Exendin—4對乳鼠心肌細胞缺氧/復氧損傷的抗氧化保護作用

張晨禹++潘謝添++胡健強+王婷婷

[摘要] 目的 探討胰高血糖素樣肽-1（GLP-1）對乳鼠心肌細胞缺氧/復氧（H/R）損傷中的抗氧化作用。 方法 取出生1～3d的SD大鼠乳鼠心臟，采用差速貼壁法分離并培養其心肌細胞，通過對乳鼠心肌細胞H/R損傷模擬缺血再灌注。實驗共分為5組，A組：正常對照組；B組：H/R組；C組：缺氧預處理組，先缺氧20 min后復氧20 min，然后進行H/R；D組：GLP-1激動劑組，Exendin-4預處理之后進行H/R；E組：GLP-1拮抗劑組，Exendin-4+Exendin-（9-39）預處理之后進行H/R。各組于復氧后，使用MTT比色法檢測各組細胞存活率；乳酸脫氫酶（LDH）、超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）試劑盒檢測各組細胞損傷程度。 結果 與A組相比較，B組心肌細胞存活率明顯降低，培養液中LDH漏出量顯著增加，細胞上清液中SOD活性明顯降低且MDA含量明顯增加，差異具有統計學意義（P < 0.01）。與B組相比較，C組和D組存活率明顯增加，培養液中LDH漏出量顯著減少，細胞中SOD活性明顯升高且MDA含量明顯降低，差異具有統計學意義（P < 0.05），而二組之間差異無統計學意義（P > 0.05）。但給予GLP-1拮抗劑后顯著降低其保護作用。 結論 Exendin-4通過GLP-1R依賴機制減少缺氧造成的氧化應激損傷，進而保護心肌細胞，表明GLP-1具有抗氧化保護作用。

[關鍵詞] 胰高血糖素樣肽-1；缺氧/復氧；氧化應激

[中圖分類號] R363 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-7210（2017）02（a）-0012-04

Antioxidant protective effect of Exendin-4 on hypoxia / reoxygenation injury in cultured neonatal rat cardiomyocytes

ZHANG Chenyu PAN Xietian HU Jianqiang WANG Tingting GAO Haokao▲

Department of Cardiology， Xijing Hospital， Fourth Military Medical University， Shaanxi， Xi′an 710032， China

[Abstract] Objective To investigate antioxidant protective effect of glucagon like peptide -1 （GLP-1） on the hypoxia / reoxygenation （H/R） injury in neonatal rat cardiomyocytes. Methods The rat heart was isolated from 1 to 3 days old SD rats， and the cardiomyocytes were isolated and cultured by differential adherence method. The myocardial ischemia-reperfusion injury was simulated by H/R damage. The experiments were divided into 5 groups： group A： normal control group； group B： H/R group； group C： hypoxia preconditioning group， first hypoxia for 20min， and reoxygenation for 20min， then H/R； group D： GLP-1 agonist group， after Exendin-4 pretreatment， then H/R； group E： GLP-1 antagonist group， after Exendin-4 + Exendin- （9-39） pretreatment， then H/R. After reoxygenation， the cell survival rate of each group was detected by MTT colorimetric assay， and the cell damage degree of each group was detected by LDH， superoxide dismutase （SOD） and malondialdehyde （MDA）. Results Compared with A group， myocardial cell survival rate in B group was significantly decreased， LDH in culture fluid leakage in the supernatant was significantly increased， SOD activity decreased and MDA content increased significantly， the difference was statistically significant （P < 0.01）. Compared with B group， the survival rate of C group and D group was significantly increased， the LDH leakage in the culture medium significantly reduced， the activity of SOD in cells was significantly increased and the content of MDA was significantly reduced， the difference was statistically significant （P < 0.05）， but there was no significant difference between the two groups （P > 0.05）. However， the protective effect was significantly decreased after giving GLP-1 antagonist. Conclusion Exendin-4 can reduce the oxidative stress injury induced by hypoxia and protect the myocardial cells through GLP-1R dependent mechanism， which indicates that GLP-1 has the protective effect of antioxidation.

[Key words] Glucagon-like peptide-1； Hypoxia/reoxygenation； Oxidative stress

心肌缺血再灌注損傷是臨床心肌梗死的研究熱點之一，但其機制目前尚未完全闡明清除。心肌細胞的缺氧復氧（H/R）損傷是主要的病理基礎。胰高血糖素樣肽（glucagon-like peptide-1，GLP-1）是由腸道內分泌細胞-L細胞分泌的一種腸降血糖素，能夠刺激胰島素分泌及抑制胰高血糖素分泌和胃排空[1]。因其受體（GLP-1R）分布十分廣泛的特點決定了GLP-1長效激動劑Exentin-4具有復雜的生理功能，目前在臨床上主要用于2型糖尿病的治療。近年來有研究發現[2]Exentin-4具有潛在的心血管保護作用，對心肌梗死病人給予后可改善患者心功能，且在心肌缺血再灌注中可顯著減少心肌梗死面積[3-4]。但目前國內關于Exendin-4對體外心肌細胞H/R損傷的研究相對較少。本實驗擬通過制備乳鼠心肌細胞H/R損傷模型，研究GLP-1R激動劑Exendin-4及其拮抗劑Exendin-（9-39）對乳鼠心肌細胞的H/R損傷的影響，初步探討作用機制，為臨床心肌缺血再灌注的治療提出新的線索。

1 材料與方法

1.1 材料

實驗動物為新生1～2 d齡的SD大鼠，雌雄不限，由第四軍醫大學實驗動物中心提供，合格證書：SCXK（軍）2012-0007。DMEM培養基和新生胎牛血清（FBS）購自Hyclone公司；Ι型膠原酶、Exentin-4、MTT均購自美國Sigma公司；Exendin（9-39）購自美國Anaspec公司。LDH活性檢測試劑盒、SOD和MDA含量測定試劑盒均購自南京建成生物工程研究所。

1.2 乳鼠心肌細胞的培養

采用酶解法[5]分離乳鼠心肌細胞。無菌條件下取出生1～2 d的SD大鼠心臟，用預冷的PBS液洗滌心臟3遍后將其剪碎。加入1 g/L的Ι型膠原酶用滴管吹打消化5 min后收集上清液，重復消化5次。在收集每次消化后的上清液中加等量100 mL/L胎牛血清的DMEM培養基用于中和消化酶。輕吹打混合液，過孔徑200目的不銹鋼網濾除未消化組織。將上述含細胞液的離心管以800 r/min離心5 min，棄上清，加入含20%胎牛血清的DMEM培養基重新懸浮細胞團，后放入CO2培養箱中孵育90 min后，培養液中未貼壁細胞即為心肌細胞。采用差速貼壁法制成濃度為1.5×108/mL細胞懸液接種于6孔培養板中，放入37℃、5% CO2孵箱中培養24 h后，48 h后更換培養液，以后隔日換液一次。

1.3 實驗分組及H/R模型的建立

本實驗采用狀態良好的2～3代乳鼠心肌細胞進行研究。實驗隨機分為5組： A組：正常對照組，不進行缺氧處理；B組：H/R組；C組：缺氧預處理組，此組作為陽性對照組，使用缺氧孵育容器于H/R前進行缺氧預處理；D組：GLP-1激動劑組，參考文獻[6-7]Exendin-4（10 nmol/L）預處理之后進行H/R；E組：GLP-1拮抗劑組，Exendin-4（10 nmol/L）+Exendin-（9-39）（100 nmol/L）預處理之后再進行H/R。每組設8個復孔。參照文獻[8]報道方法制備H/R損傷乳鼠心肌細胞模型：將培養板置于持續95% N2+5% CO2平衡的缺氧孵育容器中2 h，造成乳鼠心肌細胞的缺氧；之后更換培養液并放置于95%O2+5%CO2培養箱中進行復氧1 h；C、D及E組于H/R前30 min進行預處理。

1.4 細胞存活率的測定

MTT比色法是檢測細胞存活和生長的常用方法[9]。將心肌細胞用0.25%胰蛋白酶消化后制成單細胞懸液，用DMEM培養液調整細胞濃度為5×104/mL，接種于96孔培養板，每孔約100 μL，在37℃，5%CO2條件下培養24 h后棄上清。按1.3所述進行分組，每組設8個復孔。H/R損傷后加入MTT容液（5 mg/mL）10 μL， 37℃孵育4 h后棄去上清液，每孔再加入200 μL DMSO終止反應，震蕩15 min后用酶聯免疫檢測儀測定波長570 nm處測定吸光度A值，然后計算細胞存活率：細胞存活率（%）=（實驗組OD值/對照組OD值）×100%。

1.5 培養液中LDH含量的檢測

分別取各組心肌細胞培養液，按照試劑盒的操作方法步驟，采用全自動生化分析儀平行測定各組細胞培養液LDH含量。

1.6 細胞中SOD活性及MDA含量的檢測

棄培養基取細胞，每孔加入2 mL PBS，通過超聲波細胞破碎儀于10 kHz下冰浴中處理30 s，之后3500 r/min低溫（4°C）半徑10 cm離心10 min，留取上清液。按試劑盒的操作說明書要求，通過紫外-可見分光光度計平行測定各組細胞裂解液中SOD活性及MDA含量。

1.7 統計學分析

所有實驗數據均運用SPSS16.0統計軟件進行分析，實驗數據以（x±s）的形式表示，組間均數比較采用單因素方差分析，P < 0.05表示差異具有統計學意義。P < 0.01表示差異具有高度統計學意義。

2 結果

2.1 Exendin-4對H/R損傷乳鼠心肌細胞存活率的影響

心肌細胞經H/R后發現心肌細胞存活率降低，較A組相比差異有統計學意義（P < 0.01）；較B組相比，經Exendin-4預處理后乳鼠心肌細胞存活率升高19%，而給予GLP-1R拮抗后細胞存活率顯著降低，差異有統計學意義（P < 0.05），取消了GLP-1對細胞保護作用。結果見圖1。

2.2 Exendin-4對H/R損傷乳鼠心肌細胞培養液中LDH含量的影響

B組乳鼠心肌細胞培養液中LDH活性較A組升高0.47倍（P < 0.01）；與B組相比較，經缺氧預處理和Exendin-4預處理之后，培養液中LDH含量顯著降低（P < 0.05，P < 0.01），而與D組相比較，E組培養液LDH含量明顯上升（P < 0.05）。結果見圖2。

2.3 Exendin-4對H/R損傷乳鼠心肌細胞SOD活性的影響

與A組相比，B組心肌細胞中SOD活性降低2.3倍（P < 0.01）；與B組相比較，經缺氧預處理或Exendin-4干預后乳鼠心肌細胞中SOD活性顯著升高（P < 0.05，P < 0.01），而與D組相比較，E組SOD活性降低（P < 0.05），結果見圖3。

2.4 Exendin-4對H/R損傷乳鼠心肌細胞MDA含量的影響

B組心肌細胞中MDA含量較A組明顯升高，差異具有統計學意義（P < 0.01）；與B組相比較，經缺氧預處理或Exendin-4干預后乳鼠心肌細胞中MDA含量明顯降低（P < 0.05），而與D組相比較，E組MDA含量明顯升高（P < 0.05），結果見圖4。

3 討論

心肌缺血再灌注損傷是指在短時間內心肌血供中斷而后恢復血液再灌注，心肌細胞H/R是其主要的病理基礎[8]。但再灌注往往會加重心肌細胞的損傷。BoseAK[10]的研究表明，GLP-1受體激動劑能顯著減輕心肌缺血再灌注損傷，有效改善心功能，其研究首次闡明了GLP-1在大鼠離體心臟中對抗心肌梗死的作用，提出GLP-1可能通過激活多種激酶發揮抗氧化作用，從而保護心肌細胞[11-12]。劉艷霞等[13-14]研究發現，心肌細胞復氧后大量的自由基生成而誘發氧化應激損傷在心肌細胞H/R損傷過程中發揮著重要作用。因此，在恢復血流再灌注的同時，減輕細胞氧化應激程度，將有效提升心肌梗死的治療效果。

在心肌細胞缺血再灌注損傷發病過程中發揮著重要作用的是氧自由基大量生成，進而誘發氧化應激損傷[15]。在本實驗中發現乳鼠心肌細胞H/R后LDH活性升高、SOD活性下降、MDA含量升高，表明乳鼠心肌細胞的損傷伴隨著氧化應激。LDH作為糖酵解中重要的酶，可促進心肌細胞在缺氧狀態下催化丙酮酸生成乳酸。當心肌細胞膜受損傷后，細胞中的心肌酶迅速釋放，故LDH的含量水平可反映心肌細胞受損程度。SOD是一種重要的抗氧化酶，對細胞缺氧損傷時的氧化與抗氧化平衡起重要作用。其通過清除氧自由基保護細胞，故其活性高低可間接反映機體清除氧自由基的能力[16-17]。在心肌細胞缺氧損傷過程中，堆積的氧自由基可引起細胞膜損傷，發生脂質過氧化而生成丙二醛（MDA），故細胞培養液中MDA的含量高低又能間接反映心肌細胞氧化應激損傷程度[18]。本實驗結果發現，GLP-1激動劑組能顯著降低H/R損傷乳鼠心肌細胞培養液中LDH含量，并提高乳鼠心肌細胞中SOD活性，降低MDA含量，從而減輕心肌細胞H/R損傷。說明Exendin-4對缺氧心肌細胞具有保護作用，并且其效果明顯優于缺氧預處理組，而GLP-1受體拮抗劑Exendin（9-39）取消了其對心肌H/R損傷的保護作用。在以往的大鼠心肌缺血再灌注在體模型中也得到證實[19-20]，與本研究報道基本一致。

從實驗到臨床，科研工作者已經對GLP-1對抗心肌缺血再灌注損傷的作用做了大量研究。通過本研究證實Exendin-4可能通過保護細胞膜完整性，減輕脂質過氧化損傷，從而降低心肌細胞凋亡率。綜上所述，本研究進一步證實了GLP-1R激動劑對心肌細胞缺氧損傷的保護作用，為心肌梗死提供了治療靶點和潛在的治療方法，也為GLP-1及其類似物的心血管保護作用提供理論依據。

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（收稿日期：2016-11-30 本文編輯：占匯娟）