非諾貝特對人BMEC與小鼠腦微血管組織SOD3表達的影響及機制

杜小珊，楊錫彤，徐弘揚，程建杰，王光明

(大理大學第一附屬醫院，云南大理671000)

非諾貝特對人BMEC與小鼠腦微血管組織SOD3表達的影響及機制

杜小珊，楊錫彤，徐弘揚，程建杰，王光明

(大理大學第一附屬醫院，云南大理671000)

目的 探討過氧化物酶體增殖物激活受體α亞型(PPARα)激動劑非諾貝特對人腦微血管內皮細胞(BMEC)與小鼠腦微血管組織細胞外銅/鋅超氧化物歧化酶(SOD3)表達的調節作用及其機制。方法 將培養好的BMEC隨機分為兩部分，分別加入終濃度為10 μg/mL非諾貝特、同等體積的DMSO處理12 h；將15只小鼠隨機分為兩部分，分別給予30 mg/kg非諾貝特、10%的羧甲基纖維素混懸液10 mL/kg連續灌胃7 d，處死小鼠取腦組織，提取腦微血管；用RT-PCR技術檢測BMEC與腦微血管組織內過氧化物酶體增殖物激活受體α亞型(PPARα)、SOD3的mRNA表達。構建含SOD3啟動子熒光素酶報告質粒pGL4 mSOD3，用突變試劑盒定點獲得過氧化物酶體增殖物反應元件(PPRE)序列突變的熒光素酶報告質粒pGL4 mu mSOD3，將pGL4 mSOD3、pGL4 mu mSOD3轉染BMEC 24 h，取部分細胞用終濃度10 μg/mL的非諾貝特處理12 h，檢測細胞熒光素酶活性。結果 經非諾貝特處理后，BMEC及小鼠腦微血管組織中PPARα、SOD3 mRNA表達均升高(P均<0.05)。轉染pGL4 mSOD3 24 h，經非諾貝特處理后BMEC內pGL4 mSOD3的熒光素酶活性增強(P<0.05)；轉染pGL4 mu mSOD3 24 h，經非諾貝特處理的BMEC熒光素酶活性變化不明顯(P>0.05)。結論 非諾貝特通過激活PPARα從而調節人BMEC與腦微血管組織中SOD3的表達。

非諾貝特；細胞外銅/鋅超氧化物歧化酶；腦微血管；腦微血管內皮細胞

超氧化物歧化酶(SOD)在機體中能消除新陳代謝過程中產生的有害物質，其有三種亞型：胞質內的SOD1、線粒體內SOD2及細胞外銅/鋅超氧化物歧化酶(SOD3)[1]。SOD的耗竭或內源性抗氧化系統的破壞是缺氧導致組織損傷的機制[2，3]。缺血會導致腦組織中SOD表達下降。過氧化物酶體增殖物激活受體α亞型(PPARα)激動劑非諾貝特可誘導腦組織微血管及腎小管中SOD表達升高，從而發揮神經保護作用及腎臟保護作用[4，5]，但其具體作用機制尚不清楚。2013年2月～2016年4月，本研究在細胞水平與動物水平探討非諾貝特對SOD3表達的影響；利用含基因SOD3啟動子序列或過氧化物酶體增殖物反應元件(PPRE)序列突變啟動子構建的熒光素酶報告質粒分析非諾貝特調節SOD3表達的相關機制。

1 材料與方法

1.1 動物及試劑 C57BL/6小鼠15只，6～8周齡，體質量22～25 g，購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司。非諾貝特、二甲基亞砜(DMSO)、羧甲基纖維素(CMC，Sigma公司)，Lipofectamine2000、TRIzol、cDNA合成試劑盒、定點突變試劑盒(Invitrogen公司)，RT-PCR試劑盒(Bio-Rad公司)；熒光素酶報告質粒pGL4.10、pGL4.74(Promega公司)；人腦微血管內皮細胞(BMEC)、引物(北京鈞堯偉業生物科技有限公司)。

1.2 BMEC培養及處理 BMEC用含10% FBS、100 U/mL的青霉素和鏈霉素的F12培養基，置于37 ℃、5% CO2的培養箱中進行培養，長滿培養皿底部的90%左右用0.25%的胰蛋白酶進行消化傳代，傳5～6代用于實驗，細胞傳代并長滿培養皿底部的70%～80%，換新鮮的F12培養基過夜，繼續培養12 h。將細胞隨機分為兩部分，分別加入終濃度為10 μg/mL的非諾貝特、同等體積的DMSO處理12 h，收集細胞。

1.3 小鼠腦微血管分離 15只小鼠在大理大學動物中心飼養1周，隨機取8只給予30 mg/kg非諾貝特、另外7只給予10%的CMC混懸液10 mL/kg灌胃，均連續灌胃7 d。末次給藥30 min后斷頸處死小鼠，取腦組織，分離小鼠腦微血管，取新鮮腦組織去除腦膜，放入PBS 3 mL，于離心管中勻漿，4 ℃、2 000 g離心5 min，棄上清液，沉淀物用PBS混懸3 mL，在混懸液上方加入15%右旋糖苷(用pH值為7.4的PBS配制)5 mL，4 ℃、3 500 g離心35 min，沉淀物用冷PBS混懸，用孔徑為40 μm的尼龍膜過濾，收集尼龍膜上方的成分，即為腦微血管。

1.4 BMEC與小鼠腦微血管組織內PPARα、SOD3的mRNA表達檢測 采用RT-PCR技術。取收集的BMEC和小鼠腦微血管，按照RNA提取試劑盒和cDNA合成試劑盒說明書提取tRNA、合成cDNA，用iQ SYBR Green試劑盒進行檢測。反應體系50 μL，其中cDNA 2 μL、SYBR Green混合物25 μL、引物各0.5 μL、DEPC處理的水22 μL。反應條件：95 ℃預變性10 min，之后95 ℃ 10 s，55 ℃ 10 s，72 ℃ 10 s，35個循環。PPARα基因上游引物為5′-gcagctcgtacaggtcatca-3′、下游引物為5′-ctcttcatccccaagcgtag-3′，產物202 bp；SOD3基因上游引物5′-ctgggtgcagctctcttttc-3′、下游引物5′-acatgtctcggatccactcc-3′，產物184 bp；GAPDH基因上游引物5′-aactttggcattgtggaagg-3′、下游引物5′-acacattgggggtaggaaca-3′，產物223 bp；目的基因相對表達量計算用2-ΔΔCt法。

1.5 含SOD3啟動子熒光素酶報告質粒的構建 調取網上數據庫(http://genome.ucsc.edu/index.html)小鼠SOD3基因的啟動子序列，設計引物如下，SOD3啟動子克隆上游引物5′-caccagcttttcatctagga-3′，下游引物5′-taatgtccttatgaaaaccag-3′，產物1 419 bp；用小鼠的基因組DNA為模板進行PCR擴增，PCR產物插入pGL4.10 Luciferase Reporter Vectors中，得到含SOD3啟動子序列的熒光素酶報告質粒pGL4 mSOD3。

1.6 含SOD3啟動子PPRE結合序列的定點突變 在SOD3基因啟動子序列的-511～-488堿基序列中，有PPAR的結合位點；序列為：5′-ggtgtggtagggggcAGGTaccca-3′，根據突變試劑盒說明書，設計引物SOD3啟動子突變上游引物5′-ggtgtggtagggggcCTTAaccca-3′，下游引物5′-gtggtgtggtagggggcGAATacccaataaccat-3′，利用突變試劑盒，把AGGT突變為CTTA，插入pGL4 Luciferase Reporter Vectors中，得到PPRE序列突變的熒光素酶報告質粒pGL4 mu mSOD3。

1.7 BMEC中熒光素酶活性檢測 采用熒光素酶活性檢測法。將培養好的BMEC隨機分為兩部分，將熒光素酶報告質粒pGL4 mSOD3、pGL4 mu mSOD3分別與pGL4.74共轉染細胞，嚴格按照Lipofectamine2000說明書進行操作。轉染24 h，各取pGL4 mSOD3、pGL4 mu mSOD3轉染的部分細胞用終濃度10 μg/mL的非諾貝特處理12 h，收集細胞檢測熒光素酶活性，獲得相應光密度值(OD值)。用pGL4 mSOD3或pGL4 mu mSOD3的OD值/pGL4.74的OD值作為啟動子熒光素酶活性相對值。

2 結果

2.1 非諾貝特對BMEC、小鼠腦微血管組織PPARα mRNA表達的影響 經非諾貝特、DMSO處理的BMEC，其PPARα mRNA相對表達量分別為3.36±0.45、1.00±0.09；經非諾貝特、CMC處理的小鼠，其腦微血管組織PPARα mRNA相對表達量分別為2.10±0.67、1.00±0.10。非諾貝特處理后，BMEC細胞及小鼠腦微血管組織中PPARα mRNA表達均升高(P均<0.05)。

2.2 非諾貝特對BMEC、小鼠腦微血管組織SOD3 mRNA表達的影響 經非諾貝特、DMSO處理的BMEC，其SOD3 mRNA相對表達量分別為5.37±0.44、1.00±0.08；經非諾貝特、CMC處理的小鼠，其腦微血管組織SOD3 mRNA相對表達量分別為6.89±0.21、1.00±0.03。非諾貝特處理后，BMEC及小鼠腦微血管組織中SOD3 mRNA表達均升高(P均<0.05)。

2.3 非諾貝特對BMEC中熒光素酶活性的影響 轉染pGL4 mSOD3 24 h，經非諾貝特處理、未經處理的BMEC熒光素酶活性相對值分別為4.58±0.13、1.00±0.03，經非諾貝特處理后細胞內pGL4 mSOD3的熒光素酶活性增強(P<0.05)；轉染pGL4 mu mSOD3 24 h，經非諾貝特處理、未經處理的BMEC熒光素酶活性相對值分別為1.38±0.57、1.00±0.10，經非諾貝特處理后細胞內pGL4 mu mSOD3的熒光素酶活性變化不明顯(P>0.05)。

3 討論

貝特類藥物包括非諾貝特、Clofibrate、Gemfibrozil和人工合成的Wy14634等，是PPARα的配體。研究發現，PPARα的配體非諾貝特、Clofibrate等除臨床降脂作用外，在各種缺氧刺激的動物模型中具有神經保護作用，其機制與貝特類藥物促進SOD的表達等抗氧化作用有關[6～8]。在體內，活性氧(ROS)主要來源于還原型輔酶Ⅱ，而ROS的清除主要依賴于SOD的降解作用[9]。有研究發現，在糖尿病、寄生蟲感染、細菌感染、心血管疾病、吸煙等病理生理狀態下，ROS水平升高[10～14]。Nozik-Grayck等[15]敲除小鼠平滑肌細胞的SOD3后，會加重慢性低氧性肺動脈高壓；用非諾貝特預處理小鼠，缺血再灌注后，小鼠腦組織中的ROS水平降低，其部分機制是SOD3的表達及SOD活性升高，因此非諾貝特可能具有調節SOD表達的功能[4,5]；而在不同原因引起的腎臟損傷中，非諾貝特通過激活PPARα影響SOD的表達和活性以保護受損的腎臟組織[16～18]。在大鼠帕金森綜合征動物模型中，非諾貝特可通過影響SOD、谷胱甘肽等的表達起到神經保護作用[19]。以上研究均說明非諾貝特通過影響SOD的表達以維持體內ROS的動態平衡，從而起保護作用，但具體調節機制仍然不清。

本研究用SOD3基因啟動子序列構建的熒光素酶報告質粒轉染BMEC，之后用非諾貝特刺激被轉染的細胞，可導致其熒光素酶活性升高，表明非諾貝特以某種方式調節BMEC內SOD3的表達；而在細胞水平和動物水平研究發現，非諾貝特處理后，SOD3的表達升高，說明非諾貝特具有調控SOD3表達的能力；進一步研究發現，非諾貝特處理后，BMEC、小鼠腦微血管組織PPARα表達升高，說明非諾貝特調控SOD3的表達有可能通過激活PPARα實現的。為了進一步明確非諾貝特調控SOD3的表達是否依賴于非諾貝特激活PPARα的表達，本研究將SOD3基因啟動子上PPRE結合序列進行突變后構建熒光素酶報告質粒，轉染BMEC，檢測熒光素酶活性，結果發現非諾貝特激活SOD3基因啟動子活性的作用消失，進一步說明非諾貝特的調控作用依賴于激活的PPARα結合到SOD3基因啟動子的PPRE區域以調節SOD3基因表達。SOD3基因表達升高可以促進ROS的降解以保護由于各種原因導致的ROS升高引起的損傷，從而解釋了非諾貝特在研究中對諸如糖尿病引起的腎臟疾病[10,18]、慢性低氧性肺動脈高壓[15]、腦缺血再灌注[4]等各種原因引起損傷的作用機制。

總之，本研究從基因表達調控水平闡明了非諾貝特的保護作用是通過激活PPARα的表達，激活的PPARα與SOD3基因起始密碼子上游的基因啟動子序列上的PPRE結合，以調節SOD3的表達。

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Effect of fenofibrate on SOD3 expression in human BMECs and mouse brain microvascular tissues

DUXiaoshan,YANGXitong,XUHongyang,CHENJianjie,WANGGuangming

(TheFirstAffiliatedHospitalofDaliUniversity,Dali671000,China)

Objective To investigate the regulating effect of fenofibrate, the agonist of peroxisome proliferator-activated receptor α (PPARα), on the superoxide dismutase 3 (SOD3) expression in human brain microvascular endothelial cells (BMECs) and mouse brain microvascular tissues as well as the possible mechanism. Methods The cultured BMECs were randomly divided into two groups, which were seperately treated with 10 μg/ml of fenofibrate and the same volume of DMSO for 12 h. Fifteen mice were divided into two groups, which were treated with 30 mg/kg fenofibrate and 10 mL/kg of 10% CMC by gavage for 7 days. The tRNA was extracted and the brain microvessel was isolated. The mRNA expression levels of PPARα and SOD3 were detected by RT-PCR. We constructed a luciferase reporter plasmid pGL4 mSOD3 containing SOD3 promoter. The luciferase reporter plasmid pGL4 mu mSOD3 mutated from PPRE sequence were obtained by using the mutagenesis kit. The BMECs were transfected with pGL4 mSOD3 and pGL4 mu mSOD3 for 24 h. The cells were treated with fenofibrate at a final concentration of 10 μg/mL for 12 h in order to measure the luciferase activity.Results The mRNA expression of PPARα and SOD3 was increased in the BMECs and brain microvessel after the treatment of fenofibrate (allP<0.05). The luciferase activity of pGL4 mSOD3 in BMECs treated with fenofibrate was enhanced after transfection of pGL4 mSOD3 for 24 h (P<0.05).The luciferase activity of BMECs treated with fenofibrate did not significantly change after transfection of pGL4 mu mSOD3 for 24 h (P>0.05).Conclusion The SOD3 expression in the human BMECs and mouse brain microvascular tissues is regulated by fenofibrate through activating PPARα.

fenofibrate; extracellular Cu/Zn superoxide dismutase; brain microvascular; brain microvascular endothelial cells

國家自然科學基金資助項目(81360206)；云南省中青年學術技術帶頭人后備人才基金項目(2014HB025)。

杜小珊(1990-)，女，在讀碩士，主要研究方向為腦卒中的發病機制。E-mail：912096630@qq.com

王光明(1973-)，男，博士，教授，主要研究方向為腦卒中的發病機制。E-mail：gmwang1991@hotmail.com

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.05.002

R743

A

1002-266X(2017)05-0004-04

2016-11-04)