沖液（pH 6.8）溶解配制成濃度為400 mg/mL、200 mg/mL、100 mg/mL的麥冬寡糖溶液；取阿卡波糖片，以磷酸鹽緩沖液（pH 6.8）溶解，2000 r/min離心10 min，棄沉淀，使終濃度為50 mg/mL。（3）α-葡萄糖苷酶抑制活性的測定，參照文獻方法[15-16]，以96孔微板為反應載體，經改進優化后的反應體系為：每孔加入67 mmoL/L磷酸鹽緩沖液20 μL、3 mmoL/L谷胱甘肽溶液10 μL、大鼠小腸絨毛α-葡萄糖苷酶提取液或0.04 mg/mL α-葡萄糖苷酶溶液10 μL、受試樣品20 μL，37℃溫孵10 min后，加入0.01 moL/L對硝基苯-β-D-半乳糖吡喃糖苷溶液20 μL，反應20 min，用0.1 moL/L Na2CO3溶液100 μL終止反應，在波長為400 nm的條件下，用酶標儀測定吸光值。每組設三個平行，每個濃度測定三次抑制率，取平均抑制率計算受試樣品和陽性對照阿卡波糖對α-葡萄糖苷酶活性的抑制率。

2 結果

2.1 麥冬寡糖的提取與純化

采用95%乙醇和水提取后，得到的麥冬提取物中寡糖的含量為86.73%，提取率為69.4%。經Sephadex G-75柱層析所得樣品的寡糖含量為97.64%，樣品顏色變為純白色，色素得到有效去除。經MALDI-TOF-MASS進樣檢測，該麥冬寡糖的分子量范圍在500～2500之間。見圖1。

2.2 麥冬寡糖對α-葡萄糖苷酶活性的影響

麥冬寡糖對來源于啤酒酵母的α-葡萄糖苷酶和大鼠小腸絨毛中提取的α-葡萄糖苷酶的酶活性都具有抑制作用，在濃度為100～400 mg/mL之間，抑制作用具有劑量依賴關系，當濃度為400 mg/mL時，抑制強度與阿卡波糖相當。說明麥冬寡糖具有抑制α-葡萄糖苷酶活性的作用。見圖2～3。

3 討論

寡糖一般是指由2～10個單糖以糖苷鍵相連形成的糖分子聚合物。寡糖及其衍生物是一類重要的生物活性物質，已發現其具有免疫調節、降血糖、改善菌群結構等多種作用[17-18]。目前，寡糖的制備方法主要有從天然產物直接提取、酶催化合成或酶解天然多糖、酸水解天然多糖和化學合成等4種[17]。天然寡糖的提取方法主要有水提法、有機溶劑抽提法、微波提取法、超聲波提取法；常見的寡糖分離和純化方法有薄層層析法、活性炭柱層析法、色譜柱分離法、膜分離技術等[19-20]。許多中藥含有寡糖，且有些具有較好的藥理活性，但目前對中藥寡糖的研究較少，值得進一步深入開發研究。

本研究采用乙醇和水提取麥冬寡糖，得到的麥冬提取物中寡糖含量為86.73%，提取率為69.4%，說明本方法能較好地提取麥冬寡糖；經Sephadex G-75柱層析法除去色素和蛋白質分子后，麥冬寡糖提取物的總寡糖含量達到97.64%，樣品顏色變為純白色，提示該方法可以有效去除提取物中的蛋白和色素，適宜于麥冬寡糖的純化。經MALDI-TOF-MASS檢測，該麥冬寡糖的分子量范圍在500～2500之間。課題組前期研究顯示麥冬寡糖具有顯著抗2型糖尿病作用[13]，本研究結果表明，該麥冬寡糖能顯著抑制來源于啤酒酵母的α-葡萄糖苷酶和來源于大鼠小腸絨毛的α-葡萄糖苷酶的活性。本研究為麥冬寡糖在糖尿病的預防和治療方面的應用及相關產品的開發提供了一定的實驗基礎。

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（收稿日期：2016-09-28 本文編輯：王雪）