miRNA-29b在顱內(nèi)動(dòng)脈瘤組織中的表達(dá)變化及意義

彭浩，趙建農(nóng)，陳健龍，王鵬程，張茂

(海南省人民醫(yī)院，海口570311)

miRNA-29b在顱內(nèi)動(dòng)脈瘤組織中的表達(dá)變化及意義

彭浩，趙建農(nóng)，陳健龍，王鵬程，張茂

(海南省人民醫(yī)院，海口570311)

目的 觀察微小RNA-29b(miRNA-29b)在顱內(nèi)動(dòng)脈瘤組織中的表達(dá)變化，并探討其意義。方法 取20例顱內(nèi)動(dòng)脈瘤患者顱內(nèi)動(dòng)脈瘤組織、腦腫瘤患者正常腦動(dòng)脈作為標(biāo)本；制備大鼠顱內(nèi)動(dòng)脈瘤模型，取其顱內(nèi)動(dòng)脈瘤組織及正常腦動(dòng)脈作為標(biāo)本。用qRT-PCR技術(shù)檢測以上標(biāo)本中miRNA-29b表達(dá)。將培養(yǎng)好的人主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組和對照組，按照Lipofectamine 2000將miRNA-29b mimics、miRNA mimics NC分別轉(zhuǎn)染入實(shí)驗(yàn)組、對照組，轉(zhuǎn)染24 h取實(shí)驗(yàn)組部分細(xì)胞經(jīng)20 mg/L ox-LDL干預(yù)24 h。用qRT-PCR技術(shù)檢測細(xì)胞內(nèi)miRNA-29b、自噬基因(Beclin1) mRNA表達(dá)；用Western blotting法檢測細(xì)胞內(nèi)Beclin1、微管相關(guān)蛋白(LC3Ⅱ/Ⅰ)蛋白表達(dá)；用雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)檢驗(yàn)Beclin1是否為miRNA-29b的靶基因;用MTT法檢測細(xì)胞增殖率。結(jié)果 人與大鼠顱內(nèi)動(dòng)脈瘤組織中miRNA-29b相對表達(dá)量均低于正常腦動(dòng)脈組織(P均<0.05)。經(jīng)ox-LDL刺激的人平滑肌細(xì)胞內(nèi)miRNA-29b相對表達(dá)量低于未經(jīng)ox-LDL刺激的細(xì)胞(P<0.05)。轉(zhuǎn)染48 h，實(shí)驗(yàn)組Beclin1 mRNA及蛋白相對表量低于對照組，LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白相對表達(dá)量高于對照組(P均<0.05)。熒光素酶實(shí)驗(yàn)證實(shí)miRNA-29b可與Beclin1 mRNA 的3′-UTR結(jié)合，Beclin1是miRNA-29b的靶基因。轉(zhuǎn)染48 h，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞增殖率低于對照組(P<0.05)。結(jié)論 miRNA-29b在顱內(nèi)動(dòng)脈瘤組織中表達(dá)下調(diào)，其可能通過介導(dǎo)靶基因Beclin1調(diào)控平滑肌細(xì)胞的自噬，從而參與顱內(nèi)動(dòng)脈瘤的發(fā)生。

顱內(nèi)動(dòng)脈瘤；微小RNA-29b；平滑肌細(xì)胞；自噬基因；細(xì)胞自噬

顱內(nèi)動(dòng)脈瘤是指腦動(dòng)脈內(nèi)腔異常擴(kuò)大，甚至出現(xiàn)動(dòng)脈壁異常膨出的現(xiàn)象。顱內(nèi)動(dòng)脈瘤破裂可引起顱內(nèi)大量出血及蛛網(wǎng)膜下腔出血[1]。顱內(nèi)動(dòng)脈瘤起病隱匿，在其破裂發(fā)病前較難發(fā)現(xiàn)；動(dòng)脈瘤破裂后，患者預(yù)后極差，多數(shù)死亡[2]。因此，研究顱內(nèi)動(dòng)脈瘤的發(fā)病機(jī)制極其重要。有研究表明，其發(fā)病機(jī)制包括細(xì)胞外基質(zhì)結(jié)構(gòu)改變、補(bǔ)體激活的炎癥浸潤等[3]。近來有多項(xiàng)關(guān)于微小RNA(miRNA)的研究，miRNA能夠在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控其靶基因[4]，在多種心血管疾病發(fā)病中發(fā)揮重要作用。研究證實(shí)，腹主動(dòng)脈瘤患者存在miRNA表達(dá)譜異常[5～9]。miRNA-29參與調(diào)節(jié)膠原蛋白、彈力蛋白及纖維蛋白的表達(dá)，保護(hù)主動(dòng)脈血管壁結(jié)構(gòu)的完整性，在心肌纖維化過程中也發(fā)揮重要作用[10～12]，但miRNA-29b是否參與顱內(nèi)動(dòng)脈瘤發(fā)生發(fā)展過程尚未見相關(guān)報(bào)道。2014年9月～2015年8月，本研究對以上觀點(diǎn)進(jìn)行了探討。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來源

1.1.1 人動(dòng)脈瘤組織標(biāo)本及正常動(dòng)脈標(biāo)本 收集本院同期收治行開顱夾閉術(shù)的顱內(nèi)動(dòng)脈瘤患者20例，經(jīng)影像學(xué)檢查確診；男13例、女7例，年齡(42.27±5.21)歲；取其顱內(nèi)動(dòng)脈瘤組織做標(biāo)本。同期選擇接受開顱手術(shù)治療的腦腫瘤患者20例，男15例、女5例，年齡(43.56±3.87)歲；取其正常顳淺動(dòng)脈(STA)和(或)腦膜中動(dòng)脈(MMA)做標(biāo)本。患者入選標(biāo)準(zhǔn)：顱內(nèi)惡性腫瘤為原發(fā)病灶，未累及STA和(或)MMA；排除嚴(yán)重肝腎功能損害、心血管疾病、血液病、顱外惡性腫瘤等。顱內(nèi)動(dòng)脈瘤患者、腦腫瘤患者性別、年齡比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。

1.1.2 大鼠動(dòng)脈瘤組織標(biāo)本及正常腦動(dòng)脈標(biāo)本 SPF級SD雄性大鼠40只，體質(zhì)量200～250 g，購自廣東醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。隨機(jī)選取20只大鼠用豬胰彈性蛋白酶滴加到頸外動(dòng)脈及分叉處動(dòng)脈壁周圍，在頸外動(dòng)脈距分叉處約1.5 mm，用兩根手術(shù)線結(jié)扎頸外動(dòng)脈，于兩根線之間剪斷頸外動(dòng)脈，使頸外動(dòng)脈的盲段形成1個(gè)頸內(nèi)動(dòng)脈瘤。術(shù)后1周給予1%鹽水飼養(yǎng)。1個(gè)月后行腦血管造影，觀察動(dòng)脈瘤形成情況。另外20只大鼠常規(guī)飼養(yǎng)未做處理。術(shù)后2個(gè)月，股靜脈放血處死大鼠，分別從大鼠頸總動(dòng)脈分叉部取顱內(nèi)動(dòng)脈瘤組織標(biāo)本及正常動(dòng)脈標(biāo)本。

1.2 主要試劑與儀器 人主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞株(美國ATCC公司)；RNA提取試劑(北京博奧森生物技術(shù)有限公司)，miRNA Reverse Transcription 試劑盒、SYBR Green mix kit(德國凱杰Qiagen公司)，PCR擴(kuò)增引物[生工生物工程(上海)股份有限公司]，miRNA-29b(廣州市銳博生物科技有限公司)，微管相關(guān)蛋白(LC3Ⅱ/Ⅰ)多克隆抗體(CST)，自噬基因(Beclin1)抗體(Abcam艾美捷科技有限公司)；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清(GE Healthcare Life Sciences)；蛋白提取試劑盒、BCA定量試劑盒、AnnexinV/PI凋亡檢測試劑盒(碧云天生物技術(shù)研究所)；NanoDrop-2000c紫外分光光度計(jì)(Thermo Scientific，美國)，擴(kuò)增PCR儀、熒光定量PCR儀(BIO-RAD，美國)等。

1.3 人主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染 在超凈臺中將液氮保存的人主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞懸液吹打混勻后在室溫離心機(jī)中800 r/min離心5 min，棄上清液，往下層細(xì)胞沉淀中加入含10% FBS DMEM高糖培養(yǎng)基5 mL輕輕吹打混勻，轉(zhuǎn)入25 cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，在37 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞生長融合程度為30%時(shí)，進(jìn)行轉(zhuǎn)染。將細(xì)胞隨機(jī)分為兩組，按照Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑說明書將miRNA-29b mimics(模擬內(nèi)源miRNA-29b)、miRNA mimics NC(陰性對照)分別轉(zhuǎn)染入實(shí)驗(yàn)組、對照組。轉(zhuǎn)染后于含10% FBS DMEM高糖培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)。

1.4 顱內(nèi)動(dòng)脈瘤組織、正常腦動(dòng)脈與人主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞中miRNA-29b表達(dá)檢測 采用qRT-PCR技術(shù)。取人與大鼠的顱內(nèi)動(dòng)脈瘤組織與正常腦動(dòng)脈組織標(biāo)本，每100 mg組織加入1 mL TRIzol試劑，加入氯仿0. 2 mL，劇烈振蕩15 s，冰上靜置3～5 min。4 ℃ 12 000 r/min離心15 min。吸取上層透明液體放入新的Eppendorf管，加入與上層透明液體等體積的異丙醇，上下顛倒2 min混勻后放置于冰上10 min。再次于4 ℃ 12 000 r/min離心10 min。棄上清液保留沉淀，加入4 ℃預(yù)冷的75%乙醇1 mL，12 000 r/min離心5 min。吸棄上清液后室溫干燥3 min。加入4 ℃ DEPC水充分混合溶解。取實(shí)驗(yàn)組部分細(xì)胞經(jīng)20 mg/L ox-LDL干預(yù)24 h，用胰酶消化后離心加入TRIzol試劑，其后步驟與組織樣本RNA提取相同。按照SYBR Green PCR試劑盒說明書，以逆轉(zhuǎn)錄合成的cDNA作為模版在qRT-PCR儀上進(jìn)行反應(yīng)。PCR反應(yīng)體系：模版cDNA 0.2 μL，miRNA-29b特異性引物0.6 μL，2× QuantiTect SYBR Green PCR Mix 5 μL，miRNA-29b上游引物為5′-CTGACGGAGTTCCTCCAGTTC-3′，下游引物為5′-GAGGTTCCCCGAGAAGACGAT-3′；U6作為內(nèi)參，其上游引物為5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，下游引物為5′-ACGCTTCACGAATTTGCGT-3′，加DEPC水至反應(yīng)總體積為10 μL。反應(yīng)條件：95 ℃ 5 min，隨后95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，共40個(gè)循環(huán)。經(jīng)qRT-PCR擴(kuò)增得到各目的基因循環(huán)閾值(Ct)，以2-ΔΔCT法計(jì)算miRNA-29b的相對表達(dá)量。

1.5 人主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞中Beclin1相對表達(dá)量檢測 用qRT-PCR技術(shù)。轉(zhuǎn)染24 h，收集實(shí)驗(yàn)組、對照組細(xì)胞，檢測步驟同1.4。Beclin1上游引物為5′-AGGAGCAGTGGACAAAGG-3′，下游引物為5′-AGGGAAGAGGGAAAGGAC-3′；β-actin為內(nèi)參，上游引物為5′-GACAGGATGCAGAAGGAGATTACT-3′，下游引物為5′-TGATCCACATCTGCTGGAAGGT-3′。

1.6 人主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞Beclin1、LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白表達(dá)檢測 采用Western blotting法。提取轉(zhuǎn)染48 h實(shí)驗(yàn)組、對照組總蛋白，用BCA蛋白定量試劑盒定量，根據(jù)蛋白濃度按比例加入5×SDS上樣緩沖液，在加熱器中于100 ℃加熱10 min使蛋白變性。制備SDS聚丙烯酰胺凝膠，每孔蛋白上樣量為30 μg，常規(guī)電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉，加入Beclin1抗體(1∶1 000稀釋)、LC3Ⅱ/Ⅰ抗體(1∶1 000稀釋)，4 ℃孵育過夜。取出條帶TBST洗滌3次，每次10 min，孵育兔二抗(1∶5 000稀釋)，室溫孵育2 h后使用TBST洗滌3次，ECL發(fā)光液浸泡條帶后使用BIO-RAD顯影儀顯影。使用ImageJ測定各蛋白灰度值，計(jì)算目的條帶與內(nèi)參條帶灰度比值作為目的蛋白相對表達(dá)量。

1.7 miRNA-29b的靶基因檢測 采用雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)。培養(yǎng)人平滑肌細(xì)胞，按合適的細(xì)胞數(shù)鋪6孔板，當(dāng)細(xì)胞長至30%～50%時(shí)，將miRNA-29b mimics與Beclin1基因重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞。轉(zhuǎn)染6 h將轉(zhuǎn)染時(shí)所用不含血清的培養(yǎng)基更換為完全培養(yǎng)基，48 h后使用胰酶消化法收集細(xì)胞，按照Dual-Luciferase Reporter Assay System(Promega) 試劑盒說明書分別檢測螢火蟲熒光素酶及海腎熒光素酶，驗(yàn)證靶基因是否正確。Beclin1 3′-UTR(WT)熒光素酶相對活性降低而Beclin1 3′-UTR(MUT)熒光素酶相對活性正常時(shí)，表明Beclin1是miRNA-29b的靶基因。

1.8 人動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞增殖率檢測 采用MTT法。轉(zhuǎn)染48 h收集實(shí)驗(yàn)組、對照組細(xì)胞，置于96孔板內(nèi)(7 000/孔)。用MTT細(xì)胞活性檢測試劑盒進(jìn)行檢測，用酶標(biāo)儀測490 nm波長處吸光度值。細(xì)胞增殖率=實(shí)驗(yàn)組吸光度值/陰性對照組吸光度值×100%，以上實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2 結(jié)果

2.1 人與大鼠顱內(nèi)動(dòng)脈瘤組織、人平滑肌細(xì)胞內(nèi)miRNA-29b的表達(dá) 人顱內(nèi)動(dòng)脈瘤組織、人正常腦動(dòng)脈組織內(nèi)miRNA-29b相對表達(dá)量分別為0.47±0.09、1.22±0.46，二者比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。大鼠顱內(nèi)動(dòng)脈瘤組織、大鼠正常腦動(dòng)脈組織內(nèi)miRNA-29b相對表達(dá)量分別為0.27±0.04、0.95±0.12，二者比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。轉(zhuǎn)染24 h，未經(jīng)ox-LDL刺激與經(jīng)ox-LDL刺激的人平滑肌細(xì)胞內(nèi)miRNA-29b相對表達(dá)量分別為0.93±0.13、0.47±0.08，二者比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.2 miRNA-29b對人平滑肌細(xì)胞內(nèi)Beclin1、LC3Ⅱ/Ⅰ表達(dá)的影響 轉(zhuǎn)染48 h，實(shí)驗(yàn)組與對照組Beclin1 mRNA相對表達(dá)量分別為0.56±0.05、0.92±0.07，Beclin1蛋白相對表達(dá)量分別為0.45±0.11、0.17±0.15，LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白相對表達(dá)量分別為0.92±0.22、0.30±0.23；兩組Beclin1、LC3Ⅱ/Ⅰ表達(dá)比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)。

2.3 熒光素酶實(shí)驗(yàn)結(jié)果 靶基因Beclin1熒光素酶實(shí)驗(yàn)證實(shí)miRNA-29b可與Beclin1 mRNA 的3′-UTR結(jié)合，當(dāng)該結(jié)合部位發(fā)生突變后，結(jié)合能力消失。

2.4 miRNA-29b對人平滑肌細(xì)胞增殖率的影響 轉(zhuǎn)染48 h，實(shí)驗(yàn)組與對照組細(xì)胞增殖率分別為0.36%±0.11%、0.69%±0.13%，兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

3 討論

顱內(nèi)動(dòng)脈瘤是腦血管疾病三大病因之一，可引起自發(fā)性蛛網(wǎng)膜下腔出血，其病死率和致殘率較高。近年來隨著影像技術(shù)發(fā)展及手術(shù)水平的提高，顱內(nèi)動(dòng)脈瘤破裂導(dǎo)致的自發(fā)性蛛網(wǎng)膜下腔出血能得到及時(shí)診治，但病死率仍無明顯改觀[13]。因此對其發(fā)生發(fā)展及破裂的預(yù)防成為目前研究熱點(diǎn)。顱內(nèi)動(dòng)脈瘤的發(fā)生是多種因素共同作用的結(jié)果，動(dòng)脈粥樣硬化在其中起重要促進(jìn)作用[14]。ox-LDL的異常增加，對血管內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞等產(chǎn)生持續(xù)刺激，是動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展的主要危險(xiǎn)因素。越來越多的證據(jù)表明，血管壁中的內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等持續(xù)培養(yǎng)于高濃度ox-LDL的環(huán)境下，會(huì)出現(xiàn)細(xì)胞自噬、凋亡增加、增殖減少，但其具體機(jī)制尚未完全闡明。自噬是繼細(xì)胞壞死、凋亡之后新發(fā)現(xiàn)的一種程序性細(xì)胞死亡，是細(xì)胞器和大分子蛋白降解的主要途徑，進(jìn)而維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)。近年來研究發(fā)現(xiàn)，自噬調(diào)控失調(diào)與多種疾病的發(fā)生發(fā)展有關(guān)，如自身免疫病、腫瘤、衰老、心腦血管等慢性疾病及神經(jīng)系統(tǒng)相關(guān)疾病[15]。研究提示，顱腦動(dòng)脈瘤的發(fā)生發(fā)展與血管平滑肌細(xì)胞的自噬密切相關(guān)[16]。

miRNA是一類小分子非編碼調(diào)節(jié)性RNA，含有22～25個(gè)核苷酸，這類RNA分子可與靶向基因的3′-UTR端特異性結(jié)合，并通過完全配對導(dǎo)致mRNA的降解或通過不完全配對抑制翻譯，從而參與細(xì)胞增殖、分化、凋亡等過程，影響疾病的發(fā)生發(fā)展[4]。近年來，越來越多的證據(jù)表明，miRNA通過調(diào)控血管內(nèi)皮細(xì)胞、血管平滑肌細(xì)胞、血管細(xì)胞外基質(zhì)等的功能，從而參與動(dòng)脈粥樣硬化和血管重構(gòu)，在動(dòng)脈瘤的發(fā)生發(fā)展中也起重要的作用。miRNA-29家族包括miRNA-29a、miRNA-29b、miRNA-29c三個(gè)成員。既往研究發(fā)現(xiàn)，在胸主動(dòng)脈瘤中，僅miRNA-29b的表達(dá)較正常人升高，而miRNA-29a和miRNA-29c無明顯改變；但另外一項(xiàng)隊(duì)列研究發(fā)現(xiàn)，腹主動(dòng)脈瘤患者的miRNA-29b表達(dá)下調(diào)[17～19]。上述結(jié)果提示miRNA-29b可能在不同動(dòng)脈瘤類型中表達(dá)水平不同，進(jìn)而發(fā)揮不同的作用。此外，多項(xiàng)研究證實(shí)，miRNA-29b在細(xì)胞外基質(zhì)的降解中發(fā)揮重要作用，并在年齡相關(guān)的動(dòng)脈瘤形成中發(fā)揮一定促進(jìn)作用。在小鼠體內(nèi)，抑制miRNA-29b可以減緩腹主動(dòng)脈瘤的進(jìn)展[20]。但是其在動(dòng)脈粥樣硬化相關(guān)的顱腦動(dòng)脈瘤中表達(dá)如何及是否發(fā)揮作用尚未見報(bào)道。本研究通過對比顱腦動(dòng)脈瘤及正常人動(dòng)脈組織中miRNA-29b表達(dá)，發(fā)現(xiàn)其在動(dòng)脈瘤患者動(dòng)脈組織中表達(dá)顯著下調(diào)，在apoe-/-動(dòng)脈粥樣硬化模型小鼠動(dòng)脈組織中也得到相同的結(jié)論，提示miRNA-29b可能參與顱腦動(dòng)脈瘤的發(fā)生發(fā)展。但其在顱腦動(dòng)脈瘤發(fā)生發(fā)展中如何發(fā)揮調(diào)控作用，目前尚不清楚。本研究通過對比ox-LDL處理及未處理的平滑肌細(xì)胞中miRNA-29b的表達(dá)發(fā)現(xiàn)，ox-LDL刺激細(xì)胞后，miRNA-29b表達(dá)降低，提示miRNA-29b可能通過影響平滑肌細(xì)胞的功能從而參與顱腦動(dòng)脈瘤的發(fā)生發(fā)展。

在顱腦動(dòng)脈瘤發(fā)生發(fā)展中，平滑肌細(xì)胞的自噬可影響動(dòng)脈瘤的進(jìn)展[16]。本研究發(fā)現(xiàn)，miRNA-29b在ox-LDL干預(yù)的平滑肌細(xì)胞中表達(dá)降低，增加miRNA-29b表達(dá)可抑制平滑肌細(xì)胞增殖，并伴隨細(xì)胞自噬標(biāo)志性蛋白LC3Ⅱ/Ⅰ的表達(dá)降低，提示miRNA-29b可能通過影響平滑肌細(xì)胞自噬從而參與顱腦動(dòng)脈瘤的進(jìn)程。為進(jìn)一步觀察miRNA-29b的表達(dá)導(dǎo)致平滑肌細(xì)胞自噬的靶基因，我們通過預(yù)測軟件及數(shù)據(jù)庫搜索等進(jìn)行了miRNA-29b靶基因的預(yù)測，發(fā)現(xiàn)Beclin1可能是其靶基因之一。體外實(shí)驗(yàn)也證實(shí)，過表達(dá)miRNA-29b后，可顯著下調(diào)Beclin1的mRNA及蛋白水平。上述結(jié)果提示，miRNA-29b可能通過介導(dǎo)Beclin1的表達(dá)從而調(diào)控平滑肌細(xì)胞的自噬進(jìn)而參與顱腦動(dòng)脈瘤的發(fā)生發(fā)展過程。

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海南省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(20158354)。

趙建農(nóng)(E-mail: zjn@vip.163.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.05.009

R732.21

A

1002-266X(2017)05-0029-03

2016-11-04)