肝卵圓細胞的起源、標志物、調控和應用前景

王正洋(綜述) 李曉波 殷蓮華(審校)

(復旦大學基礎醫學院生理與病理生理學系 上海 200032)

肝卵圓細胞的起源、標志物、調控和應用前景

王正洋(綜述) 李曉波 殷蓮華△(審校)

(復旦大學基礎醫學院生理與病理生理學系 上海 200032)

肝臟在機體內發揮著重要作用,包括糖和脂質代謝,血漿蛋白的合成和對內外源性毒物的解毒作用等。目前肝臟的慢性疾病是導致人類死亡的重要原因。肝臟依靠肝細胞的自我更新和肝卵圓細胞的增殖分化兩大途徑參與肝損傷的修復。然而,我們對肝卵圓細胞的起源、特異性標志物、信號通路的調控等方面依然尚未完全闡明。最近一些研究通過運用新的分離技術和基因系譜追蹤技術對肝卵圓細胞的起源和生物學功能有新的發現。本文較詳盡地對以上內容進行了綜述。

肝卵圓細胞; 肝損傷; 標志物; 信號通路

哺乳動物的肝組織具有強大的損傷后再生能力,主要通過兩大途徑:其一通過肝細胞的增殖進行肝再生,如急性肝損傷和正常肝臟的部分切除[1];其二當肝細胞增殖受到抑制時,通過膽管反應(ductular reactions)及其伴隨的肝卵圓細胞(oval cells)增殖和分化進行肝再生,如慢性肝損傷和肝腫瘤[2]。肝卵圓細胞又被稱為反應性膽管細胞(reactive ductal cells),是一種具有卵圓形的細胞核、直徑大約10 μm、高核質比增殖能力很強的肝前體細胞[3],可分化為肝膽管上皮細胞和肝細胞,因此被普遍認為是肝臟的干細胞[4]。肝卵圓細胞激活且大量增殖后可向肝實質內遷移,破壞正常肝組織結構,甚至可導致肝硬化的發生[5]。其遷移、動員和歸巢受到多種信號分子的調控,包括多種細胞黏附分子、細胞因子和趨化性分子[6]。深入研究肝卵圓細胞的來源、標志物和調控其增殖與分化的信號通路對肝卵圓細胞的臨床應用非常重要。然而目前學術界對肝卵圓細胞的上述生物學特性仍然尚未完全闡明,這嚴重制約了肝卵圓細胞的應用前景。本文對肝卵圓細胞的起源、標志物、調控和應用前景進行綜述,有助于該細胞的理論研究和未來的臨床應用。

肝卵圓細胞來源 雖然目前對肝卵圓細胞的存在已經形成共識,但對其起源尚存在爭議,以下3種來源方式得到較為廣泛的研究。

來源于骨髓 1999年Petersen等[7]將雄性小鼠的骨髓移植到雌性小鼠體內后,雌性小鼠肝臟中約有0.14%的肝細胞帶有Y染色體。此外,該研究人員還通過免疫磁珠分選中毒性肝損傷過程中大量增殖的肝卵圓細胞,不僅表達肝組織表面標志物如A6、AFP,也可以表達造血系統相關抗原,如CD34、CD45、Sca-1和Thy-1[8]。2007年Piscaglia等[9]的研究證實,粒細胞集落刺激因子(granulocyte-colony stimulating factor,G-CSF)可以通過促進骨髓來源的前體細胞遷移至肝臟從而參與肝組織的修復過程,并且G-CSF能夠促進肝卵圓細胞的激活和增殖。以上研究結果提示,肝卵圓細胞可能來源于骨髓。然而,Wang等[10]發現骨髓來源的細胞主要是通過細胞融合過程參與肝修復過程,而非分化為肝卵圓細胞。Rountree等[11]將綠色熒光蛋白(green fluorescent protein,GFP)標記的骨髓細胞移植入免疫缺陷的小鼠體內,通過免疫熒光、細胞流式和qRT-PCR實驗發現在中毒性肝損傷過程中,骨髓來源的細胞可遷移至肝臟,但并未分化為肝細胞、膽管細胞和肝卵圓細胞,也并未表達肝組織相關的抗原?？梢?雖然骨髓來源的細胞在肝損傷的修復過程中發揮重要作用,但并未通過未分化為肝卵圓細胞發揮作用。

來源于肝星狀細胞 肝星狀細胞(hepatic stellate cells,HSCs)是一種可分泌細胞外基質的肝臟細胞,具有重要的生物學功能。其靜息態時儲存有大量的類維生素A,存在于肝竇內皮細胞(sinusoidal endothelial cells)和肝細胞之間的Disse間隙內,Disse間隙具有干細胞小體(stem cell niches)的特點,激活后可分化為肌成纖維細胞,進而導致肝纖維化的發生[12]。目前有研究發現它具有間充質干細胞(mesenchymal stem cell,MSC)的特征,體外培養過程中某一時段其基因表達譜與肝卵圓細胞相似,可分化為成熟肝細胞[13]。利用Gfap(glial fibrillary acidic protein )和Acta2啟動子構建的原基分布圖(fate-mapping)實驗顯示,激活后的肝星狀細胞可表達肝卵圓細胞相關抗原,而且可進一步分化為肝細胞[14]。Kordes等[13]研究發現,將肝星狀細胞移植到肝損傷的大鼠體內,可以分化為成熟的肝細胞和膽管上皮細胞,進一步研究發現肝星狀細胞通過間質上皮轉化(mesenchymal-to-epithelial transition,MET)過程分化為上皮細胞黏附分子(epithelial cell adhesion molecule,EpCAM)陽性細胞,后者是肝卵圓細胞和膽管細胞的常見表面標志物。Tatematsu等[15]在2-乙酰氨基芴/大部肝切除模型中(常用的抑制肝細胞增殖,且可以促進肝卵圓細胞增殖的肝損傷模型),將雄性小鼠來源的GFP+的肝星狀細胞移植到雌性小鼠體內,結果顯示肝星狀細胞可以分化為肝細胞和膽管細胞。以上結果說明肝星狀細胞可能是肝卵圓細胞的來源。然而,Lua等[16]利用卵磷脂視黃醇?；D移酶(lecithin retinol acyltransferase,LRAT)和MESP1(mesoderm posterior 1 homolog)家系追蹤實驗(lineage-tracing experiments)發現在肝損傷的小鼠肝組織中,肝星狀細胞并不能分化為上皮細胞。因此,關于肝卵圓細胞是否來源于星狀細胞,仍有待進一步闡明。

來源于膽管上皮細胞 Hering小管連接膽小管和膽管,由肝細胞和膽管細胞構成,正常肝臟Hering小管周圍可發現少數孤立的小立方形細胞,肝損傷后其周圍可發生膽管反應,并伴隨肝卵圓細胞的增殖[17]。Furuyama等[18]利用Sry(sex determining region Y)-box9(Sox9)品系追蹤模型,發現具有干細胞性質的Sox9陽性細胞在肝臟往往聚集于膽道周圍,推測Hering小管可能是肝卵圓細胞的重要的起源位置。Rodrigo-Torres等[19]利用三苯氧胺(tamoxifen)誘導的Hnf1βCreER/R26RYfp/LacZ小鼠追蹤Hnf1β+膽管細胞,結果顯示肝卵圓細胞來源于Hnf1β+膽管細胞。在正常的肝組織中,Hnf1β+膽管細胞并不能分化為肝細胞,但在某些肝損傷過程中,Hnf1β+膽管細胞可以分化為肝細胞。Foxl1 (Forkhead box L1),Trop2(encoded by tumor-associated calcium signal transducer 2)和Lgr5(leucine-rich-repeat-containing G-protein-coupled receptor 5)是最近被發現的能相對特異性地表達于肝卵圓細胞表面的標志物,而且Foxl1+和Trop2+細胞也表達EpCAM和CK19(keratin 19)蛋白,培養膽管細胞過程中可以表達Lgr5蛋白[20],這些結果說明至少有一部分的肝卵圓細胞來源于膽管細胞。

肝卵圓細胞的標志物 明確肝卵圓細胞的標志物對其功能研究和臨床應用具有重要意義。然而,在肝疾病過程中,肝卵圓細胞往往處于動態的不同分化階段,包括未分化的前體狀態、增殖狀態和分化終末狀態[21]。這些參與典型膽管反應的肝卵圓細胞呈現顯著的異質性,要精確區分這些細胞群體非常困難,這極大地阻礙了高特異性肝卵圓細胞標志物的尋找。目前的研究認為肝卵圓細胞可表達:(1) 膽管上皮細胞標志物,CK-7、CK-8、CK18、CK19、OV-6、GST π、connexin43和A6;(2)幼稚肝細胞標志物,AFP、GGT、PKM2;(3) 造血干細胞標志物,Thy-1、c-kit、CD34、Sca-1[21-24];(4) 神經上皮細胞標志物,嗜鉻粒蛋白A、神經細胞黏附分子(neural cell adhesion molecule,N-CAM)、甲狀旁腺素相關蛋白[25]。一些相對特異的抗體,如OV6、A6和EpCAM已經被廣泛用于確定分離肝卵圓細胞[26- 27]。肝卵圓細胞標志物有如下特點:(1)不僅表達于肝卵圓細胞,也可表達其他多種細胞類型;(2)幾乎沒有一種表面標志物可以用來高度特異性地分離肝卵圓細胞;(3)肝卵圓細胞處于動態過程中,常常處于不同的細胞形態且表達不同的表面標志物,因此高純度地分離它們有很大困難;(4)肝卵圓細胞的基因組具有物種多態性,不同物種之間差異較大[28]。雖然存在以上諸多困難,但尋找表達相對恒定且特異的肝卵圓細胞標志物仍然具有其必要性,值得進一步深入研究,這會成為開啟肝卵圓細胞為臨床更好服務大門的鑰匙。

肝卵圓細胞增殖與分化的信號通路調控 研究調控肝卵圓細胞的激活、增殖與分化是更好地理解肝卵圓細胞介導的肝損傷修復與再生醫學的重要前提。目前認為,調控肝卵圓細胞的增殖和分化是多種信號分子共同參與的生物學過程。越來越多的證據表明,多種細胞因子和信號通路參與肝卵圓細胞的激活、增殖和分化。Yeol等[29]通過gp130Y757F小鼠和 Socs3-/ΔAlb小鼠研究發現,活化STAT3信號分子或者SOCS3基因的缺失可促進肝卵圓細胞的增殖,而高表達SOCS3則可以抑制肝卵圓細胞的增殖。Sánchez等[30]除了證實激活的STAT3基因主要作用在肝卵圓細胞的增殖階段,還進一步揭示了在肝卵圓細胞的不同發育階段信號分子對肝卵圓細胞的激活作用不同,如NF-κB的作用貫穿于肝卵圓細胞整個增殖分化階段。Martínez-Palacián等[31]通過重組基因和化學信號追蹤技術發現c-Met和表皮生長因子(epidermal growth factor receptor,EGFR)介導的信號通路可促進肝卵圓細胞的增殖和存活。Yang等[32]研究發現:(1) β-catenin及其靶基因高表達于增殖狀態的肝卵圓細胞中;(2)在肝卵圓細胞增殖的過程中Wnt/β-catenin通路持續激活;(3)Wnt/β-catenin通路可以促進移植后的肝卵圓細胞克隆樣生長。以上結果表明Wnt/β-catenin通路在肝卵圓細胞的激活和增殖過程中發揮重要作用。其他一些重要的生長因子,如白介素-6 (interleukin-6,IL-6)、轉化生長因子(transforming growth factor,TGF)、白血病抑制因子(leukemia inhibitory factor,LIF)、干擾素-γ (interferon-γ,IFN-γ)、抑瘤素M (oncostatin M,OSM)、肝細胞生長因子(hepatocyte growth factor,HGF)和酸性成纖維細胞生長因子(acidic fibroblast growth factor,aFGF)等均參與了肝卵圓細胞的增殖分化過程[30-33]。

肝卵圓細胞的臨床應用 目前對于終末期的肝疾病,肝移植是唯一行之有效的方法。但肝移植伴隨著許多副作用,如慢性腎功能衰竭[34]、移植后淋巴增生失調癥[35]和心血管并發癥[36]等。與肝移植相比,肝卵圓細胞移植具有如下優勢:(1)直接來源于患者,無免疫排斥;(2)取少量的肝卵圓細胞即可大量體外擴增,對患者創傷小;(3)具有雙向分化潛能,可分化為成熟肝細胞;(4)細胞小,不易堵塞血管導致門靜脈高壓;(5)多種肝損傷均有肝卵圓細胞增殖,因此可以被用來治療多種肝疾病[37]。然而移植肝卵圓細胞的效率偏低、肝功能的恢復不佳、移植后導致鏈接紊亂(disruption of gap junctions)和缺血性肝損傷(ischemic liver injury)[38]以及肝卵圓細胞的致瘤性[39]依然限制肝卵圓細胞的臨床應用。因此,雖然利用肝卵圓細胞來治療終末期肝疾病的前景光明且優勢明顯,但是在應用于臨床之前還有大量的理論和技術難題需要闡明和改進。

結語 肝卵圓細胞的激活、增殖和分化與機體內環境密切相關,受到一系列信號分子的調控。但其起源、標志物和調控還尚未完全闡明。只有通過更多更深入的研究,肝卵圓細胞這一令人興奮的細胞才能夠更好地應用到臨床及治療終末期肝疾病。

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The origin,marker,regulation and therapeutic potential of hepatic oval cells

WANG Zheng-yang, LI Xiao-bo, YIN Lian-hua△

(DepartmentofPhysiologyandPathophysiology,SchoolofBasicMedicalSciences,FudanUniversity,Shanghai200032,China)

The liver plays an vital role in glucose and lipid metabolism,synthesis of plasma proteins,and detoxification of xenobiotics.Liver chronic disease is one of the leading causes of death in China.Liver mass can be restored by two mechanisms:division of hepatocytes and hepatic oval cells (HOCs) proliferation and differentiation.However,the origin,specific markers and signaling pathways of HOCs have not been fully elucidated.Recent researches in HOCs isolation methods and genetic lineage tracing have enabled investigators to study multiple aspects of HOCs origin and biology.We reviewed the previous researches in detail.

hepatic oval cell; liver injury; marker; signaling pathways

國家自然科學基金(81270497)

Q28,R446.1

B

10.3969/j.issn.1672-8467.2017.02.015

2016-03-08;編輯:張秀峰)

△Corresponding author E-mail:lhyin@shmu.edu.cn

*This work was supported by the National Natural Science Foundation of China (81270497).